一种用于非洲猪瘟病毒检测的便携式免疫荧光层析仪的制作方法

1.本发明涉及动物传染病检测领域，具体是一种用于非洲猪瘟病毒检测的便携式免疫荧光层析仪。


背景技术：

2.非洲猪瘟（african swine fever，asf）是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)引起的猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病，可影响所有日龄的猪，引起出血热。非洲猪瘟有多种表现形式，从特急性、急 性、亚急性到慢性和无明显症状，主要特征是病程短、病死率高（可达100%）。我国已将此病规定为一类动物传染病,世界动物卫生组织列为a类动物疫病。asf主要通过直接接触传播，或通过摄入含有病毒的猪肉或其他污染物(如泔水、废物、屠体等)进行传播，或被受感染的软蜱叮咬进行传播。2018年8月我国首次发生非洲猪瘟疫情，截至2020年12月为止共计疫情通报130起，涉及24省市地区，疫情总体呈现点状散发。此次疫情累计扑杀生猪一百余万头，粗略估计对我国养猪业造成十几亿元的经济损失，同时疫情蔓延还严重威胁到我国本土猪品种的数量。
3.在进行非洲猪瘟检测时一般需要试纸与层析仪配合使用，为了方便携带层析仪，层析仪一般置于盒体中，但在实际使用过程中，虽然层析仪集成到盒体中，但层析仪在使用时只能通过盒体的上面开口操作，使用不便。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种用于非洲猪瘟病毒检测的便携式免疫荧光层析仪，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于非洲猪瘟病毒检测的便携式免疫荧光层析仪，用于对所述非洲猪瘟病毒快速检测的荧光试纸进行测定，包括：下箱体及上箱体，所述上箱体套设在所述下箱体外侧且可沿所述下箱体滑动；层析仪，所述层析仪安装在所述下箱体及上箱体内，且所述层析仪的操作端突出所述下箱体的上端口；锁止机构，所述锁止机构安装在设置于所述上箱体一侧端的内嵌槽内，且与设置在所述下箱体上的卡槽适配；盖体，所述盖体通过连接轴转动安装在所述上箱体远离所述下箱体的一侧，且通过锁扣与所述上箱体连接；按压楔形块，所述按压楔形块固定在所述上箱体上，当上箱体从水平状态转动到垂直状态时，所述按压楔形块与所述锁止机构配合，以使所述锁止机构达到解锁状态。
6.作为本发明再进一步的方案：所述锁止机构包括与所述卡槽适配的卡销组件及用于驱动所述卡销组件从所述卡槽内脱离或卡入所述卡槽的传动组件，其中，所述传动组件包括滑动安装在所述内嵌槽内的活动杆，所述活动杆上固定有延伸板，所述延伸板通过弹
簧与所述内嵌槽连接；所述活动杆的一端固定有与所述按压楔形块配合的活动楔形块，且所述活动杆朝向所述卡销组件的一侧设置有条形齿，所述条形齿与固定在所述卡销组件上的齿轮啮合。
7.作为本发明再进一步的方案：所述卡销组件包括转动安装在所述内嵌槽内的螺纹套筒及与所述卡槽适配的卡销，所述卡销接近所述螺纹套筒的一端插放于所述螺纹套筒内且与所述螺纹套筒螺纹连接，所述卡销远离所述螺纹套筒的一端贯穿所述内嵌槽且与所述内嵌槽滑动连接。
8.一种非洲猪瘟病毒快速检测方法，包括以下步骤：s1、非洲猪瘟病毒快速检测荧光试纸制备；s2、检测样品溶液的制备：采集猪的病变组织、病猪血清及拭子样品；s3、荧光试纸检测：将一株非洲猪瘟单克隆抗体固定在检测线5上，将羊抗兔二抗固定在质控线4上，随后将病变组织、病猪血清或拭子样品60μl滴入样品垫7上，静置10
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15min；s4、测定结果，采用免疫荧光层析仪对荧光试纸进行测定，阴性结果表现为检测线5上的荧光条带显现，阳性结果为检测线5及质控线4上的荧光条带均显现。
9.作为本发明再进一步的方案：所述非洲猪瘟病毒快速检测荧光试纸制备包括以下步骤：s11、制备非洲猪瘟病毒p32免疫抗原；s12、制备抗非洲猪瘟病毒的单克隆抗体、筛选识别非洲猪瘟病毒的配对单克隆抗体，识别非洲猪瘟病毒的单克隆抗体mab1 用于制备样品垫7上的标记物区域6，识别非洲猪瘟病毒的单克隆抗体mab2 用于制备检测线5；s13、制备羊抗兔igg 抗体pab1，用于制备质控线4。
10.作为本发明再进一步的方案：所述非洲猪瘟病毒p32免疫抗原的制备包括：以非洲猪瘟病毒经典毒株的p32基因构建重组载体，并对该基因序列进行密码子优化，转化至大肠杆菌bl21进行体外诱导表达24h，收取细菌培养液，4℃8000 r/min 低速离心30 min 去除培养液收集菌沉淀，利用his标签镍柱进行包涵体纯化，透析去除尿素并浓缩，测定蛋白浓度为5mg/ml。
11.作为本发明再进一步的方案：所述抗非洲猪瘟病毒的单克隆抗体的制备包括以下步骤：s21、建立杂交瘤细胞株；s22、单克隆抗体的制备：以体内诱生腹水制备单抗。取经液体石蜡致敏的经产balb/c小鼠，腹腔注射对数生长期的杂交瘤细胞107个/只，7d后抽取腹水，离心后取上清，分装，冻存；s23、鉴定单克隆体；s24、纯化单克隆抗体，以得到抗非洲猪瘟病毒的单克隆抗体。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明设计新颖，将盖体与上箱体上的锁扣打开，转动盖体从水平方向到垂直方向，此时盖体上的按压楔形块将锁止机构打开，实现解锁，上箱体与下箱体之间的固定状态改变，随后可将上箱体朝向下箱体推动，使得层析仪突出，无需将层析仪取出后使用，使用便捷，实用性强。
附图说明
13.图1为非洲猪瘟病毒快速检测的荧光试纸的结构示意图。
14.图2为非洲猪瘟病毒快速检测的荧光试纸的俯视图。
15.图3为便携式免疫荧光层析仪的结构示意图。
16.图4为便携式免疫荧光层析仪另一角度的结构示意图。
17.图5为便携式免疫荧光层析仪的结构爆炸图。
18.图6为便携式免疫荧光层析仪的后视图。
19.图7为图6中a处的结构放大图。
20.图8为便携式免疫荧光层析仪中锁止机构结构示意图。
21.图9为便携式免疫荧光层析仪中锁止机构另一角度的结构示意图。
22.图中：1
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基板、2
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吸水垫、3
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检测膜、4
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质控线、5
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检测线、6
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标记物区域、7
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样品垫、8
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下箱体、9
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上箱体、10
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盖体、11
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把手、12
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按压楔形块、13
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活动楔形块、14
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连接轴、15
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层析仪、16
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内嵌槽、17
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活动杆、18
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延伸板、19
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弹簧、20
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条形齿、21
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齿轮、22
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螺纹套筒、23
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卡销。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.另外，本发明中的元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。
25.请参阅图1~2，本发明实施例中，一种非洲猪瘟病毒快速检测的荧光试纸，所述非洲猪瘟病毒快速检测的荧光试纸包括：基板1，所述基板1上依次设置有吸水垫2、检测膜3及样品垫7；所述检测膜3上设置有质控线4及检测线5，所述质控线4设置于靠近吸水垫2的一端，所述检测线5设置于靠近所述样品垫7的一端，所述质控线4及检测线5上均吸附有标志物荧光微球，所述质控线4上固定有羊抗兔二抗，所述检测线5上固定有非洲猪瘟单克隆抗体；所述样品垫7靠近所述检测膜3的一端设置有用于固定非洲猪瘟单克隆体抗体标记物及兔多抗标记物的标记物区域6，其中，所述样品垫7为柠檬酸缓冲液浸泡垫，标记物区域6为吸附荧光微球标记的非洲猪瘟克隆抗体玻璃纤维，具体的，所述标记物区域6上固定有非洲猪瘟单克隆抗体标记物及兔多抗标记物。
26.其中，所述检测膜3为硝酸纤维素膜。
27.优选的，所述样品垫7采用玻璃棉制成，规格为1.5
×
30cm2长条；所述吸水垫2的制备方法为：将玻璃棉切成2.5
×
30 cm2的长条，将吸水垫置塑料袋，加干燥剂rt 密闭保存备用。
28.所述基板1为pvc材料制成，规格为7.5
×
30 cm2。
29.在本发明实施例中，将一株非洲猪瘟单克隆抗体固定在硝酸纤维素膜的检测线5位置，然后将羊抗兔二抗固定在硝酸纤维素膜的质控线4位置，当血清或口咽拭子样品浸泡或滴入试纸条的样品垫7后，通过毛细作用，血清样品溶液迅速湿透样品垫7，将样品垫7上的非洲猪瘟单克隆抗体标记物及兔多抗标记物溶解，并随着测试样向前泳动，如果样品中含有待测非洲猪瘟病毒抗原，则它就会和荧光微球标记的非洲猪瘟单克隆抗体标记物结合，形成抗体一抗原免疫复合物，最后被检测线5上另一株非洲猪瘟单克隆抗体捕获，形成抗体
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抗原
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抗体的免疫复合物，并在特定的激发波长下出现荧光条带，且荧光亮度与非洲猪瘟病毒抗原含量成正比；与羊抗兔二抗结合的荧光微球标记兔抗标记物继续向前层析与包被的羊抗兔二抗反应并被截留出现荧光条带，阴性结果表现为一条荧光条带，阳性结果为两条荧光条带，其结果通过荧光免疫层析仪测定。
30.进一步来说，所述质控线4标志物荧光微球大小为167nm，所述检测线5标志物荧光微球大小为300nm。
31.进一步来说，所述质控线4上的单抗包被浓度为0.5
‑
1.0 mg/ml，所述检测线5上的单抗包被浓度为0.5
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1.0 mg/ml，优选的，所述质控线4上的羊抗兔二抗浓度为1mg/ml。
32.非洲猪瘟病毒试纸实现了非洲猪瘟病毒快速检测，可有效的对感染非洲猪瘟病猪的血清样品及口咽拭子样品进行检测。本方法简单，可操作性强、成本低，能较好满足不同层次人员的需要，如基层疫病监测、出入境动物现场检疫、养殖场等，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
33.综上所述，本发明提供的非洲猪瘟病毒快速检测的荧光试纸特异性强，敏感性高：非洲猪瘟病毒荧光微球检测试纸以识别非洲猪瘟病毒的高亲和力配对单克隆抗体为基础制备而成，单克隆抗体的特异性强和敏感性高，荧光微球标记抗体具有较高的标记率；操作简便快速：使用快速检测试纸时无需任何其它试剂，只要将待检样品加入样品孔，在15分钟内即可判定检测结果；检测结果可通过便携式免疫荧光层析仪检测，同时进行准确定量。结果判定准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判；成本低，投资少：使用该检测试纸，不需另配其它试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快，实用性强。
34.作为本发明的又一实施例，请参阅图3
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9，本发明还提供了一种用于非洲猪瘟病毒检测的便携式免疫荧光层析仪，用于对所述非洲猪瘟病毒快速检测的荧光试纸进行测定，所述便携式免疫荧光层析仪包括：下箱体8及上箱体9，所述上箱体9套设在所述下箱体8外侧且可沿所述下箱体8滑动；层析仪15，所述层析仪15安装在所述下箱体8及上箱体9内，且所述层析仪15的操作端突出所述下箱体8的上端口；锁止机构，所述锁止机构安装在设置于所述上箱体9一侧端的内嵌槽16内，且与设置在所述下箱体8上的卡槽适配；盖体10，所述盖体10通过连接轴14转动安装在所述上箱体9远离所述下箱体8的一侧，且通过锁扣与所述上箱体9连接；按压楔形块12，所述按压楔形块12固定在所述上箱体9上，当上箱体9从水平状态转动到垂直状态时，所述按压楔形块12与所述锁止机构配合，以使所述锁止机构达到解锁
状态。
35.通过设置的下箱体8及上箱体9配合盖体10对层析仪15进行封装，可实现对层析仪15的有效保护，优选的，所述盖体10上铰接有把手11，通过设置的把手11方便拿持，从而便于携带。
36.当需要使用时，将盖体10与上箱体9上的锁扣打开，转动盖体10从水平方向到垂直方向，此时盖体10上的按压楔形块12将锁止机构打开，实现解锁，上箱体9与下箱体8之间的固定状态改变，随后可将上箱体9朝向下箱体8推动，使得层析仪15突出，无需将层析仪15取出后使用，使用便捷，实用性强。
37.进一步来说，所述锁止机构包括与所述卡槽适配的卡销组件及用于驱动所述卡销组件从所述卡槽内脱离或卡入所述卡槽的传动组件，其中，所述传动组件包括滑动安装在所述内嵌槽16内的活动杆17，所述活动杆17上固定有延伸板18，所述延伸板18通过弹簧19与所述内嵌槽16连接；所述活动杆17的一端固定有与所述按压楔形块12配合的活动楔形块13，且所述活动杆17朝向所述卡销组件的一侧设置有条形齿20，所述条形齿20与固定在所述卡销组件上的齿轮21啮合。
38.当按压楔形块12朝向活动楔形块13转动时使得活动楔形块13受到挤压力以带动活动杆17垂直向下移动，当活动杆17垂直向下移动时通过其上的条形齿20带动齿轮21转动，当齿轮21转动时带动卡销组件脱离卡槽，以实现上箱体9与下箱体8之间成自由状态，同时当活动杆17向下移动时通过限位板18的作用挤压弹簧19，当盖体10关闭时，活动楔形块13失去挤压力，此时弹簧19复位，带动活动杆17及活动楔形块13移动，并通过条形齿20及齿轮21的作用实现卡销组件重新卡入卡槽内，进而实现下箱体8与上箱体9的固定。
39.所述卡销组件包括转动安装在所述内嵌槽12内与所述齿轮21固定的螺纹套筒22及与所述卡槽适配的卡销23，所述卡销23接近所述螺纹套筒22的一端插放于所述螺纹套筒22内且与所述螺纹套筒22螺纹连接，所述卡销23远离所述螺纹套筒22的一端贯穿所述内嵌槽12且与所述内嵌槽12滑动连接。
40.当齿轮21转动时带动螺纹套筒22转动，由于卡销23与内嵌槽12滑动，从而使得卡销23在螺纹套筒22的作用下沿卡销23的轴向移动，从而实现卡销23脱离所述卡槽或朝向卡槽移动。
41.作为本发明的又一实施例，还提出了一种非洲猪瘟病毒快速检测方法，包括以下步骤：s1、非洲猪瘟病毒快速检测荧光试纸制备；s2、检测样品溶液的制备：采集猪的病变组织、病猪血清及拭子样品；s3、荧光试纸检测：将一株非洲猪瘟单克隆抗体固定在检测线5上，将羊抗兔二抗固定在质控线4上，随后将病变组织、病猪血清或拭子样品60μl滴入样品垫7上，静置10
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15min；s4、测定结果，采用免疫荧光层析仪对荧光试纸进行测定，阴性结果表现为检测线5上的荧光条带显现，阳性结果为检测线5及质控线4上的荧光条带均显现。
42.进一步来说，所述非洲猪瘟病毒快速检测荧光试纸制备包括以下步骤：s11、制备非洲猪瘟病毒p32免疫抗原；
s12、制备抗非洲猪瘟病毒的单克隆抗体、筛选识别非洲猪瘟病毒的配对单克隆抗体，识别非洲猪瘟病毒的单克隆抗体mab1 用于制备样品垫7上的标记物区域6，识别非洲猪瘟病毒的单克隆抗体mab2 用于制备检测线5；s13、制备羊抗兔igg 抗体pab1，用于制备质控线4，其中，羊抗兔igg多克隆抗体为商业化抗体，本技术对此不再进行赘述。
43.所述非洲猪瘟病毒p32免疫抗原的制备包括：以非洲猪瘟病毒经典毒株的p32基因构建重组载体，并对该基因序列进行密码子优化，转化至大肠杆菌bl21进行体外诱导表达24h，收取细菌培养液，4℃8000 r/min 低速离心30 min 去除培养液收集菌沉淀，利用his标签镍柱进行包涵体纯化，透析去除尿素并浓缩，测定蛋白浓度为5mg/ml。
44.其中，所述抗非洲猪瘟病毒的单克隆抗体的制备包括以下步骤：s21、建立杂交瘤细胞株：将非洲猪瘟病毒免疫抗原与magic mouse adjuvant免疫佐剂等量混合，充分乳化，以50mg
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100mg/只分别免疫balb/c系小鼠3次，每次间隔7天；第3次加强免疫后1天，尾静脉采血测效价，拉颈致死，无菌收集脾细胞；将脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞混合置37℃ 5% co2培养箱中培养。培养10天后，取杂交瘤细胞培养上清以elisa筛选阳性杂交瘤细胞。以p32蛋白包被96孔板；加待检细胞培养上清50μl/孔，酶标仪读取结果。选取强阳性、细胞生长旺盛的克隆孔进行连续3次有限稀释克隆化，扩大培养后冻存细胞，建立抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株33株。
45.s22、单克隆抗体的制备：以体内诱生腹水制备单抗。取经液体石蜡致敏的经产balb/c小鼠，腹腔注射对数生长期的杂交瘤细胞107个/只，7d后抽取腹水，离心后取上清，分装，冻存。
46.s23、鉴定单克隆体，具体为：单克隆抗体的抗体效价：以酶联免疫吸附实验（elisa）测定杂交瘤细胞培养上清和腹水的单抗效价；单克隆抗体的特异性：以elisa测定单抗与非洲猪瘟病毒p32蛋白的反应性，筛选获得识别非洲猪瘟病毒的配对单克隆抗体2株。
47.s24、纯化单克隆抗体：以亲和层析柱法从小鼠腹水中纯化单抗igg。以分光光度计法测定纯化单克隆抗体igg 的蛋白含量在1mg/ml以上，以elisa测定小鼠腹水和纯化igg的抗体效价在1:1000以上，分装，冻存，以得到抗非洲猪瘟病毒的单克隆抗体。
48.所述硝酸纤维素膜的制备：将硝酸纤维素检测膜切成2.5
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30 cm2的长条，置于xyz 3000喷点仪平台上，并以压条固定；用pbs（ph 7.2）将单抗mab2 igg稀释和羊抗兔igg溶液喷点于硝酸纤维素膜中央，制成t线、c线，检测线与质控线相距0.5cm ；室温自然干燥；将检测膜置塑料袋，加干燥剂4℃密闭保存备用。
49.实验例1快速诊断，采集病（死）猪、牛的病变组织，包括肺、肝、脾、肾、气管、小肠、大肠和淋巴结等，以1:5 或1:10 加适量pbs 或水进行简单研磨，制备待检溶液，以猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸按（14）操作方法进行检测和结果判定；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需以另取检测试纸重新检测。
50.实验例2外表健康及发热期病猪、牛检验检疫，采集外表健康猪、牛拭子（咽拭和肛拭）、粪
便或发热期血样，按上述非洲猪瘟病毒快速检测方法进行检测和结果判定，鉴别外表健康及发热期病猪。
51.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
52.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。