钩藤中四种生物碱含量的测定方法与流程

1.本发明属于药物分析技术领域，具体涉及钩藤中四种生物碱含量的测定方法。


背景技术：

2.钩藤作为传统中药，具有息风定惊、清热平肝的功效，用于肝风内动、惊痫抽搐、高热惊厥、感冒夹惊、小儿惊啼、妊娠子痫和头痛眩晕。钩藤为茜草科植物钩藤unacaria rhynchophylla(miq.)miq.ex havil.、大叶钩藤uncaria macrophylla wall.、毛钩藤uncaria hirsuta havil.、华钩藤uncaria sinensis(oliv.)havil.或无柄果钩藤uncaria sessilifructus roxb.的干燥带钩茎枝，其中以钩藤unacaria rhynchophylla(miq.)miq.ex havil.最常用。钩藤总碱是中药钩藤的重要活性成分，主要由钩藤碱、异钩藤碱为代表的吲哚类生物碱组成。钩藤碱、异钩藤碱为代表的吲哚类生物碱是钩藤质量控制的指标性成分。
3.目前，中药钩藤中四种生物碱—钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱和异柯诺辛碱的含量主要以高效液相色谱法配备以dad为主的各类检测器，或者串联质谱检测器进行测定。采用高效液相色谱法虽然具有较高准确性，但是需要以纯度高、价格昂贵的标准品制备工作曲线，再进行测定，且在测定前一般需要对样品进行前处理，测试过程也较为复杂，包括平衡仪器，制备工作曲线，样品测试等，总体测试时间长，试剂消耗多。
4.因此，亟需提供一种测定方法简单、耗时短、准确性高的，用于测定钩藤中四种生物碱含量的方法。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出钩藤中四种生物碱含量的测定方法，其测定方法简单、耗时短、准确性高。
6.本发明第一方面提供了钩藤中四种生物碱含量的测定方法。
7.所述钩藤中四种生物碱为钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱和异柯诺辛碱，其结构式如下：
8.钩藤碱的结构式：
[0009][0010]
异钩藤碱的结构式：
[0011][0012]
柯诺辛碱的结构式：
[0013][0014]
异柯诺辛碱的结构式：
[0015][0016]
具体的，钩藤中四种生物碱含量的测定方法，包括以下步骤：
[0017]
(1)取钩藤样品制备钩藤总碱供试液；
[0018]
(2)向步骤(1)制备的钩藤总碱供试液中加入内标物，然后装入核磁管内，进行定量核磁共振氢谱测试，分别对所述内标物和所述四种生物碱的选定信号进行积分；
[0019]
(3)利用公式c
x
＝100％
×
(s
x
×
m
i.s
×
m
x
)/(s
i.s
×
m
i.s
×
m
ta
)计算，分别得出待测生物碱在钩藤总碱中的含量；
[0020]
其中：c
x
是待测生物碱在钩藤总碱中的含量，
[0021]
s
x
和s
i.s
分别是所述钩藤样品中待测生物碱和内标物定量峰的积分面积，
[0022]
m
x
和m
i.s
分别是所述钩藤样品中待测生物碱和内标物定量峰的摩尔分子量(g/mol)，
[0023]
m
ta
和m
i.s
分别是所述钩藤样品中待测生物碱、钩藤总碱和内标物的质量(μg)。
[0024]
优选的，在步骤(1)中，制备钩藤总碱供试液的过程为：将钩藤样品粉碎，采用酸溶液提取，然后调节ph为碱性，再用有机溶剂萃取，干燥，制得钩藤总碱，最后将所述钩藤总碱溶于氘代溶剂中，制得钩藤总碱供试液。
[0025]
优选的，所述钩藤样品为含钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱和异柯诺辛碱的样品，包括但不限于中药钩藤。
[0026]
优选的，所述酸溶液为质量分数为0.5％
‑
2％的盐酸；进一步优选的，所述酸溶液为质量分数为0.8％
‑
1.5％的盐酸。
[0027]
优选的，所述碱性为ph值为8
‑
11；进一步优选的，所述碱性为ph值为9
‑
10。
[0028]
优选的，所述有机溶剂选自有机酸、酯、酸酯、烃的衍生物或醚中的至少一种；进一步优选的，所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿中的至少一种。
[0029]
优选的，所述氘代溶剂选自氘代苯、氘代乙腈、氘代丙酮、氘代二甲亚砜(dmso
‑
d6)或氘代吡啶中的一种；进一步优选的，所述氘代溶剂为氘代二甲亚砜(dmso
‑
d6)。通过选择溶解所述钩藤总碱的溶剂，能够优化出峰效果，使内标物与待测样品得到良好分离。
[0030]
优选的，在步骤(2)中，所述内标物为3,4,5
‑
三甲氧基苯甲醛。以3,4,5
‑
三甲氧基苯甲醛为内标物，其信号接近待测物定量信号而不重叠，解决了内标物与待测样品信号分离度的问题，同时避免因基线不一致导致的准确度问题。
[0031]
优选的，步骤(2)中所述选定信号为nh信号，并以所述nh信号为定量峰。以低场的nh信号为定量峰，能够有效解决钩藤碱类成分信号重叠的问题。
[0032]
优选的，在步骤(2)中，所述钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱和异柯诺辛碱的nh信号峰分别位于δ
h 10.11s、δ
h 10.32s、δ
h 10.13s、和δ
h 10.33s。
[0033]
优选的，在步骤(2)中，所述内标物的nh信号峰位于δ
h 9.88s。
[0034]
优选的，在步骤(2)中，当氘代溶剂为氘代二甲基亚砜时，所述钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱和异柯诺辛碱的nh信号峰分别位于δ
h 10.11s、δ
h 10.32s、δ
h 10.13s、和δ
h 10.33s。
[0035]
优选的，在步骤(2)中，采用t1ir脉冲确定各定量峰的纵向弛豫时间(t1值)，所述钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱和异柯诺辛碱的纵向弛豫时间分别为0.99s、0.99s、1.40s、1.11s，所述内标物的纵向弛豫时间为2.33s。通过所得定量的目标质子的纵向弛豫时间，在此基础上设置弛豫延迟时间(d1)等参数，确保了所建立定量方法的准确性。
[0036]
优选的，所述弛豫延迟时间为待测质子中最长t1的4
‑
6倍。
[0037]
优选的，在步骤(2)中，所述参数还包括弛豫延迟时间(d1)为8
‑
13s。设置合适的d1能够确保所有定量质子被激发后有充足时间达到磁化平衡(恢复到低能状态)，避免因弛豫时间不足而导致所测质子积分不足。
[0038]
优选的，在步骤(2)中，所述参数还包括设置扫描次数为32
‑
128次；进一步优选的，所述扫描次数为64次。增加扫描次数可提升1h nmr谱的信噪比，提升分析方法的精密度和灵敏度。
[0039]
优选的，在步骤(2)中，核磁共振波谱测试的参数为：偏转角(flip angle)＝90
°
，弛豫延迟时间(relaxation delay，d1)＝10s，时域数据长度(size of fid，td))＝65536，扫描次数(ns)＝64，谱宽(spectral width，sw)＝16.0221ppm，采样时间(acquisition time，aq)＝3.408s，探针温度(requested probe temperature，te)＝300k。
[0040]
本发明第二方面提供了上述测定方法在制备钩藤药物中的应用。
[0041]
所述钩藤药物为含钩藤、钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱和异柯诺辛碱的药物。
[0042]
制备钩藤药物包括但不限于对原料药质量的控制，制备过程中药物活性的分析，以及成品药质量的监控。
[0043]
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
[0044]
(1)本发明采用定量氢核磁分析技术对钩藤中四种生物碱含量进行测定，基于质子的响应而实现定量，质子信号的共振响应无选择性，不依赖于高纯度的标准对照品，该方法不需要以钩藤中四种生物碱的标准对照品制备工作曲线，使用已知普通化学物质为参比即可。该方法能够大大节省测试成本。
[0045]
(2)相比于高效液相色谱法及液质联用等定量技术，本发明提供的测定方法高效、
快速，样品前处理简单，不需要平衡仪器，单个样品测样时间一般在几分钟到十几分钟内，测试时间短。
[0046]
(3)采用本发明提供的测定方法测定钩藤中四种生物碱的含量，其测定结果具有良好的线性、灵敏度、精密度和准确度。
附图说明
[0047]
图1为实施例1中钩藤碱的1h
‑
nmr图；
[0048]
图2为实施例1中异钩藤碱的1h
‑
nmr图；
[0049]
图3为实施例1中柯诺辛碱的1h
‑
nmr图；
[0050]
图4为实施例1中异柯诺辛碱的1h
‑
nmr图；
[0051]
图5为实施例1中钩藤总碱的1h
‑
nmr图；
[0052]
图6为实施例1中钩藤总碱的hmbc谱。
具体实施方式
[0053]
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
[0054]
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
[0055]
实施例1：市售中药钩藤中四种指标性成分的测定
[0056]
将中药钩藤粉碎，称取10.0g，以100ml hcl(1％)超声提取30分钟，提取三次，合并提取液，以氨水调节ph至9
‑
10，用乙酸乙酯萃取三次。合并萃取液后，在旋转蒸发仪中减压蒸干溶剂得到总碱固体，总碱在氮吹仪中干燥过夜。
[0057]
精密称定取总碱30.0mg，定量加入3,4,5
‑
三甲氧基苯甲醛50μg，加入0.5ml dmso
‑
d6充分溶解，摇匀后进行采样。
[0058]
测试采用bruker avance iii 600mhz nmr仪配备超低温探头，核磁管采用norell 5mm st
‑
500
‑
7nmr型。使用bruker标准脉冲zg30，参数设置如下：flip angle＝90
°
，relaxation delay(d1)＝10s，size of fid(td)＝65536，number of scans(ns)＝64，spectral width(sw)＝16.0221ppm，acquisition time(aq)＝3.408s，requested probe temperature(te)＝300k。单个样品测试时间为14分钟。所得谱图通过布鲁克仪器自带的topspin 4.1.0进行数据处理，对选定的定量峰进行积分，通过以下公式计算待测物的含量。
[0059]
c
x
＝100％
×
(s
x
×
m
i.s
×
m
x
)/(s
i.s
×
m
i.s
×
m
ta
)计算，分别得出待测生物碱在钩藤总碱中的含量；
[0060]
其中：c
x
是待测生物碱在钩藤总碱中的含量，
[0061]
s
x
和s
i.s
分别是所述钩藤样品中待测生物碱和内标物定量峰的积分面积，
[0062]
m
x
和m
i.s
分别是所述钩藤样品中待测生物碱和内标物定量峰的摩尔分子量(g/mol)，
[0063]
m
ta
和m
i.s
分别是所述钩藤样品中待测生物碱、钩藤总碱和内标物的质量(μg)。
[0064]
钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱和异柯诺辛碱的1h
‑
nmr图如图1至图4所示。在dmso
‑
d6中，钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱和异柯诺辛碱的nh信号峰分别位于δ
h 10.11s、δ
h 10.32s、δ
h 10.13s、和δ
h 10.33s，未相互重叠，在总碱中也不与其它信号重叠。图5为钩藤总碱的1h
‑
nmr图，图5中数字1代表钩藤碱，数字2代表异钩藤碱，数字3代表柯诺辛碱，数字4代表异柯诺辛碱。此外，二维hmbc谱进一步显示以上nh具有专属性，可作为定量峰。为提高方法准确性，本实施例测试了采用t1ir脉冲确定各定量峰的t1值，钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱和异柯诺辛碱的t1值分别为0.99s、0.99s、1.40s、1.11s，内标物的t1值为2.33s。
[0065]
图6为钩藤总碱的hmbc谱(1h detected heteronuclear multiple bond correlation，1h的异核多键相关)。图6中数字1代表钩藤碱，数字2代表异钩藤碱，数字3代表柯诺辛碱，数字4代表异柯诺辛碱。通过hmbc谱所示相关交叉峰的归属，进一步确定各定量峰未与其他信号重叠，所选定量峰具有特异性。如钩藤碱的nh信号δ
h 10.11s下仅显示有四个hmbc相关，可分别归属为nh与c
‑
7(δ
c 55.2s)、c
‑
8(δ
c 133.8s)、c
‑
13(δ
c 141.9s)、和c
‑
2(δ
c 179.6s)的相关，未见其它杂质的相关峰，可进一步确定钩藤碱的nh信号未与其它信号重叠。
[0066]
采用lc
‑
ms验证氢核磁定量的结果，验证结果如表1所示。
[0067]
表1
[0068][0069]
结果表明，采用本发明提供的检测方法进行检测，检测得到的四种钩藤碱的含量与lc
‑
ms方法基本一致，其检测准确性高。但是相较于传统的高效液相类检测方法，本发明的提供的检测方法的前处理简单，不需要昂贵的标准对照品，检测成本更低。
[0070]
本实施例是以氘代二甲亚砜作为溶解钩藤总碱的溶剂，若替换为氘代苯、氘代乙腈、氘代丙酮或氘代吡啶，能够达到类似的效果。若选用其他溶剂则无法达到理想的分离效果，含量测定的准确度低，如采用氘代氯仿和氘代甲醇。
[0071]
实施例2：方法验证
[0072]
(1)线性范围
[0073]
配制6个不同不同浓度(25
‑
400μg/ml)的钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱和异柯诺辛碱对照品，一式三份，分别转移0.5ml至核磁管中，定量加入50μg内标，采用优化后的相同的实验参数和实验条件分别测1h nmr谱图。得到的谱图经数据处理得到各定量峰的积分结果，再根据公式可以得到各物质含量的测量值。以浓度为横坐标(c
x
)，待测物与内标定量峰峰面积的比值为纵坐标(s
x
/s
i.s
)，绘制标准曲线。通过相关系数r2评估待测物的线性。结果如表2所示，四个化合物的相关系数均大于0.999，展示了良好的线性。
[0074]
(2)灵敏度
[0075]
检测线(lod)根据信噪比s/n＝3来计算，通过稀释标准溶液得到待测物钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱和异柯诺辛碱的lod分别为10.2μg/ml、4.2μg/ml、5.1μg/ml和5.4μg/ml。定量限(loq)根据工作曲线下限来确定，待测物的loq均为25.0μg/ml。实验结果见表2，以上数据说明该方法具有良好的灵敏度。
[0076]
(3)日内精密度和日间精密度
[0077]
分别取三个不同的浓度水平(50μg/ml、100μg/ml和300μg/ml)平行配制三组溶液，再分别转移0.5ml至核磁管中测1h nmr谱图，一次测得的数据用于检验日内精密度，连续三天测得的数据用于检验日间精密度。实验结果见表2，日内精密度的rsd值范围为0.40％
‑
2.51％，日间精密度rsd范围为0.41％
‑
1.73％，说明该定量核磁方法具有良好精密度。
[0078]
(4)准确度
[0079]
采用在本实验，将80％、100％和120％三个浓度水平的对照品分别加入到一定量的钩藤总碱中，以此回收率的结果来检验该定量核磁方法的准确度，且每个浓度水平的溶液分别平行配制三组，再分别转移至0.5ml核磁管中测1h nmr谱图。实验结果见表2。从数据中可以看出，被定量的四个物质的回收率分别为在97.1％
‑
104.4％间。这说明该实验分析方法具有较好的准确度。
[0080]
表2
[0081] 1234线性(μg/ml)25
‑
40025
‑
40025
‑
40025
‑
400相关系数(r2)0.99950.99960.99940.9995lod(μg/ml)10.24.25.15.4loq(μg/ml)25.025.025.025.0日内精密度(rsd％)0.40
‑
1.380.85
‑
2.510.19
‑
0.861.22
‑
2.19日间精密度0.85
‑
1.731.01
‑
1.630.41
‑
1.530.99
‑
1.49会收录率(％)98.3
‑
103.699.5
‑
104.497.9
‑
103.597.1
‑
104.0