一种中性粒细胞胞外诱捕网提取和定量的方法与流程

技术特征：
1.一种中性粒细胞胞外诱捕网提取和定量的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：s1.中性粒细胞的提取：取受试动物骨髓组织碾碎，用pbs冲洗后于600
‑
800
×
g离心5
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7min，1
‑
2ml pbs重悬骨髓细胞，得细胞悬液；向离心管中依次缓慢加入2
‑
4ml 78％percoll、2
‑
4ml 69％percoll、2
‑
4ml 52％percoll和细胞悬液，于1500
‑
1700
×
g室温下梯度密度离心30
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35min；取出78％percoll和69％percoll中间的细胞层，加入pbs冲洗，于600
‑
800
×
g室温离心5
‑
7min后去除上清液；用3
‑
5ml红细胞裂解液重悬细胞，于冰上裂解3
‑
5分钟，吹打细胞悬液3
‑
5次，加入10
‑
12ml pbs停止裂解，于600
‑
800
×
g室温离心5
‑
7min后弃去上清；s2.中性粒细胞的培养：采用含10％fbs的rpmi1640溶液作为培养基重悬细胞，将受试动物中性粒细胞接种于多聚赖氨酸包被的培养皿中进行培养；s3.nets的诱导：采用1
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3μmol/l ionomycin刺激中性粒细胞6
‑
8小时，诱导nets生成；s4.nets的收集：吸除上清后加入含10％fbs的rpmi1640培养基反复冲洗培养皿底5
‑
7次，收集冲洗液；将冲洗液于1000
‑
1200
×
g、4℃离心5
‑
7分钟，弃沉淀取上清即得nets；s5.nets的定量：采用蛋白核酸分析仪对nets中的dna和蛋白进行精确定量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中受试动物骨髓组织碾碎，用pbs冲洗后于600
×
g离心5min。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，向离心管中依次缓慢加入2ml 78％percoll、2ml 69％percoll、2ml 52％percoll和细胞悬液，于1500
×
g室温下梯度密度离心30min。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤s1中，是先将2ml 78％percoll加入离心管底部，再45
°
倾斜离心管，延管壁依次缓慢加入2ml 69％percoll和2ml 52％percoll，最后将细胞悬液延管壁缓慢加入最上层。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中所述的78％percoll、69％percoll和52％percoll是用percoll原液与pbs按相应比例配制而成。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，取出78％percoll和69％percoll中间的细胞层，加入pbs冲洗，于600
×
g室温离心5min后去除上清液。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，用3ml红细胞裂解液重悬细胞，于冰上裂解3分钟，吹打细胞悬液3次，加入10ml pbs停止裂解，于600
×
g室温离心5min后弃去上清。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s3中，采用1μmol/l ionomycin刺激中性粒细胞6小时，诱导nets生成。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s4中，加入含10％fbs的rpmi1640培养基反复冲洗培养皿底5次，收集冲洗液。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s4中，将冲洗液于1000
×
g、4℃离心5分钟。

技术总结
本发明涉及动物细胞成分提取和定量技术领域，具体涉及一种中性粒细胞胞外诱捕网提取和定量的方法。所述方法包括以下步骤：S1.中性粒细胞的提取；S2.中性粒细胞的培养；S3.NETs的诱导；S4.NETs的收集；S5.NETs的定量。本发明方法以较低的诱导物Ionomycin浓度和较短的诱导时间，能快速、简便、稳定诱导提取NETs，采用蛋白核酸分析仪即可对NETs中的核酸和蛋白成分进行定量分析。本发明方法在建立NETs快速检测方法或试剂盒、筛选促进或抑制NETs相关药物或针对性治疗药物的等相关研究中十分重要，在生物医学检测领域也具有显著的重要意义。生物医学检测领域也具有显著的重要意义。生物医学检测领域也具有显著的重要意义。


技术研发人员：王旭 黄雨朦 姬倩 李荣坤 袁啸 戴春华
受保护的技术使用者：江苏大学附属医院
技术研发日：2021.09.10
技术公布日：2021/12/13