ROS响应型线粒体靶向槲皮素脂质体及其制备方法和应用与流程

ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种脂质体及其制备方法和应用，具体涉及一种基于ros响应以及线粒体靶向的多功能槲皮素脂质体及其制备方法和应用，属于脂质体技术领域。


背景技术：

2.视网膜缺血再灌注损伤是导致失明的主要原因之一，其主要特征是视网膜中视神经细胞(rgc)的凋亡和功能丧失。预防或治疗视网膜缺血再灌注损伤的主要措施包括：
3.1、清除ros，抑制缺血再灌注发生后视神经细胞的凋亡；
4.2、抑制视网膜炎症的发生；
5.3、促进视神经细胞功能的修复。
6.尽管ros的清除以及炎症反应的抑制被认为是治疗视网膜缺血再灌注损伤的主要途径，但目前尚缺乏有效治疗视网膜缺血再灌注损伤的药物。
7.槲皮素是一种天然抗氧化抗炎药物，同时具备ros清除以及炎症抑制功能，然而槲皮素作为一种脂溶性化合物，其极差的水溶性严重限制了其在临床上的应用，且目前已报道的槲皮素脂质体存在缺乏靶向性的问题，不利于槲皮素抗炎抗氧化能力的充分发挥。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种基于ros响应以及线粒体靶向的多功能槲皮素脂质体及其制备方法和应用。
9.为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
10.一种ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
11.第1步、合成ros响应元件
12.ros响应元件为di
‑
s
‑
gpc，合成di
‑
s
‑
gpc的步骤如下：
13.(1)将羰二咪唑和c18
‑
s
‑
cooh按照质量比3：4加入到二氯甲烷中，得到第一相溶液；
14.(2)将1,8
‑
二氮杂二环[5.4.0]十一碳
‑7‑
烯和甘油磷脂酰胆碱按照质量比1:1加入到二甲基亚砜中，得到第二相溶液；
[0015]
(3)第一相溶液和第二相溶液在30℃各搅拌1h后，将第一相溶液转移到第二相溶液中在30℃进一步反应24h，得到粗品；
[0016]
(4)用梯度洗脱硅胶柱层析法对粗品进行纯化，得到di
‑
s
‑
gpc脂质；
[0017]
第2步、制备ros响应型槲皮素脂质体
[0018]
制备ros响应型槲皮素脂质体的步骤具体如下：
[0019]
(1)将大豆卵磷脂、di
‑
s
‑
gpc、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇
‑
2000和槲皮素按照质量比17～18：5：5～6：1～2：1混合，得到药脂比为1:30的混合物，将混合物加入至圆底烧瓶中，并向圆底烧瓶中加入氯仿/甲醇混合溶剂，得到混合溶液，使用超声仪
对混合溶液进行超声处理，得到黄色澄清的溶液；
[0020]
(2)将前一步制备得到的黄色澄清的溶液置于37℃的旋转蒸发仪上旋蒸，直至形成一层黄色薄膜，随后加入去超纯水，然后置于50℃的旋转蒸发仪上旋蒸水化，水化之后将所得溶液转移至干净西林瓶中，使用细胞破碎仪破碎，使较大的颗粒破碎为小颗粒，最终得到黄色透明液体；
[0021]
(3)将前一步制备得到的黄色透明液体分装到ep管中，并置于离心机中离心，得到纯度较高的槲皮素纳米脂质体，将ep管中的上清溶液转移到洗净的西林瓶中；
[0022]
(4)将装有上清溶液的西林瓶放入细胞破碎仪中，再次使用细胞破碎仪超声控制脂质体的粒径，最终得到黄色澄清脂质体溶液，即ros响应型槲皮素纳米脂质体溶液；
[0023]
第3步、向ros响应型槲皮素脂质体中添加线粒体靶向分子
[0024]
向ros响应型槲皮素脂质体中添加线粒体靶向分子的步骤具体如下：
[0025]
将聚乙二醇修饰的三苯基膦酸
‑
2000和上一步制备得到的ros响应型槲皮素脂质体按照2mg：3ml的比例放置于圆底烧瓶中，50℃水浴加热并磁转子不断搅拌2h，得到含有磷酸三苯酯分子的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体。
[0026]
前述的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的制备方法，其特征在于，在第1步中，前述c18
‑
s
‑
cooh的合成方法如下：
[0027]
向质量浓度为25％的氢氧化钾甲醇溶液中加入巯基乙酸和溴代十八烷，室温下剧烈搅拌48h，然后用盐酸酸化至ph＝1，之后依次进行乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥和硅胶柱层析纯化，得到c18
‑
s
‑
cooh。
[0028]
前述的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的制备方法，其特征在于，前述巯基乙酸和溴代十八烷的摩尔比为1:1。
[0029]
前述的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的制备方法，其特征在于，进行硅胶柱层析纯化时，洗脱液采用的是己烷/醋酸乙酯3:1，v/v。
[0030]
前述的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的制备方法，其特征在于，在第1步中，用梯度洗脱硅胶柱层析法对粗品进行纯化时，洗脱液a采用的是二氯甲烷：甲醇5:1，v/v；洗脱液b采用的是二氯甲烷：甲醇：水65:25:4，v/v/v。
[0031]
前述的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的制备方法，其特征在于，在第2步中，在氯仿/甲醇混合溶剂中，氯仿与甲醇按照体积比3:1混合。
[0032]
一种ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体，其特征在于，由前述方法制备而来，该ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体可以应用在玻璃体注射治疗视网膜缺血再灌注损伤中。
[0033]
本发明的有益之处在于：
[0034]
(1)本发明使用ros响应元件di
‑
s
‑
gpc和传统大豆卵磷脂按合适比例作为脂质体外壳材料，包裹疏水性药物槲皮素，将疏水性药物槲皮素制成了亲水制剂，改善了槲皮素的成药性，解决了槲皮素成药困难的问题；
[0035]
(2)本发明通过脂质体包裹槲皮素，起到了缓释作用，延长了槲皮素在体内的代谢时间，增强了细胞膜穿透能力，同时降低了直接给药造成的峰谷现象以及槲皮素的毒副作用；
[0036]
(3)本发明通过引入ros响应基团和线粒体靶向分子tpp，使槲皮素能选择性在ros
富集部位靶向释放，增强了槲皮素的抗炎能力和抗氧化能力；
[0037]
(4)本发明制备得到的槲皮素脂质体能够有效抑制视网膜炎症细胞的活化增殖，具有良好的视网膜缺血再灌注损伤治疗功效，可应用在玻璃体注射治疗视网膜缺血再灌注损伤中。
附图说明
[0038]
图1是ros响应元件di
‑
s
‑
gpc的合成路线图；
[0039]
图2是ros响应元件di
‑
s
‑
gpc的1h
‑
nmr图；
[0040]
图3是ros响应元件di
‑
s
‑
gpc的ms图；
[0041]
图4(a)、图4(b)和图4(c)分别是ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的电镜图、粒径分布图和zeta电位图；
[0042]
图5是ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的体外释放图；
[0043]
图6是视网膜祖细胞对ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的摄取图；
[0044]
图7是ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体进入视网膜祖细胞后线粒体靶向分布图；
[0045]
图8是原代巨噬细胞炎症因子分泌检测图；
[0046]
图9是视网膜祖细胞atp含量测定图；
[0047]
图10是大鼠视网膜小胶质细胞免疫荧光检测图；
[0048]
图11是大鼠视网膜he染色图；
[0049]
图12是大鼠视网膜β
‑
iii
‑
tubulin蛋白免疫荧光检测图。
具体实施方式
[0050]
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
[0051]
第一部分、ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的制备
[0052]
原料组成：槲皮素(原料药)、大豆卵磷脂(脂质体外壳材料)、胆固醇(膜流动性调节剂)、di
‑
s
‑
gpc(ros响应元件)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇
‑
2000(dspe
‑
peg
‑
2000，长循环保护剂)、聚乙二醇修饰的三苯基膦酸
‑
2000(tpp
‑
peg
‑
2000，线粒体靶向分子)
[0053]
ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的制备方法，具体包括以下步骤：
[0054]
第1步、合成ros响应元件di
‑
s
‑
gpc
[0055]
di
‑
s
‑
gpc的结构式如下所示：
[0056][0057]
参照图1，合成di
‑
s
‑
gpc的步骤具体如下：
[0058]
(1)向质量浓度为25％的氢氧化钾甲醇溶液(10ml)中加入巯基乙酸(1.12g，12.02mmol)和溴代十八烷(4g，12.02mmol)，室温下剧烈搅拌48h，然后用hcl水溶液(0.1m)酸化至ph＝1，之后依次进行乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥和硅胶柱层析纯化(洗脱液为己烷/醋酸乙酯3:1，体积比)，得到c18
‑
s
‑
cooh(1.72g，收率41％)，为白色固体。
[0059]
(2)将羰二咪唑(0.71g，4.36mmol)和前一步制备得到的c18
‑
s
‑
cooh(1g，2.91mmol)加入到二氯甲烷(15ml)中，得到第一相溶液；将1,8
‑
二氮杂二环[5.4.0]十一碳
‑7‑
烯(0.29g，1.94mmol)和甘油磷脂酰胆碱(0.3g，1.16mmol)加入到二甲基亚砜(15ml)中，得到第二相溶液；第一相溶液和第二相溶液在30℃各搅拌1h后，将第一相溶液转移到第二相溶液中在30℃进一步反应24h，得到粗品；不经任何后处理，用梯度洗脱硅胶柱层析法对粗品进行纯化(洗脱液a：二氯甲烷：甲醇5:1，体积比；洗脱液b：二氯甲烷：甲醇：水65:25:4，体积比)，得到di
‑
s
‑
gpc脂质(0.43g，收率42.8％)，为淡黄色固体。
[0060]
使用1h
‑
nmr、ms手段对得到的淡黄色固体的结构进行表征，表征结果见图2和图3，图2和图3表明：sdi
‑
s
‑
gpc成功合成。
[0061]
第2步、通过薄膜分散法制备ros响应型槲皮素脂质体通过薄膜分散法制备ros响应型槲皮素脂质体的步骤具体如下：
[0062]
(1)精确称取大豆卵磷脂53mg、di
‑
s
‑
gpc 15mg、胆固醇17mg、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇
‑
2000(dspe
‑
peg
‑
2000)4.8mg、槲皮素3mg，得到药脂比为1:30的混合物，将混合物加入至圆底烧瓶中，并向圆底烧瓶中加入氯仿/甲醇(3:1，v/v)混合溶剂30ml，得到混合溶液，使用超声仪对混合溶液进行超声处理，得到黄色澄清的溶液。
[0063]
(2)将前一步制备得到的黄色澄清的溶液置于37℃、90r/min的旋转蒸发仪上旋蒸，直至形成一层黄色薄膜，随后加入8ml去超纯水，然后置于50℃、100r/min的旋转蒸发仪上旋蒸水化50min，此过程不需要负压处理，水化之后将所得溶液转移至干净西林瓶中，使用细胞破碎仪破碎，使较大的颗粒破碎为小颗粒，每超声处理5s暂停5s，共2min，最终得到黄色透明液体。
[0064]
(3)将前一步制备得到的黄色透明液体分装到1.5ml ep管中，并置于离心机中以5000r/min的速度离心10min，充分使未包裹进入脂质体的槲皮素与槲皮素纳米脂质体分离，得到纯度较高的槲皮素纳米脂质体，将ep管中的上清溶液转移到洗净的西林瓶中。
[0065]
(4)将装有上清溶液的西林瓶放入细胞破碎仪中，再次使用细胞破碎仪超声控制脂质体的粒径，每超声处理5s暂停5s，共10min，将脂质体的粒径控制在140～180nm，最终得到黄色澄清脂质体溶液，即ros响应型槲皮素纳米脂质体溶液。
[0066]
将上述制备得到的ros响应型槲皮素纳米脂质体于4℃保存，备用。
[0067]
测定槲皮素脂质体的包封率：将槲皮素脂质体溶解于甲醇中，采用美国马萨诸塞州波士顿perkin elmer公司生产的perkin elmer lambda 6紫外
‑
可见光谱仪，在372nm波长处用紫外
‑
可见分光光度计测定槲皮素脂质体的浓度。经计算，该槲皮素脂质体的包封率为85.3％。
[0068]
第3步、向上述ros响应型槲皮素脂质体中添加线粒体靶向分子tpp
[0069]
向上述ros响应型槲皮素脂质体中添加线粒体靶向分子tpp的步骤具体如下：
[0070]
精确称取聚乙二醇修饰的三苯基膦酸
‑
2000(tpp
‑
peg
‑
2000)2mg，放置于50ml圆底烧瓶中，并加入上一步制备得到的ros响应型槲皮素脂质体3ml，将圆底烧瓶置于50℃水浴锅中加热，并用磁转子不断搅拌2h，得到含有磷酸三苯酯(tpp)分子的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体。
[0071]
第二部分、ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的表征
[0072]
1、粒径、zeta电位以及形态
[0073]
通过粒径仪对第一部分制备得到的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的粒径以及zeta电位进行表征。
[0074]
通过透射电子显微镜(tem)对第一部分制备得到的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的形态进行表征。
[0075]
表征结果见图4(a)、图4(b)和图4(c)。由图4(a)、图4(b)和图4(c)可知：该ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体成规则球形，大小均匀，粒径约为148nm，zeta电位为
‑
27.07mv，且分散性较好，稳定性较高。
[0076]
2、体外释放
[0077]
将第一部分制备得到的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体置于分子量为500的透析袋中，以40ml含有质量浓度为1％的吐温
‑
80和不同浓度的h2o2的pbs为释放介质，在37℃、120rpm的摇床中，检测药物槲皮素的体外释放情况。在固定时间点使用等量的新鲜释放介质置换各个样品的释放介质，每次换取1ml。将得到的样品过0.22μm滤膜后使用hplc检测药物槲皮素的含量，最后根据药物槲皮素标准曲线计算累计释放量。
[0078]
体外释放结果见图5。由图5可知：槲皮素被包裹于脂质体后，释放量具有时间依赖性，且释放介质中的h2o2含量越高，槲皮素的释放速率越快，表明该脂质体同时具备延长药物释放时间的能力以及ros响应的能力。
[0079]
第三部分、ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的细胞学研究
[0080]
1、细胞摄取实验
[0081]
取第一部分制备得到的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体3ml，置于50ml圆底烧瓶中，向圆底烧瓶中加入fitc
‑
peg
‑
2000 5mg，然后在50℃的条件下水浴加热并不断搅拌2h，得到fitc荧光标记的脂质体。
[0082]
将视网膜祖细胞(r28细胞)接种于6cm细胞培养皿中，过夜后加入上述fitc荧光标记的脂质体，24h后洗去含脂质体的培养液，经细胞固定、通透以及dapi标记细胞核，线粒体荧光探针mitotracker
‑
red标记线粒体之后，使用激光共聚焦显微镜观察细胞对脂质体的摄取情况以及线粒体靶向情况。
[0083]
观察结果见图6和图7。由图6和图7可知：第一部分制备得到的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体成功被r28细胞摄取，且在细胞内部的分布情况与线粒体的分布情况吻合，表明该ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体具有良好的生物相容性以及线粒体靶向性。
[0084]
2、抗炎活性研究
[0085]
将提取的原代腹腔巨噬细胞接种于24孔板，过夜后分别加入含有不同浓度本发明第一部分制备得到的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的lps刺激液，24h后使用elisa试剂盒检测上清液中的il
‑
1β的含量。
[0086]
检测结果见图8。由图8可知：该ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的存在明显抑制了炎症因子的产生，且该抑制效果具有浓度依赖性，证明了本发明第一部分制备得到的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体具有良好的抗炎功效。
[0087]
3、细胞保护能力研究
[0088]
将r28细胞接种于96孔板中，过夜后换含有不同浓度本发明第一部分制备得到的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的无糖培养基并置于乏氧小室中模拟缺血环境，24h后取出检测细胞内atp含量。
[0089]
检测结果见图9。由图9可知：ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的存在明显抑制了乏氧之后细胞内atp含量下降的现象，且该效果具有浓度依赖性，证明本发明制备得到的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体在体外表现出了良好的视网膜祖细胞保护能力。
[0090]
第四部分、ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体的动物水平研究
[0091]
1、大鼠视网膜炎症抑制实验
[0092]
使用前房加压法构建大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型，然后向大鼠的玻璃体内注射第一部分制备得到的ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体，7d后处死大鼠，取出眼球，眼球经脱水、固定、包埋之后进行冰冻切片，之后对眼球切片的小胶质细胞特异性蛋白gfap以及细胞核进行荧光染色，使用激光共聚焦显微镜观察荧光强度。
[0093]
观察结果见图10。由图10可知：与对照组相比，玻璃体注射ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体后，小胶质细胞gfap蛋白含量明显降低，表明小胶质细胞的活化增殖被抑制，证明了ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体在体内具有良好的视网膜炎症抑制能力。
[0094]
2、视网膜he染色
[0095]
将前面大鼠视网膜炎症抑制实验中获得的大鼠眼球切片进行苏木精
‑
伊红染色，然后置于显微镜下先观察视网膜结构形态。
[0096]
观察结果见图11。由图11可知：与对照组相比，玻璃体注射ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体后，视网膜的形态以及厚度得到了很好的维持，表明ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体成功抑制了缺血再灌注后视网膜细胞的凋亡。
[0097]
3、视神经细胞保护实验
[0098]
对前面大鼠视网膜炎症抑制实验中获得的大鼠眼球切片进行视神经细胞特异性蛋白β
‑
iii
‑
tubulin以及细胞核荧光染色，使用激光共聚焦显微镜观察荧光强度。
[0099]
观察结果见图12。由图12可知：与对照组相比，玻璃体注射ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体后，视神经细胞特异性蛋白β
‑
iii
‑
tubulin的荧光强度显著增强，证明了ros响应型线粒体靶向槲皮素脂质体在视网膜缺血再灌注发生后，对视神经细胞起到了良好的保护作用。
[0100]
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。