一种栽培大豆导入一年生野生大豆染色体易位片段的方法与流程

一种栽培大豆导入一年生野生大豆染色体易位片段的方法
1.技术领域：本发明提供一种栽培大豆导入一年生野生大豆染色体易位片段的方法，涉及任何一个染色体无易位栽培大豆和一年生染色体有易位野生大豆间的遗传转化，利用这种方法可以把一年生野生大豆染色体易位区段相关基因定向导入栽培大豆，拓宽了栽培大豆的遗传基础，增加了栽培大豆的遗传多样性，属于作物遗传育种领域。
2.

背景技术：
大豆是世界主要的油料作物，同时也是植物蛋白的主要来源；但是大豆在育种方面进展较慢，单产比较低，迫切需要通过育种及栽培途径提高单产水平；制约栽培大豆育种进程的因素之一，是栽培大豆品种遗传多样性水平较低、遗传基础狭窄、这导致了优良品种育成缓慢，国内一些学者通过系谱分析研究表明，现有育成的栽培大豆品种其遗传背景不同程度地来自少数骨干亲本；相对于栽培大豆，野生大豆资源在我国分布广，具有丰富的遗传多样性, 并且野生大豆资源中有丰富的优良基因。由于野生大豆中普遍存在染色体结构变异，特别是染色体易位频率超过70%，直接利用染色体易位区段有益基因比较困难，常规育种中要想利用野生大豆的优良基因，需要进过杂交、自交或一系列回交，并最终并通过表型鉴定等一些列复杂育种程序，才有可能达到利用的目的，效率低。
3.如何高效利用一年生野生大豆有益基因，如何通过非转基因及非基因编辑方式将一年生野生大豆染色体易位区段基因定向导入到栽培大豆，拓宽栽培大豆遗传基础，正是本发明要解决的问题。
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技术实现要素：
本发明提供一种栽培大豆导入一年生野生大豆染色体易位片段的方法，涉及任何一个染色体无易位栽培大豆和染色体有易位一年生野生大豆间的遗传转化，利用这种方法可以把一年生野生大豆染色体易位区段相关基因导入栽培大豆，达到将野生大豆有益基因导入栽培大豆的目的，拓宽了栽培大豆的遗传基础。
5.本发明所述一种栽培大豆导入一年生野生大豆染色体易位片段的方法，包括以下步骤：1）杂交组合配制：以染色体无易位栽培大豆和染色体有易位一年生野生大豆为亲本，二者进行有性杂交，获得f1代种子，种植后为f1代植株，该植株为染色体易位杂合体；2）f1代染色体易位杂合体鉴定：杂交后的f1代植株，利用形态学鉴定确定半野生单株，利用i2‑
ki花粉染色法鉴别染色体易位杂合体，去除伪杂种；3）回交转育：以f1代染色体易位杂合体植株为母本，以亲本栽培大豆为父本回交获得bc1f1种子，再以bc1f1代染色体易位杂合体植株为母本，以亲本栽培大豆为父本回交获得bc2f1种子，以此方法继续选择杂交后获得的染色体易位杂合体植株并连续回交，直至回交至bc6代以上，结束回交；4）分离群体花粉可育纯合基因型初步鉴定：种植bc6f1代植株自交获得bc6f2代种子，bc6f2代种子种植后获得bc6f2代染色体易位分离群体植株，利用i2‑
ki花粉染色法筛选花粉可育单株，这些单株包含两种基因型，染色体纯合有易位和染色体纯合无易位；
5）测交鉴定分离群体中可育单株有无染色体易位情况：以每个bc6f2代花粉可育单株为母本，以任一染色体无易位大豆资源为父本，进行杂交获得多组测交f1种子，测验bc6f2代花粉可育单株有无染色体易位，再次利用i2‑
ki花粉染色法鉴定每个测交f1单株的花粉可育率，花粉半可育对应母本单株即为染色体纯合有易位单株，该单株即为育成的栽培大豆染色体纯合有易位品系，完成染色体无易位栽培大豆导入一年生野生大豆染色体易位。
6.上述方法中，步骤1所述获得f1代种子时，染色体无易位栽培大豆可以做母本或者父本，同样，一年生野生大豆也可做母本或父本。
7.步骤2所述形态学鉴定方法，鉴定f1植株为半野生型；所述i2‑
ki花粉染色法鉴别染色体易位杂合体，该方法利用1.2 % i2‑
ki溶液染色f1植株花粉，判断染色花粉为可育花粉，不染色花粉为不育花粉，利用可育花粉与总花粉数的比值计算花粉可育率，选择花粉可育率为30.0～60.0%的单株为染色体易位杂合体。
8.以步骤3所述f1染色体易位杂合体为母本，以亲本栽培大豆为父本回交获得bc1f1种子并播种为bc1f1植株；用步骤2所述可育花粉判断方法，筛选bc1f1植株，获得染色体易位杂合体，并以该杂合体单株为母本，以亲本栽培大豆为父本回交，获得bc2f1种子，该种子播种为单株，以此方法继续选择回交后获得的染色体易位杂合体单株，并以此单株为母本，以亲本栽培大豆为父本连续回交6代以上，获得bc
n
f1（n为大于或等于6的自然数，以下相同）种子及单株。
9.步骤4所述的培育方法，bc
n
f2植株分离群体的花粉可育纯合基因型鉴定，是利用步骤3所述的花粉染色法判断单株花粉可育率，当某一单株花粉可育率在95.0～100%时，确定该单株为可育基因型（单株），当某一单株花粉可育率在30.0～60.0%时，确定该单株为半可育基因型（单株）。
10.步骤5所述的染色体纯合易位单株的筛选方法，是指以bc
n
f2可育单株为亲本，与任何一个染色体无易位栽培大豆或野生大豆杂交获得测交f1代种子并播种为f1单株，利用步骤3所述的花粉染色法判断测交f1代单株花粉可育率，选择花粉可育率30.0～60.0%的单株，这种类型后代单株对应的测交亲本（bc
n
f2可育单株），即为染色体纯合有易位栽培大豆，完成一年生野生大豆染色体易位片段导入栽培大豆育种程序，繁殖该种类型单株即获得染色体纯合有易位栽培大豆品系，该品系与原亲本染色体无易位栽培大豆互为等位基因系。
11.本发明的积极效果在于：利用遗传改良手段，通过杂交、回交和测交等一系列育种方法，把一年生野生大豆染色体易位片段导入栽培大豆；采用非转基因及非基因编辑手段直接利用野生豆中普遍存在的染色体易位变异；方法简单、可靠、可重复，任何一个大豆育种工作者均可按照该方法进行实际操作，创制栽培大豆染色体易位等位系。
12.附图说明：图1a为栽培大豆82b植株形态；图1b为野生大豆ob植株形态；图1c为（82b
×
ob）f1植株形态,表现为半野生形态；图2a为栽培大豆82b花粉1.2%i2‑
ki染色情况，显微镜下100倍观察，染色体纯合无易位，花粉全可育，黑色为可育染色花粉；图2b为野生大豆ob花粉1.2%i2‑
ki染色情况，显微镜下100倍观察，染色体纯合有
易位，花粉全可育，黑色为可育染色花粉；图2c为f1植株花粉1.2%i2‑
ki染色情况，显微镜下100倍观察，染色体为易位杂合体，植株花粉可育率约为43.01%，黑色为可育染色花粉，不染色或浅棕色为败育花粉）；图3为栽培大豆82b导入一年生野生大豆ob染色体易位片段。
13.具体实施方式：通过以下实施例举例描述本发明，但并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
14.实施例1：1）杂交组合配制：以染色体无易位栽培大豆82b（1a）为母本和染色体有易位一年生野生大豆ob（1b）为父本，二者进行有性杂交，获得f1代种子；2）f1代染色体易位杂合体鉴定：种植f1代种子后获得f1代植株，在f1植株4～6叶期，第一次鉴定植株形态为半野生（附图1c）的为真杂种。进一步鉴定f1植株花粉败育率，在f1植株始花期，从每个单株取 2 个未开放花蕾鉴定花粉败育率，鉴定方法采用1.2% i2‑
ki染色法，利用100倍显微镜观察，判断染色花粉为可育花粉，不染色花粉为不育花粉，利用可育花粉与总花粉数的比值计算花粉可育率，用平均值表示结果，花粉染色率约为43.01%（图2c），确定该f1单株为染色体易位杂合体。
15.3）回交转育：以f1代花粉染色率30.0～60.0%的植株为母本，以亲本栽培大豆82b为父本回交获得bc1f1种子，种植bc1f1种子获得bc1f1植株，再次利用i2‑
ki染色法鉴定bc1f1代植株，确定花粉染色率30.0～60.0%的植株为染色体易位杂合体，并以该植株为母本，以亲本栽培大豆82b为父本回交获得bc2f1种子，以此方法继续选择杂交后获得的染色体易位杂合体植株并连续回交，直至回交至bc6代，结束回交。
16.4）分离群体花粉可育纯合基因型初步鉴定：种植bc6f1代植株自交获得bc6f2代种子，bc6f2代种子种植后获得bc6f2代染色体易位分离群体植株，该群体包含3种基因型：染色体纯合无易位（nn），染色体纯合有易位（tt）,染色体杂合易位（nt）。利用1.2%i2‑
ki花粉染色法第一次筛选基因型，花粉染色率30.0～60.0%的植株为染色体易位杂合体，花粉染色率在95.0～100%（图2a）的植株为染色体纯合无易位（nn）或染色体纯合有易位（tt），即为花粉可育单株。
17.5）测交鉴定分离群体中可育单株有无染色体易位情况：以每个bc6f2代花粉染色率在95.0～100%的单株为母本，以染色体无易位大豆资源jlr2为父本，进行杂交获得10组测交f1种子。
18.测交结果鉴定及栽培大豆染色体有易位品系获得：种植10组测交f1种子获得测交f1植株，利用i2‑
ki花粉染色法鉴定测交f1单株的花粉染色率，30.0～60.0%花粉染色率对应母本单株即为染色体纯合有易位单株，共获得4个单株，该单株即为育成的栽培大豆染色体有易位品系，完成栽培大豆导入一年生野生大豆染色体易位片段。
19.染色体易位导入分子水平鉴定，取亲本及育成的栽培大豆有易位材料盛花期叶
片，提取dna并进行高通量基因组测序，对原始测序数据进行过滤、校正，利用williams82作为参考基因组进行mapping，获得snp数据。利用自定义perl程序，得到亲本间差异所有差异snp信息；将栽培大豆有易位材料的所有snp位点与亲本间差异snp进行比对，得到栽培大豆中导入的一年生野生大豆易位片段（图3）。
20.实施例2：1）杂交组合配制：以染色体有易位一年生野生大豆ob（图1b）为母本,以染色体无易位栽培大豆82b（图1a）为父本，二者进行有性杂交，获得f1代种子；2）f1代染色体易位杂合体鉴定：种植f1代种子后获得f1代植株，在f1植株5叶期，第一次鉴定植株形态为半野生的为真杂种。
21.在f1植株始花期，从每个单株取 2 个未开放花蕾鉴定花粉可育率，鉴定方法采用1.2% i2‑
ki染色法，利用100倍显微镜观察，判断染色花粉为可育花粉，不染色花粉为不育花粉，利用可育花粉与总花粉数的比值计算花粉可育率，用平均值表示结果。花粉染色率在30.0～60.0%的确定为染色体易位杂合体。
22.4）回交转育：以f1代花粉染色率30.0～60.0%的植株为母本，以亲本栽培大豆82b为父本回交获得bc1f1种子，种植bc1f1种子获得bc1f1植株，再次利用i2‑
ki染色法鉴定bc1f1代植株，确定花粉染色率30.0～60.0%的植株为染色体易位杂合体，并以该植株为母本，以亲本栽培大豆82b为父本回交获得bc2f2种子，以此方法继续选择杂交后获得的染色体易位杂合体植株并连续回交，直至回交至bc6代，结束回交。
23.5）分离群体花粉可育纯合基因型初步鉴定：种植bc6f1代植株自交获得bc6f2代种子，bc6f2代种子种植后获得bc6f2代染色体易位分离群体植株，该群体包含3种基因型：染色体纯合无易位（nn），染色体纯合有易位（tt）,染色体杂合易位（nt）。利用1%i2‑
ki花粉染色法第一次筛选基因型，花粉染色率30.0～60.0%的植株为染色体易位杂合体，花粉染色率在95.0～100%的植株为染色体纯合无易位（nn）或染色体纯合有易位（tt），即为可育单株。
24.测交鉴定分离群体染色体易位情况，以每个bc6f2代花粉染色率在95～100%的单株为母本，以染色体无易位大豆资源jlr4为父本，进行杂交获得12组测交f1种子，种植测交f1种子获得测交f1植株，利用i2‑
ki花粉染色法鉴定测交f1单株的花粉染色率，30.0～60.0%花粉染色率对应母本单株即为染色体纯合有易位单株，共获得3株，该3个单株即为育成的栽培大豆染色体有易位品系82b（tt），完成栽培大豆导入一年生野生大豆染色体易位片段。