视网膜色素变性(RP)是遗传性视网膜营养不良的总称，在全球每3000-7000个人中估计就有1人受其影响。临床发作的特征在于暗(夜)视力受损，同时伴有视杆光感受器的故障和死亡。归因于中央视网膜中视锥光感受器的变性，随着这一过程的扩张，其会破坏周边视力并最终导致完全失明。在许多情况下，这一表型是由视杆光转导、结构或内稳态所必需的基因内的无效突变引起的，这就为这一光感受器亚型的丧失提供了直接的解释。然而，这些突变通常不能解释晚期疾病中视锥细胞的逐渐恶化。
所需要的是用于有需要的受试者的RP和其它眼部病症相关视网膜变性的治疗。
技术实现要素：
本发明通过以下实例进行说明，所述实例证明递送用于表达AKT的载体促进了光感受器数量、结构和视觉功能的显著保留。
在一个方面，一种腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包括AAV衣壳，所述AAV衣壳中衣壳化有载体基因组，所述载体基因组包括AAV反向末端重复(ITR)序列、人蛋白激酶B(AKT)编码序列和引导AKT在宿主细胞中的表达的表达控制序列。在一个实施例中，所述AKT编码序列包括AKT1、AKT2或AKT3编码序列。在一个实施例中，所述编码序列是SEQ ID NO：9。
在另一个方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载剂和至少AAV载体，所述AAV载体包括如本文所描述的AKT序列。
在另一个方面，提供了一种用于治疗视网膜变性的方法。所述方法包含向有需要的受试者施用如本文所描述的AAV载体。在一个实施例中，所述AAV载体是在视网膜下或玻璃体内施用的。
在另一个方面，提供了一种用于产生AAV载体的质粒。在某些实施例中，所述质粒包括SEQ ID NO：1的nt 1253到5070或SEQ ID NO：3的nt 1253到3868或与其共享至少80％的同一性的序列。
在又另一方面，提供了一种产生重组AAV(rAAV)的方法。所述方法包含在存在足以允许将基因表达盒病毒基因组包装到感染性AAV包膜或衣壳中的病毒序列的情况下培养包括SEQ ID NO：1的nt 1253到5070或SEQ ID NO：3的nt 1253到3868的包装细胞。
在另一个方面，提供了一种包含载体基因组的病毒载体，所述载体基因组包括SEQ ID NO：1的nt 1253到5070或SEQ ID NO：3的nt 1253到3868。
在另一个方面，病毒载体包含载体基因组，所述载体基因组包括5′ITR、CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、Kozak序列、AKT编码、bGH poly A和3′ITR。
在另一个方面，病毒载体包含载体基因组，所述载体基因组包括5′ITR、GRK1启动子、SV40内含子、Kozak序列、AKT编码序列、bGH poly A和3′ITR。
在另一个方面，提供了一种用于在用于治疗视网膜变性的方法中使用的组合物，其中所述组合物包含本文所提供的AAV载体。
根据本发明的以下详细描述，本发明的仍其它方面和优点将是显而易见的。
附图说明
图1A-图1H示出了AAV7m8载体的设计和表征。(图1A)载体表达盒的概要。与未经处理的对照相比，转导84-31细胞后的Rheb mRNA表达(图1B)和AKT3 mRNA表达(图1C)的量化。数据表示为平均值±SD(N＝3)。****P＜0.0001。(图1D)在AAV7m8.eGFP(2×109vg)的视网膜下递送后小鼠视网膜的代表性眼底图像。(图1E)视网膜下注射后AAV7m8的视网膜趋性。用针对AKT的抗体进行染色的未经处理的(图1F)和用AAV.AKT3(1×109vg)和AAV.eGFP(1×109vg)共注射(图1G-图1H)的PN45rd10视网膜铺片。
图2A-图2G示出caRheb增强未能减弱光感受器变性。(图2A)在PN13-14时视网膜下注射AAV.eGFP或AAV.caRheb(加AAV.eGFP)后，在PN45时的Pde6brd10视网膜横截面。(图2B)用AAV.eGFP、AAV.caRheb/AAV.eGFP处理或未经处理的Pde6brd10视网膜的总ONL厚度的量化。(图2C)用AAV.eGFP(2×109vg)单独处理或用AAV.eGFP(1×109vg)和AAV.caRheb(1×109vg)进行共注射处理的眼睛的每200μm GFP ONL细胞的量化。(图2D)用于评估视敏度的视动反射(OKR)右/左比率。不同治疗的混合的视杆-视锥A波幅(图2E)、混合的视杆-视锥B波振幅(图2F)和视锥B707波振幅(图2G)的视网膜电图(ERG)测量。数据表示平均值±SEM。指数以数据柱内的数值的形式指示。
图3A-图3H示出AKT3基因转移会促进光感受器存活和结构保留。在PN30时的用针对视紫红质(RHO)的抗体染色的未经处理(图3A)和用AAV.AKT3/AAV.eGFP处理(图3B)的Rd10小鼠视网膜的代表性图像。(图3C)与eGFP的共定位。在PN30时的用针对视锥抑制蛋白(CAR)的抗体染色的未经处理(图3D)和用AAV.AKT3/AAV.eGFP处理(图3E)的Rd10视网膜的代表性图像。(图3F)与eGFP的共定位。(图3G)在PN45时的未经处理的视网膜部分和视网膜下泡(subretinal bleb)之间的过渡区域的代表性图像。(图3H)在PN30和PN45时的治疗组之间的ONL厚度的量化。数据表示为平均值±SEM。**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001；n.s.(不显著)。
图4A-图4D示出了AKT3基因转移对Pde6brd10视网膜中视网膜和视觉功能的影响。(图4A)未经处理的和经AAV.eGFP处理和经AAV.AKT3处理的视网膜之间的混合的视杆-视锥a波振幅的评估。(图4B)治疗之间的混合的视杆视锥b波振幅的评估。(图4C)治疗组之间的明视(视锥)b波振幅。(图4D)通过视动反应(OKR)检查的右/左眼视敏度比率。右眼单独用AAV7m8.eGFP(2×109vg)进行处理或与AAV.AKT3组合进行处理，而左眼未经处理。数据表示平均值±SEM。*P＜0.05；***P＜0.001。指数由柱内的数值指示。
图5A-图5H示出了AKT3诱导的神经保护与mTOR激活相关联。(图5A)用AAV.AKT3/AAV.eGFP处理并用针对mTORC2激活标志物磷酸-AKTSer的抗体染色的Rd10视网膜的代表性图像。(图5B)与标记视网膜下递送的区域的eGFP的共定位。(图5C)用mTORC2标志物染色的AAV.AKT3/AAV.eGFP转导的切片的更高放大率。(图5D)单独用AAV.eGFP处理并用mTORC2标志物染色的Pde6brd10视网膜。(图5E)用AAV.AKT3/AAV.eGFP处理并针对典型的mTORC1激活标志物磷酸-S6Ser240/244染色的Pde6brd10视网膜的代表性图像。(图5F)与eGFP的共定位。(图5G)用mTORC1标志物染色的AAV.AKT3/AAV.eGFP转导的切片的更高放大率。(图5H)单独用AAV.eGFP处理并用mTORC1标志物染色的Pde6brd10视网膜。
图6A-图6I示出了AKT3过表达不会打破光感受器静态但会激活缪勒氏细胞。未经处理(图6A-图6C)、单独用AAV7m8.eGFP(2×109vg)处理(图6D-图6F)或用AAV7m8.AKT3(1×109vg)和AAV7m8.eGFP(1×109vg)共注射(图6G-图6I)的Pde6brd10视网膜横截面的代表性图像。切片用针对GFAP(缪勒氏细胞标志物)和Ki67(细胞增殖标志物)的抗体进行染色。
图7A-图7K示出了长期的AKT3基因转移会刺激野生型视网膜中的慢性Mfüller细胞胶质增生。在PN125时的未经处理(图7A-图7C)、用AAV7m8.eGFP(2×109vg)处理(图7D-图7F)和用AAV7m8.AKT3(1×109vg)和AAV7m8.eGFP(1×109vg)共注射(图7G-图7I)的野生型视网膜的代表性显微照片。切片用针对Ki67和GFAP的抗体进行染色。(图7J)未经处理的视网膜切片与经AAV.eGFP处理的视网膜切片之间的过渡区。(图7K)未经处理的区域与经AAV.AKT3/AAV.eGFP处理的区域之间的过渡区。
图8A-图8F示出了AKT3的光感受器特异性表达会介导Pde6brd10视网膜中的神经保护。(图8A)载体表达盒的描绘。AKT3转基因由光感受器特异性GRK1启动子调控。治疗组之间的混合的a波(图8B)、混合的b波(图8C)和视锥b波(图8D)的ERG反应的量化。(图8E)用AAV7m8.GRK1.AKT3(1×109vg)处理的PN45 Pde6brd10的代表性横截面。用AKT抗体标记的AKT3的光感受器特异性表达。(图8F)在PN45时治疗组之间的ONL厚度的量化。数据表示为平均值±SEM。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。
图9A-图9H示出了AAV.GRK1.AKT3不会刺激Pde6brd10视网膜中的反应性胶质增生。(图9A-图9C)在PN45时的用针对Müller细胞(GFAP)和细胞增殖(Ki67)的典型标志物染色的未经处理的小鼠视网膜的代表性图像。(图9D-图9F)用AAV7m8.GRK1.AKT3(1×109vg)和AAV7m8.eGFP(1×109vg)共处理的PN45 Pde6brd10视网膜的代表性显微照片。Pde6brd10视网膜的未经处理的部分与经注射的部分之间的过渡区域(图9G)和与eGFP示踪剂的共定位(图9H)。
图10A-图10B示出了AAV.caRheb在体外而非在光感受器中刺激mTORC1活性。(图10A)评估未经处理的或用AAV.eGFP或AAV.caRheb处理的84-31细胞的pS6Ser240/244、S6和GAPDH(上样对照)的表达的蛋白质印迹。数值指示每种处理条件的生物学重复。(图10B)单独用AAV7m8.eGFP(2×109vg)注射(顶部图区)或用AAV7m8.caRheb(1×109vg)和AAV7m8.eGFP(1×109vg)共注射(底部图区)并且用针对pS6Ser240/244的抗体染色的视网膜切片的代表性显微照片。
图11A-图11D示出了长期的AKT3基因转移会导致野生型动物的视网膜解体。C57B1/6(野生型)小鼠在PN13时接受视网膜下注射。(图11A-图11B)PN125时的视网膜组织学揭示了单独用AAV7m8.eGFP(2×109vg)处理的动物的正常光感受器结构。(图11C-图11D)用AAV7m8.eGFP(1×109vg)和AAV7m8.AKT3(1×109vg)的组合共注射的动物表现出视网膜层的广泛解体以及光感受器数量和结构的丧失。
图12示出了pAAV.CAG.Myr.HA.hAKT3(p1116)(SEQ ID NO：1)的载体图。
图13示出了pAAV.GRK1.Myr.HA.hAKT3(p1294)(SEQ ID NO：3)的载体图。
图14示出了p618.Hopt.AKT3(SEQ ID NO：5)的载体图。
图15A和图15B示出了hAKT3天然序列(SEQ ID NO：7)和hAKTopt序列(SEQ ID NO：13)的比对，并且图15C示出了比对的同一性矩阵百分比。
具体实施方式
本文描述了用于递送编码人蛋白激酶B(AKT)的核酸序列的具有AAV衣壳的重组复制缺陷型腺相关病毒(rAAV)载体和含有所述载体的组合物。还提供了这些组合物用于治疗眼部病症的用途。
如以下所描述的，在遗传性视力丧失的临床前模型中，使用常规基因增强策略刺激mTOR信号传导通路会延迟光感受器死亡并保留视觉功能。蛋白激酶B，也称为AKT1或RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过多种蛋白质靶标(包含p53、FoxO/FH转录因子和CREB)的磷酸化来负责细胞存活和生物合成应答。AKT由称为AKT激酶的3种密切相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1、AKT2和AKT3)构成，所述AKT激酶会调节许多细胞过程，包含代谢、增殖、存活、生长和血管生成。
如本文所使用的，术语“AKT”是指AKT1、AKT2或AKT3。术语“hAKT”是指人AKT的编码序列。在某些实施例中，AKT是指AKT1。在某些实施例中，AKT是指AKT2。在某些实施例中，AKT是指AKT3。进一步地，术语AKT在本文中用于指代蛋白质或编码所述蛋白质的核酸。hAKT1核酸序列可见于SEQ ID NO：9。hAKT1氨基酸序列可见于SEQ ID NO：10。hAKT2核酸序列可见于SEQ ID NO：11。hAKT2氨基酸序列可见于SEQ ID NO：12。hAKT3核酸序列可见于SEQ ID NO：7。hAKT3氨基酸序列可见于SEQ ID NO：8。在某些实施例中，hAKT编码序列是经工程化的序列，如可见于SEQ ID NO：13的hAKT3编码序列(有时称为“hAKTopt”)。
本文提供了编码hAKT的核酸序列。在一个实施例中，提供了编码可见于SEQ ID NO：10的hAKT1氨基酸序列的核酸。在另一个实施例中，提供了编码可见于SEQ ID NO：12的氨基酸序列的核酸。在又另一个实施例中，提供了编码可见于SEQ ID NO：8的hAKT3氨基序列的核酸序列。AKT的其它同种型是本领域已知的并且可用于本文/
本文描述了用于将编码人蛋白激酶B(AKT)的核酸递送到哺乳动物受试者以治疗眼部病症和与其相关联的视网膜变性的组合物和方法。在某些实施例中，此类组合物包含经工程化的AKT编码序列，如SEQ ID NO：13中提供的AKT编码序列。与使用天然序列可以产生的水平相比，预计转基因盒的这一优化将最大化实验蛋白的产生水平。然而，本文还涵盖了包含如分别在以下中提供的天然AKT1、AKT2或AKT3编码序列的组合物：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：7。应当理解，当针对AKT1、AKT2和AKT3中的任何一个描述实施例时，旨在针对其中的其它AKT叙述类似实施例。
本文所使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员和参照公开文本所通常理解的相同含义，这为本领域的技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指南。本说明书中含有的定义是为了清楚地描述本文的组分和组合物而提供的，而并非旨在限制要求保护的发明。
如本文所使用的，本文使用的术语“受试者”意指哺乳动物，包含人、兽医或农场动物、家畜或宠物以及通常用于临床研究的动物。在一个实施例中，这些方法和组合物的受试者是人。仍其它合适的受试者包含但不限于鼠、大鼠、犬、猫、猪、牛、绵羊、非人灵长类动物等。如本文所使用的，术语“受试者”可与“患者”互换使用。
在一个实施例中，所述受试者是儿童，即18岁以下。在另一个实施例中，所述受试者是年轻儿童，即8岁或以下。在另一个实施例中，所述受试者是学步的儿童，即3岁或以下。在又另一个实施例中，所述受试者是幼儿，即1岁或以下。在又另一个实施例中，所述受试者是新生儿或婴儿，即一个月大或更小。在另一个实施例中，所述受试者是成年人，即年龄或以上。在又另一个实施例中，所述受试者是中老年人，即35岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁或以上。
在本发明的某些实施例中，受试者患有“眼部病症”，本发明的组分、组合物和方法被设计成治疗所述眼部病症。在某些实施例中，受试者患有视网膜变性或有视网膜变性的风险，所述视网膜变性可能与或可能不与眼部病症相关联。如本文所使用的，“眼部病症”包含视锥-视杆营养不良和视网膜疾病，所述视锥-视杆营养不良和视网膜疾病包含但不限于Stargardt病(常染色体显性或常染色体隐性)、视网膜色素变性和图形性营养不良(pattern dystrophy)。在一个实施例中，受试者患有视网膜色素变性。在一个实施例中，受试者患有全色盲。在另一个实施例中，受试者患有无脉络膜症或X-连锁遗传视网膜变性。在另一个实施例中，受试者患有与眼部病症相关联的视网膜变性。在另一个实施例中，受试者患有不与眼部病症相关联的视网膜变性。此类眼部疾病的临床征象包含但不限于周边视力下降、中央(阅读)视力下降、夜间视力下降、颜色感知丧失、视敏度下降、光感受器功能下降、色素变化和最终失明。
视网膜变性是一种视网膜病变，所述视网膜病变在于由视网膜细胞逐渐死亡引起的视网膜退化。视网膜变性有多种原因，包含动脉或静脉阻塞、糖尿病视网膜病变、R.L.F./R.O.P.(晶状体后纤维增生/早产儿视网膜病变)或疾病(通常是遗传性的)。视网膜变性的征象和症状包含但不限于视力受损、夜盲症、视网膜脱离、光敏感、管状视力和周边视力丧失到视力的完全丧失。视网膜变性和重塑涵盖分子、细胞和组织水平的一组病状，所述病状由如视网膜色素变性(RP)等遗传性视网膜疾病、如年龄相关性黄斑变性(AMD)等遗传和环境疾病以及其它的对眼睛/视网膜的伤害(包含外伤和视网膜脱离)引发。这些视网膜变化和明显的可塑性导致神经元重新布线和重新编程事件，所述事件包含基因表达的改变、重新神经突生成以及新突触的形成，这通过树突树的改变和多余的轴突生长在双极细胞中产生了破坏性回路。另外，神经元迁移沿Müller细胞列在整个视网膜的竖直轴上发生，从而表明代谢信号改变，并且视网膜色素上皮(RPE)侵入视网膜，从而形成色素骨针，这是RP疾病的经典临床观察(参见例如Bryan William Jones、Robert E.Marc和Rebecca L.Pfeiffer的《视网膜变性、重塑和可塑性(Retinal Degeneration，Remodeling and Plasticity)》)。
如本文所使用的，术语“治疗”是指所使用的赋予受试者益处的任何方法，即所述方法可以减轻眼部疾病、病症或病状的一种或多种症状或方面、延迟所述一种或多种症状或方面的发作、降低所述一种或多种症状或方面的严重性或发生率、或产生对所述一种或多种症状或方面的预防。出于本发明的目的，治疗可以在症状发作之前、期间和/或之后施用。在某些实施例中，治疗发生在受试者接受常规疗法之后。如本文所使用的，术语“治疗”包含消除、基本上抑制、减缓或逆转病状的进展，基本上改善病状的临床或美学症状，或基本上预防病状的临床或美学症状的出现，或降低由眼部疾病、病症或病状引起的一种或多种症状的严重性和/或频率。
如本文参考核酸或氨基酸序列或蛋白质所使用的术语“外源性”意指所述核酸或氨基酸序列或蛋白质并非天然存在于其在染色体或宿主细胞中存在的位置。外源性核酸序列还指源自相同宿主细胞或受试者并插入到所述相同宿主细胞或受试者中的序列，但其以非天然状态存在，例如，不同的拷贝数或在不同调控元件的控制下。
如用于描述核酸序列或蛋白质的术语“异源性”意指核酸或蛋白质源自与在其中表达所述核酸或蛋白质的宿主细胞或受试者不同的生物体或相同的生物体的不同物种。术语“异源性”当参考质粒、表达盒或载体中的蛋白质或核酸使用时表明蛋白质或核酸与另一序列或子序列一起存在，在自然界中未发现所讨论蛋白质或核酸与所述蛋白质或核酸间的相同关系。
在核酸序列的上下文中，术语“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“相同百分比”是指两个序列中的残基在比对以获得最大对应性时是相同的。序列同一性比较的长度可以超过AKT编码序列的全长或可以是至少约100到150个核苷酸的片段，或可以是如所期望的。然而，也可能期望较小片段之间的同一性，例如至少约九个核苷酸，通常至少约20到24个核苷酸、至少约28到32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸。多个序列比对程序也可用于核酸序列。此类程序的实例包含“Clustal W”、“CAP序列组装”、“BLAST”、“MAP”和“MEME”，这些程序可通过因特网上的Web服务器进行访问。此类程序的其它来源是本领域技术人员已知的。可替代地，也使用了载体NTI实用程序。本领域已知的许多算法可以用于测量核苷酸序列同一性，包含上述程序中包含的那些。作为另一个实例，可以使用GCG 6.1版本的程序FastaTM比较多核苷酸序列。也可以使用常用的序列分析软件，更具体地BLAST或由公共数据库提供的分析工具。类似地，对于氨基酸序列，在蛋白质的全长或其片段上，可以容易地确定“序列同一性百分比”等。合适地，片段长度为至少约8个氨基酸，并且可以高达约450个氨基酸。
术语“分离的”意指将材料从其原始环境(例如，如果其天然存在的话，自然环境)中去除。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但是从天然系统中的一些或全部共存材料分离的相同的多核苷酸或多肽是分离的，即使后来被重新引入到自然系统中。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为此类载体或组合物不是其天然环境的一部分。
“经工程化”意指编码本文所描述的AKT蛋白的核酸序列被组装并置于任何合适的遗传元件中，所述遗传元件例如裸DNA、噬菌体、转座子、粘粒、附加体等，所述遗传元件将其中含有的AKT序列转移到宿主细胞，例如用于产生非病毒递送系统(例如，基于RNA的系统、裸DNA等)或用于在包装宿主细胞中产生病毒载体和/或用于递送到受试者的宿主细胞。在一个实施例中，所述遗传元件是质粒。用于制备此类经工程化的构建体的方法对核酸操纵技术人员而言是已知的并且包含基因工程、重组工程以及合成技术。参见例如Green和Sambrook，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，纽约市冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)(2012)。
如本文所使用的，术语“转基因”是指在本说明书中描述的表达盒、rAAV基因组、重组质粒或生产质粒、载体或宿主细胞中的启动子或表达控制序列的控制下的外源性或经工程化的蛋白质编码核酸序列。在某些实施例中，所述转基因是人蛋白激酶B(AKT)序列，所述序列编码功能性AKT蛋白。在一些实施例中，所述转基因是编码SEQ ID NO：8中所示的AKT氨基酸序列的核酸。在某些实施例中，所述转基因由SEQ ID NO：7中所示的序列编码。在一些实施例中，所述转基因是编码SEQ ID NO：10中所示的AKT氨基酸序列的核酸。在某些实施例中，所述转基因由SEQ ID NO：9中所示的序列编码。在一些实施例中，所述转基因是编码SEQ ID NO：12中所示的AKT氨基酸序列的核酸。在某些实施例中，所述转基因由SEQ ID NO：11中所示的序列编码。在某些实施例中，所述转基因由SEQ ID NO：13中所示的序列编码。在某些实施例中，所述转基因是经工程化的AKT编码序列，所述序列是与SEQ ID NO：7、9、11或13共享至少70％同一性的序列。例如，SEQ ID NO：13与SEQ ID NO：7共享约75％同一性(参见图15A-图15C中提供的比对和同一性矩阵百分比)。如本文所描述的，本发明考虑了对天然序列的进一步修饰。
在一个实施例中，编码AKT的核酸序列进一步包括编码与AKT共价连接的标签多肽的核酸。标签多肽可以选自已知的“表位标签”，所述表位标签包含但不限于myc标签多肽、谷胱甘肽-S-转移酶标签多肽、绿色荧光蛋白标签多肽、myc-丙酮酸激酶标签多肽、His6标签多肽、流感病毒血凝素标签多肽、flag标签多肽、myr(豆蔻酰化)多肽和麦芽糖结合蛋白标签多肽。在一个实施例中，所述核酸序列包含MYR标签，如见于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。
如本文所使用的，“载体”是一种核酸分子，所述核酸分子中可以插入有外源性或异源性或经工程化的核酸转基因，然后可以将所述核酸分子引入适当的宿主细胞中。载体优选地具有一个或多个复制起点以及重组DNA可以插入到的一个或多个位点。载体通常具有方便的装置，通过所述装置，可以从没有载体的细胞中选择具有载体的细胞，例如，所述载体对耐药基因进行编码。常见的载体包含质粒、病毒基因组和(主要在酵母和细菌中)“人工染色体”。本文描述了某些质粒。
“病毒载体”被定义为含有外源性或异源性AKT核酸转基因的复制缺陷型病毒。在一个实施例中，如本文所描述的表达盒可以被工程化到用于递送到宿主细胞和/或用于产生病毒载体的质粒上。合适的病毒载体优选地是复制缺陷型的并且选自靶向眼部细胞的那些载体。病毒载体可以包含任何适用于基因疗法的病毒，包含但不限于：腺病毒；疱疹病毒；慢病毒；逆转录病毒；细小病毒等；然而，为了便于理解，本文将腺相关病毒称为示例性病毒载体。
“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指其中含有所关注的基因的表达盒包装在病毒衣壳或包膜中的合成或重组病毒颗粒，其中也包装在病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列均是复制缺陷型的；即，其不能产生子代病毒粒子，但保留了感染靶细胞的能力。在一个实施例中，病毒载体的基因组不包含对复制所需的酶进行编码的基因(基因组可以被工程化成“无肠的(gutless)”-仅含有所关注的转基因，其侧接扩增和包装人工基因组所需的信号)，但是这些基因可以在产生期间供应。因此，这被认为可以安全地用于基因疗法，因为除非存在复制所需的病毒酶，否则不会发生通过子代病毒粒子进行的复制和感染。
在仍另一个实施例中，所述表达盒(包含本文所描述的表达盒中的任何表达盒)用于产生重组AAV基因组。
如本文所使用的，术语“宿主细胞”可以指其中重组AAV由生产质粒产生的包装细胞系。在替代方案中，术语“宿主细胞”可以指其中需要转基因表达的任何靶细胞。因此，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，所述原核或真核细胞含有通过任何方式(例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、转化、病毒感染、转染、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的团粒、病毒感染和原生质体融合)引入到细胞中的外源性或异源性DNA。在本文中的某些实施例中，术语“宿主细胞”是指用于体外评估本文所描述的组合物的各种哺乳动物物种的眼部细胞的培养物。在又其它实施例中，术语“宿主细胞”旨在指代在体内接受眼部疾病治疗的受试者的眼部细胞。
如本文所使用的，术语“眼部细胞”是指眼睛中的或与眼睛功能相关联的任何细胞。所述术语可以指以下中的任一种：感光细胞(包含视杆感光细胞、视锥感光细胞和光敏神经节细胞)、视网膜色素上皮(RPE)细胞、Mueller细胞、脉络膜细胞、双极细胞、水平细胞和无长突细胞。在一个实施例中，眼部细胞是感光细胞。在另一个实施例中，眼部细胞是RPE细胞。
根据本领域技术人员熟悉的标准命名惯例，“质粒”在本文中通常由前面和/或后面有大写字母和/或数字的小写p指定。可以根据本发明而使用的许多质粒和其它克隆和表达载体是本领域技术人员所熟知的并且容易获得的。此外，技术人员可以容易地构建适用于本发明的任意数量的其它质粒。本发明中的此类质粒以及其它载体的性质、构建和用途对于本公开的技术人员来说将是显而易见的。
如本文所使用的，术语“转录控制序列”或“表达控制序列”是指DNA序列，如起始子序列、增强子序列或启动子序列，所述DNA序列诱导、抑制或以其它方式控制与其可操作地连接的蛋白质编码核酸序列的转录。
如本文所使用的，术语“可操作地连接”或“操作性地关联”是指与对AKT进行编码的核酸序列邻接的表达控制序列和/或以反式或在远处起作用以控制其转录和表达的表达控制序列两者。
如本文所使用的，术语“AAV”或“AAV血清型”是指数十种天然存在且可用的腺相关病毒，以及人工AAV。在从人或非人灵长类动物(NHP)中分离或工程化以及良好表征的AAV中，人AAV2是第一个被开发为基因转移载体的AAV；其已被广泛用于不同靶组织和动物模型中的高效基因转移实验。除非另有说明，否则本文所描述的AAV衣壳、ITR和其它所选AAV组分可以容易地选自任何AAV，包含但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8和AAVAnc80、任何已知或提及的AAV的变体、或尚未发现的AAV或其变体或混合物。参见例如WO 2005/033321，其通过引用并入本文。在另一个实施例中，所述AAV衣壳是优先靶向双极细胞的AAV8bp衣壳。参见WO 2014/024282，其通过引用并入本文。在某些实施例中，所述AAV衣壳是AAV7m8衣壳，已证明所述衣壳优先递送到外层视网膜。参见Dalkara等人，用于从玻璃体进行治疗性外层视网膜基因递送的新腺相关病毒的体内导向进化(In Vivo-Directed Evolution of a New Adeno-Associated Virus for Therapeutic Outer Retinal Gene Delivery from the Vitreous)，《科学转化医学(Sci Transl Med)》5，189ra76(2013)，所述文献通过引用并入本文。在一个实施例中，所述AAV衣壳是AAV8衣壳。在另一个实施例中，所述AAV衣壳是AAV9衣壳。在另一个实施例中，所述AAV衣壳是AAV5衣壳。在另一个实施例中，所述AAV衣壳是AAV2衣壳。
如本文所使用的，当指代AAV时，术语“变体”意指源自已知AAV序列的任何AAV序列，包含与氨基酸或核酸序列共享至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或更高的序列同一性的AAV序列。在另一个实施例中，所述AAV衣壳包含变体，所述变体可以包含与任何描述或已知的AAV衣壳序列高达约10％变化。换句话说，所述AAV衣壳与本文所提供的和/或本领域已知的AAV衣壳共享约90％的同一性到约99.9％的同一性、约95％到约99％的同一性或约97％到约98％的同一性。在一个实施例中，所述AAV衣壳与AAV衣壳共享至少95％的同一性。当确定AAV衣壳的同一性百分比时，可以对任何可变蛋白质(例如，vp1、vp2或vp3)进行比较。在一个实施例中，所述AAV衣壳与AAV8 vp3共享至少95％的同一性。在另一个实施例中，所述AAV衣壳与AAV2衣壳共享至少95％的同一性。在另一个实施例中，使用了自身互补AAV衣壳。
ITR或其它AAV组分可以使用本领域技术人员可用的技术从AAV中容易地分离出来或进行工程化。此类AAV可以从学术、商业或公共来源分离、工程化或获得(例如，维吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA))。可替代地，AAV序列可以通过合成或其它适合的方式通过参考公开的序列(如在文献中或在如GenBank、PubMed等数据库中可获得的公开的序列)进行工程化。AAV病毒可以通过常规的分子生物学技术进行工程化，从而可以优化这些颗粒以用于核酸序列的细胞特异性递送、用于最小化免疫原性、用于调节稳定性和颗粒寿命、用于高效降解、用于准确递送到细胞核等。
如本文所使用的，“人工AAV”意指但不限于具有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。此类人工衣壳可以通过任何合适的技术使用所选AAV序列(例如，vp1衣壳蛋白的片段)与异源序列的组合产生，所述异源序列可以从不同的所选AAV、同一AAV的非连续部分、从非AAV病毒来源或从非病毒来源获得。人工AAV可以是但不限于假型AAV、嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。假型载体可用于本发明中，其中一个AAV的衣壳被异源衣壳蛋白替代。在一个实施例中，AAV2/5和AAV2/7m8是示例性假型载体。
“自身互补AAV”指的是具有其中重组AAV核酸序列携带的编码区域已经被设计为形成分子内双链DNA模板的表达盒的质粒或载体。感染后，未等待细胞介导的第二条链合成，而是两条互补的半scAAV将缔合以形成易于立即复制和转录的一条双链DNA(dsDNA)。参见例如D M McCarty等人，“自身互补重组腺相关病毒(scAAV)载体独立于DNA合成而促进高效转导(Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis)”，《基因疗法》，(2001年8月)，第8卷，第16期，第1248-1254页。自身互补AAV在例如美国专利第6,596,535号；第7,125,717号；和第7,456,683号中描述，这些美国专利中的每个美国专利通过引用整体并入本文中。
“施用”或“施用途径”包含适合于递送所选组合物并且可以将有效量递送到由眼部疾病表征的所选靶细胞的任何已知的施用途径。可用于本发明的方法的施用途径包含以下中的一种或多种：口服、肠胃外、静脉内、鼻内、舌下、眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、通过贮库调配物或装置、通过滴眼剂、通过吸入。在某些实施例中，所述方法涉及通过视网膜下注射将所述组合物递送到RPE、感光细胞和/或其它眼部细胞。在某些实施例中，采用玻璃体内注射到眼部细胞。在又其它实施例中，采用通过眼睑静脉注射到眼部细胞。鉴于本公开，本领域技术人员可以选择其它施用方法。如果需要，可以组合施用途径。在一些实施例中，定期重复施用。本文所描述的药物组合物被设计成用于通过任何合适的途径或不同途径的组合递送到有需要的受试者。本文所描述的核酸分子和/或载体可以以单一组合物或多种组合物的方式递送。任选地，可以递送两种或更多种不同的AAV，或多种病毒[参见例如WO202011/126808和WO 2013/049493]。在另一个实施例中，多种病毒可以含有单独的或与蛋白质组合的不同的复制缺陷型病毒(例如，AAV和腺病毒)。
本文所描述的某些组合物是分离的或合成地或重组地工程化的核酸序列，所述核酸序列提供编码人AKT的序列。在一个实施例中，提供了编码人AKT的分离的或经工程化的核酸序列。在某些实施例中，所述序列包含一个或多个另外的限制位点以允许添加如表位标签等标志物。当与天然核酸序列比对时，编码AKT的经工程化的序列可以具有至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％的同一性百分比，包含任何这些范围之间的任何整数。在一个实施例中，编码AKT的经工程化的序列与天然序列的同一性百分比为至少51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
提供了多种表达盒，所述表达盒采用SEQ ID NO：7来表达AKT蛋白。在一个实施例中，含有此类表达盒的质粒的实例示出于SEQ ID NO：1。在一个实施例中，含有此类表达盒的质粒的实例示出于SEQ ID NO：3。在另一个实施例中，所述表达盒不包含Myr标签。采用SEQ ID NO：13来表达AKT蛋白的表达盒示出于SEQ ID NO：5。
如本文所使用的，“表达盒”是指包括AKT蛋白的编码序列、启动子并可以包含其的其它调控序列的核酸分子，所述盒可以被工程化到遗传元件或质粒中和/或包装到病毒载体(例如，病毒颗粒)的衣壳中。在一个实施例中，表达盒包括编码AKT的经工程化的核酸序列。在一个实施例中，所述表达盒包含与表达控制序列操作性地连接的AKT编码序列，所述表达控制序列引导AKT编码序列和/或基因产物在宿主细胞中的表达。
“重组AAV”或“rAAV”是含有两个元件的DNAse抗性病毒颗粒，所述两个元件即AAV衣壳和至少含有包装在AAV衣壳内的非AAV编码序列的载体基因组。除非另有说明，否则此术语可以与短语“rAAV载体”互换使用。rAAV是“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”，因为其缺少任何功能性AAV rep基因或功能性AAV cap基因并且不能产生子代。在某些实施例中，仅AAV序列是AAV反向末端重复序列(ITR)，通常定位在载体基因组的5′和3′最末端处，以允许定位在ITR之间的基因和调控序列包装在AAV衣壳内。
如本文所使用的，“载体基因组”是指包装在形成病毒颗粒的rAAV衣壳内部的核酸序列。此类核酸序列含有AAV反向末端重复序列(ITR)。在本文的实例中，载体基因组至少含有从5′到3′的AAV 5′ITR、编码序列和AAV 3′ITR。可以选择来自AAV2(与所述衣壳来源不同的AAV)的ITR或非全长ITR。在某些实施例中，ITR来自与在产生或反式补充AAV期间提供rep功能的AAV来源相同的AAV。进一步地，可以使用其它ITR。进一步地，载体基因组含有引导基因产物表达的调控序列。
本领域已知各种质粒可用于产生rAAV载体，并且可用于本文所描述的组合物和方法。将生产质粒在表达AAV cap和/或rep蛋白的宿主细胞中培养。在宿主细胞中，每个rAAV基因组被拯救并被包装到衣壳蛋白或包膜蛋白中，以形成感染性病毒颗粒。在一个实施例中，生产质粒是本文所描述或WO2012/158757中所描述的生产质粒，所述文献通过引用并入本文。
一种类型的生产质粒是SEQ ID NO：1和图12中示出的生产质粒，所述生产质粒被称为pAAV.CAG.myr.hAKT3。另一种生产质粒在SEQ ID NO：2和图13中示出。又另一种生产质粒在SEQ ID NO：3和图14中示出。此类质粒是含有以下的质粒：5′AAV ITR序列；所选启动子；polyA序列；和3′ITR。在所选启动子与polyA序列之间插入编码AKT的核酸序列。在某些实施例中，所述生产质粒被修饰成优化载体质粒产生效率。本文考虑了此类修饰。在其它实施例中，终止子和其它序列包含在所述质粒中。
在仍另外的实施例中，提供了用于递送本文所描述的AKT构建体和序列的重组腺相关病毒(AAV)载体。所述AAV载体包含AAV衣壳和核酸序列，所述核酸序列包括AAV反向末端重复(ITR)序列和编码人蛋白激酶B(AKT)的核酸序列以及引导AKT在宿主细胞中表达的表达控制序列。腺相关病毒(AAV)病毒载体是具有AAV蛋白衣壳的AAV DNase抗性颗粒，所述AAV蛋白衣壳中包装有用于递送到靶细胞的核酸序列。AAV衣壳由60个衣壳(cap)蛋白亚基VP1、VP2和VP3构成，其以二十面体对称布置，比率为大约1∶1∶10到1∶1∶20，具体取决于所选AAV。可以选择AAV作为如上文所识别的AAV病毒载体的衣壳的来源。在一些实施例中，可以通过上述AAV衣壳或其编码核酸中的一个的诱变(即，通过插入、缺失或取代)来产生用于病毒载体的AAV衣壳。在一些实施例中，所述AAV衣壳是嵌合的，包括来自上述AAV衣壳蛋白中的两种或三种或四种或更多种AAV衣壳蛋白的结构域。在一些实施例中，所述AAV衣壳是来自两种或三种不同的AAV或重组AAV的vpl单体、vp2单体和vp3单体的嵌合体。在一些实施例中，rAAV组合物包括多于一种上述衣壳蛋白。
为了将表达盒或rAAV基因组或生产质粒包装到病毒粒子中，ITR是在与转基因相同的构建体中需要呈顺式的唯一AAV组件。在一个实施例中，用于复制(rep)和/或衣壳(cap)的编码序列从AAV基因组中移除并以反式供应或由包装细胞系供应，以产生AAV载体。例如，如以上所描述的，假型AAV可以含有来自与AAV衣壳的来源不同的来源的ITR。另外地或可替代地，使用了嵌合AAV衣壳。可以选择仍其它的AAV组件。此类AAV序列的来源在本文中有所描述并且还可以从学术、商业或公共来源分离或工程化获得(例如，维吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心)。可替代地，AAV序列可以通过合成或其它适合的方式通过参考公开的序列(如在文献中或在如例如等数据库中可获得的公开的序列)而获得。
用于产生和分离适合于向受试者递送的AAV病毒载体的方法是本领域已知的。参见例如美国专利7790449；美国专利7282199；WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；和US 7588772 B2。在一个系统中，用编码侧接有ITR的转基因的构建体和编码rep和cap的构建体瞬时转染生产细胞系。在第二系统中，用编码侧接有ITR的转基因的构建体瞬时转染稳定供应rep和cap的包装细胞系。在这些系统的每种系统中，响应于用辅助腺病毒或疱疹病毒感染而产生AAV病毒粒子，从而需要从污染的病毒中分离rAAV。最近，已开发了不需要用辅助病毒感染来回收AAV的系统-通过所述系统还反式地提供需要的辅助功能(即，腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29、以及疱疹病毒聚合酶)。在这些较新的系统中，可以通过用编码需要的辅助功能的构建体瞬时转染系统来提供辅助功能，或者所述细胞可以被工程化成稳定地含有编码辅助功能的基因，所述基因的表达可以被控制在转录水平或转录后水平下。
在又另一个系统中，通过用基于杆状病毒的载体进行感染来将侧接有ITR的转基因和rep/cap基因引入到昆虫细胞中。关于这些产生系统的综述，通常参见例如Zhang等人，2009，“用于大规模重组腺相关病毒产生的腺病毒-腺相关病毒杂合体(Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production)”，《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》20：922-929，所述参考文献的内容以全文引用的方式并入本文中。在以下美国专利中也描述了制备和使用这些及其它AAV产生系统的方法，所述美国专利中的每个美国专利的内容通过引用整体并入本文中：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；和7,439,065。通常参见例如Grieger和Samulski，2005，“腺相关病毒作为基因疗法载体：载体研发、产生及临床应用(Adeno-associated virus as a gene therapy vector：Vector development，production and clinical applications)”，《生物化学工程/生物技术进展(Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.)》99：119-145；Buning等人，2008，“腺相关病毒载体技术的最新进展(Recent developments in adeno-associated virus vector technology)”，《基因医学杂志(J.Gene Med.)》10：717-733；以及下文引用的参考文献，这些参考文献中的每个参考文献通过引用整体并入本文中。
用于构建本发明的任何实施例的方法对核酸操纵技术人员是已知的并且包含基因工程、重组工程以及合成技术。参见例如Green和Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，纽约市冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)(2012)。类似地，产生rAAV病毒粒子的方法是众所周知的并且对合适的方法的选择不是对本发明的限制。参见例如K.Fisher等人，(1993)《病毒学杂志(J.Virol.)》，70：520-532和美国专利第5,478,745号。
本文提供的rAAV载体包含AAV衣壳和具有编码AKT的序列的AAV表达盒，如以上描述的那些。在某些实施例中，所述rAAV表达盒包括AAV反向末端重复序列和编码AKT的核酸序列以及引导经编码的蛋白质在宿主细胞中的表达的表达控制序列。在其它实施例中，所述rAAV表达盒进一步包括内含子、Kozak序列、polyA和转录后调控元件中的一个或多个。在用于递送到眼睛的药物组合物中使用的此类rAAV载体可以采用来自许多已知AAV中的任一种AAV的衣壳，所述已知AAV包含本文所描述的那些。
本文提供的表达盒和载体的其它常规组分可以使用本领域已知的技术针对特定物种进行优化，所述技术包含例如密码子优化，如本文所述的。本文所描述的盒、载体、质粒、病毒或其它组合物的组分包含作为表达控制序列的一部分的启动子序列。在另一个实施例中，所述启动子是细胞特异性的。术语“细胞特异性”意指为重组载体所选择的特定启动子可以引导AKT转基因在一种或多种特定眼部细胞类型中的表达。在一个实施例中，所述启动子对转基因在感光细胞中的表达具有特异性。在另一个实施例中，所述启动子对视杆细胞和视锥细胞中的表达具有特异性。在另一个实施例中，所述启动子对视杆细胞中的表达具有特异性。在另一个实施例中，所述启动子对视锥细胞中的表达具有特异性。在一个实施例中，所述光感受器特异性启动子是人视紫红质激酶启动子。视紫红质激酶启动子已被证明在视杆细胞和视锥细胞中均有活性。参见例如Sun等人，“利用靶向视杆细胞和视锥细胞两者的启动子的基因疗法挽救由AIPL1突变引起的视网膜变性(Gene Therapy with a Promoter Targeting Both Rods and Cones Rescues Retinal Degeneration Caused by AIPL1 Mutations)”，《基因疗法(Gene Ther.)》2010年1月；17(1)：117-131，所述文献通过引用以其整体并入本文。在一个实施例中，所述启动子被修饰为添加一个或多个限制位点以促进克隆。
在又其它实施例中，所述启动子是人视紫红质启动子。在一个实施例中，所述启动子被修饰为包含对克隆末端的限制。参见例如Nathans和Hogness，“编码人视紫红质的基因的分离和核苷酸序列(Isolation and nucleotide sequence of the gene encoding human rhodopsin)”，《美国国家科学院院刊(PNAS)》，81：4851-5(1984年8月)，所述文献通过引用以其整体并入本文。在另一个实施例中，所述启动子是人视紫红质启动子的一部分或片段。在另一个实施例中，所述启动子是人视紫红质启动子的变体。
其它示例性启动子包含人G-蛋白偶联受体蛋白激酶1(GRK1)启动子(Genbank登录号AY327580)。在另一个实施例中，所述启动子是GRK1启动子的292nt片段(位置1793-2087)(参见Beltran等人，《基因疗法(Gene Therapy)》201017：1162-74，所述文献据此通过引用以其整体并入本文)。在一个实施例中，所述启动子是SEQ ID NO：3的nt 1427-1790的GRK1启动子。在另一个优选实施例中，所述启动子是人光感受器间类视黄醇结合蛋白近端(IRBP)启动子。在一个实施例中，所述启动子是hIRBP启动子的235nt片段。在一个实施例中，所述启动子是RPGR近端启动子(Shu等人，《调查性眼科与视觉科学(IOVS)》，2102年5月，所述文献通过引用以其整体并入)。可用于本发明的其它启动子包含但不限于视杆视蛋白启动子、红-绿视蛋白启动子、蓝视蛋白启动子、cGMP-β-磷酸二酯酶启动子(Qgueta等人，《调查性眼科与视觉科学(InvestOphthalmol Vis Sci.，IOVS)》，2000年12月；41(13)：4059-63)、小鼠视蛋白启动子(以上引用的Beltran等人2010)、视紫红质启动子(Mussolino等人，《基因疗法(Gene Ther)》，2011年7月，18(7)：637-45)；视锥转导蛋白的α亚基(Morrissey等人，《BMC发育生物学(BMC Dev，Biol)》，2011年1月，11：3)；β磷酸二酯酶(PDE)启动子；视网膜色素变性(RP1)启动子(Nicord等人，《基因医学杂志(J.Gene Med)》，2007年12月，9(12)：1015-23)；NXNL2/NXNL1启动子(Lambard等人，《公共科学图书馆期刊(PLoS One)》，2010年10月，5(10)：e13025)、RPE65启动子；视网膜变性缓慢/外周蛋白2(Rds/perph2)启动子(Cai等人，《实验性眼研究(Exp Eye Res.)》2010年8月；91(2)：186-94)；以及VMD2启动子(Kachi等人，《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》，2009(20：31-9))。这些文献中的每个文献均通过引用整体并入本文。在另一个实施例中，所述启动子选自人EF1α启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶、光感受器间结合蛋白(IRBP)、视锥视蛋白启动子(红-绿、蓝)、含有红-绿视锥基因座控制区的视锥视蛋白上游序列、视锥转导和转录因子启动子(神经视网膜亮氨酸拉链(Nrl)和光感受器特异性核受体Nr2e3、bZIP)。
在其它实施例中，所述启动子是普遍存在的启动子或组成型启动子。合适启动子的实例是具有巨细胞病毒(CMV)增强子元件的杂交鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在另一个实施例中，具有CMV增强子序列的鸡β肌动蛋白启动子是SEQ ID NO：1的nt1443-3104。在又另一个实施例中，具有CMV增强子序列的鸡β肌动蛋白启动子是SEQ ID NO：5的nt 1493到2075。在另一个实施例中，所述启动子是CB7启动子。其它合适的启动子包含人β-肌动蛋白启动子、人延长因子-1α启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40启动子和单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子。参见例如Damdindori等人，(2014年8月)“位于腺相关病毒载体中的组成型启动子的比较分析(Comparative Analysis of Constitutive Promoters Located in Adeno-Associated Viral Vectors)”.《公共科学图书馆期刊(PLoS ONE)》，9(8)：e106472。仍其它合适的启动子包含病毒启动子、组成型启动子、可调节启动子(参见例如WO 2011/126808和WO 2013/04943)。可替代地，响应于生理线索的启动子可以用于本文所描述的表达盒、rAAV基因组、载体、质粒和病毒。在一个实施例中，由于AAV载体的大小限制，所述启动子的大小较小，低于1000bp。在另一个实施例中，所述启动子低于400bp。本领域技术人员可以选择其它启动子。在一个实施例中，所述AKT构建体包含具有CMV增强子元件的CBA启动子。在另一个实施例中，所述AKT构建体包含GRK1启动子。在一个实施例中，GRK1启动子是SEQ ID NO：3的nt 1427到1790中示出的启动子。
在某些实施例中，所述启动子是诱导型启动子。所述诱导型启动子可以选自已知的启动子，所述已知的启动子包含雷帕霉素/雷帕霉素类似物(rapalog)启动子、蜕皮激素启动子、雌激素应答性启动子和四环素应答性启动子或异二聚体阻遏物开关。参见Sochor等人，“用于基因治疗眼部应用的自体调节表达系统(AnAutogenously Regulated Expression System for Gene Therapeutic Ocular Applications)”.《科学报告(Scientific Reports)》，2015年11月24日；5：17105以及Daber R，Lewis M.，“一种新型分子开关(Anovel molecular switch)”.《分子生物学杂志(J Mol Biol.)》2009年8月28日；391(4)：661-70，电子版2009年6月21日，所述两个文献均通过引用以其整体并入本文。
在其它实施例中，本文所描述的盒、载体、质粒和病毒构建体含有其它合适的转录起始、终止、增强子序列、有效的RNA加工信号，如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；TATA序列；使细胞质mRNA稳定的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；内含子；增强蛋白稳定性的序列；以及在需要时，增强所编码产物的分泌的序列。所述表达盒或载体可以不含有本文所描述的元件中的任何元件，可以含有本文所描述的任何元件中的一个或多个元件。合适的polyA序列的实例包含例如SV40、牛生长激素(bGH)polyA和TK polyA。合适的增强子的实例包含例如CMV增强子、RSV增强子、甲胎蛋白增强子、TTR最小启动子/增强子、LSP(TH结合球蛋白启动子/α1-微球蛋白/双库尼茨抑制剂增强子)等其它增强子。在一个实施例中，在转基因编码序列的上游包含有Kozak序列，以增强从正确起始密码子的翻译。在另一个实施例中，CBA外显子1和内含子包含在所述表达盒中。在一个实施例中，将转基因置于杂交鸡β肌动蛋白(CBA)启动子的控制之下。此启动子由以下组成：巨细胞病毒(CMV)即刻早期增强子、近端鸡β肌动蛋白启动子和侧接有内含子1序列的CBA外显子1。
在某些实施例中，Kozak序列是GCCGCCACC(SEQ ID NO：1，nt 3121到3129)。
在某些实施例中，所述表达盒含有5′ITR、CBA启动子、CMV增强子、人AKT3编码序列(SEQ ID NO：7)、bGH polyA和3′ITR。
在某些实施例中，所述表达盒含有5′ITR、hGRK1启动子、人AKT3序列(SEQ ID NO：7)、bGH poly A和3′ITR。
在某些实施例中，所述表达盒含有5′ITR、CBA启动子、CMV增强子、经工程化的人AKT3序列(SEQ ID NO：13)、bGH poly A和3′ITR。
在某些实施例中，所述表达盒含有5′ITR、hGRK1启动子、经工程化的人AKT3序列(SEQ ID NO：13)、bGH poly A和3′ITR。
在某些实施例中，本文所描述的这些核酸序列、载体、表达盒或rAAV病毒载体可用于药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的载剂、缓冲液、稀释剂和/或佐剂等。此类药物组合物用于通过经由例如重组地工程化的AAV或人工AAV的递送在眼部细胞中表达AKT。
为制备含有核酸序列、载体、表达盒和rAAV病毒载体的这些药物组合物，优选通过常规方法评估所述序列或载体或病毒载体的污染，然后将所述序列或载体或病毒载体调配成适合施用于眼睛的药物组合物。此类调配物涉及使用药学上和/或生理学上可接受的媒剂或载剂，尤其是如缓冲盐水或其它缓冲液(例如，HEPES)等适合施用于眼睛的媒剂或载剂，以将pH维持在适当的生理水平，并且任选地，涉及使用其它药用剂、药学剂、稳定剂、缓冲液、载剂、佐剂、稀释剂等。对于注射，载剂将通常是液体。示例性生理上可接受的载剂包含无菌、无热原水和无菌、无热原磷酸盐缓冲盐水。美国专利公开第7,629,322号中提供了各种此类已知载剂，所述美国专利公开通过引用并入本文。在一个实施例中，载剂是等渗氯化钠溶液。在另一个实施例中，载剂是平衡盐溶液。在一个实施例中，载剂包含吐温。如果病毒要长期存储，则其可以在甘油或吐温20的存在下冷冻。
在一个示例性具体实施例中，载剂或赋形剂的组成含有180mM NaCl、10mM NaPi、pH 7.3以及0.0001％-0.01％普朗尼克(Pluronic)F68(PF68)。所述缓冲液的盐水组分的确切组成在160mM到180mM NaCl的范围内。任选地，使用不同的pH缓冲液(可能是HEPES、碳酸氢钠、TRIS)来代替具体描述的缓冲液。仍可替代地，可使用含有0.9％NaCl的缓冲液。
任选地，除了rAAV和/或变体以及载剂之外，本发明的组合物还可以含有其它常规药物成分，如防腐剂或化学稳定剂。适合的示例性防腐剂包含氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚以及对氯苯酚。适合的化学稳定剂包含明胶和白蛋白。
在AAV病毒载体的情况下，基因组拷贝(“GC”)、载体基因组(“VG”)或病毒颗粒的量化可以用作调配物或悬浮液中所含剂量的量度。可以使用本领域已知的任何方法来确定本发明的复制缺陷型病毒组合物的基因组拷贝(GC)数量。用于执行AAV GC数量滴定的一种方法如下：经纯化的AAV载体样品首先用DNase进行处理，以消除来自产生过程的未衣壳化的AAV基因组DNA或污染质粒DNA。然后使DNase抗性颗粒经受热处理，以从衣壳中释放基因组。然后使用靶向病毒基因组特定区域(通常为polyA信号)的引物/探针组通过实时PCR来量化经释放的基因组。在另一种方法中，如以下所描述地测量携带编码AKT转基因的核酸序列的重组腺相关病毒的有效剂量：S.K.McLaughlin等人，1988《病毒学杂志(J.Virol.)》，62：1963，所述文献通过引用以其整体并入。
如本文所使用的，术语“剂量”可以指在治疗过程中向受试者递送的总剂量或以单一单位(或多单位或分次剂量)施用递送的量。可以按剂量单位将药物病毒组合物调配成含有一定量的携带如本文所描述的编码AKT的核酸序列的复制缺陷型病毒，所述量的范围为约1.0×109GC到约1.0×1015GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109或9×109GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010或9×1010GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011或9×1011GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012或9×1012GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013或9×1013GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×1014、2×1014、3×1014、4×1014、5×1014、6×1014、7×1014、8×1014或9×1014GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×1015、2×1015、3×1015、4×1015、5×1015、6×1015、7×1015、8×1015或9×1015GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在一个实施例中，对于人类应用，剂量的范围可以为每剂量1×1010到约1×1012GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。所有剂量都可以通过任何已知方法测量，包含通过qPCR或数字液滴PCR(ddPCR)所测量的，如例如在以下中所描述的：M.Lock等人，《人类基因疗法方法(Hum Gene Ther Methods)》.2014年4月；25(2)：115-25.doi：10.1089/hgtb.2013.131，所述文献通过引用并入本文。
这些上述剂量可以以各种体积的载剂、赋形剂或缓冲液调配物施用，范围为约25到约1000微升，包含所述范围内的所有数字，这取决于待治疗区的大小、所使用的病毒滴度、施用途径以及所述方法的所期望的效果。在一个实施例中，载剂、赋形剂或缓冲液的体积为至少约25μL。在一个实施例中，体积为约50μL。在另一个实施例中，体积为约75μL。在另一个实施例中，体积为约100μL。在另一个实施例中，体积为约125μL。在另一个实施例中，体积为约150μL。在另一个实施例中，体积为约175μL。在又另一个实施例中，体积为约200μL。在另一个实施例中，体积为约225μL。在又另一个实施例中，体积为约250μL。在又另一个实施例中，体积为约275μL。在又另一个实施例中，体积为约300μL。在又另一个实施例中，体积为约325μL。在另一个实施例中，体积为约350μL。在另一个实施例中，体积为约375μL。在另一个实施例中，体积为约400μL。在另一个实施例中，体积为约450μL。在另一个实施例中，体积为约500μL。在另一个实施例中，体积为约550μL。在另一个实施例中，体积为约600μL。在另一个实施例中，体积为约650μL。在另一个实施例中，体积为约700μL。在另一个实施例中，体积介于约700与约1000μL之间。
在某些实施例中，对于如小鼠等小动物受试者，病毒构建体以约1×109GC到约1×1011GC的剂量、约1μL到约3μL的体积进行递送。对于眼睛大小与人眼大约相同的较大兽类受试者，可使用上述较大的人剂量和体积。参见例如Diehl等人，《应用毒理学杂志(J.Applied Toxicology)》，21：15-23(2001)的对用于向各种兽类动物施用物质的良好实践的讨论。此文献通过引用并入本文。
所期望的是，利用最低有效浓度的病毒或其它递送媒剂以降低如毒性、视网膜发育不良和脱离等不期望效应的风险。在这些范围内的仍其它剂量可以由主治医师考虑正在治疗的受试者(优选地人类)的身体状态、所述受试者的年龄、特定眼部病症以及所述病症(如果是进行性的话)的发展程度来选择。
在某些方面，本文描述了一种用于治疗、延缓或停止患有眼部病症或有罹患眼部病症的风险的哺乳动物受试者的失明进展的方法。在一个实施例中，所述受试者患有视网膜变性。在某些实施例中，向期望的受试者(例如，人受试者)施用优选地悬浮在生理相容的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂中的携带AKT序列的rAAV。此方法包括向有需要的受试者施用以下中的任何一种：核酸序列、表达盒、rAAV基因组、质粒、载体或rAAV载体或含有这些物质的组合物。在某些实施例中，所述组合物在视网膜下递送。在另一个实施例中，所述组合物在玻璃体内递送。在仍另一个实施例中，所述组合物使用适合于治疗眼部病症的施用途径的组合来递送，所述施用途径包含但不限于通过眼睑静脉的施用或其它静脉内或常规施用途径。
为了在这些方法中进行使用，如本文进一步描述的，每个剂量的体积和病毒滴度是单独确定的并且可以与在相同或对侧眼睛中进行的其它治疗相同或不同。剂量、施用和方案可以由主治医生根据本说明书的教导来确定。在某些实施例中，所述组合物以选自上文所列的那些剂量的单一剂量施用并且施用于单个受影响的眼睛。在其它实施例中，所述组合物以选自上文所列的那些剂量的单一剂量同时地或依序地施用于两只受影响的眼睛。依序施用可能意味着从一只眼睛到另一只眼睛的施用时间间隙为几分钟、几小时、几天、几周或几个月的间隔。在其它实施例中，所述方法涉及以两个或更多个剂量(例如，分次剂量)向眼睛施用组合物。在另一个实施例中，在同一只眼睛的不同部分进行多次注射。在另一个实施例中，在稍后的时间点进行包含所选表达盒(例如，含有AKT的盒)的rAAV的第二次施用。此类时间点可以是第一次施用后的数周、数月或数年。在一个实施例中，用具有与第一次施用的rAAV不同的衣壳的rAAV进行此类第二次施用。在另一个实施例中，第一次施用和第二次施用的rAAV具有相同的衣壳。
在仍其它实施例中，本文所描述的组合物以单一组合物或多种组合物的形式递送。任选地，递送两种或更多种不同的AAV，或多种病毒[参见例如WO 2011/126808和WO 2013/049493]。在另一个实施例中，多种病毒含有不同的复制缺陷型病毒(例如，AAV和腺病毒)。
在某些实施例中，所期望的是进行非侵入性视网膜成像和功能研究，以识别要被靶向治疗的眼睛区(例如，视杆和视锥光感受器)。在这些实施例中，采用临床诊断测试来确定一次或多次视网膜下注射的精确位置。这些测试包含例如视网膜电图(ERG)、视野检查、通过共聚焦扫描激光检眼镜检查法(cSLO)和光学相干断层扫描术(OCT)进行的视网膜层的局部解剖测绘和视网膜层厚度的测量、通过自适应光学(AO)进行的视锥密度的局部解剖测绘、功能性眼科检查等，这些测试取决于被治疗受试者的物种、身体状况和剂量。鉴于所进行的成像和功能研究，在某些实施例中，在同一只眼睛中进行一次或多次注射，以靶向受影响的眼睛的不同区。如本文进一步描述的，每次注射的体积和病毒滴度是单独确定的并且可以与在相同或对侧眼睛中进行的其它注射相同或不同。在另一个实施例中，进行单次更大体积的注射以治疗整个眼睛。在一个实施例中，选择rAAV组合物的体积和浓度，使得仅影响受损眼部细胞的区域。在另一个实施例中，rAAV组合物的体积和/或浓度的量更大，以便到达眼睛的更大部分(包含未受损的光感受器)。
在本文所描述的方法的某些实施例中，如本文所描述的组合物的一次性眼内递送(例如，AKT表达盒的AAV递送)可用于预防有罹患眼部病症或视网膜变性的风险的受试者的视力丧失和失明。
在某些实施例中，所述组合物在疾病发作前施用。在其它实施例中，所述组合物在视力受损或丧失开始之前施用。在其它实施例中，所述组合物在视力受损或丧失开始之后施用。在又其它实施例中，与未患病的眼睛相比(例如，对侧眼睛)，所述组合物在少于90％的视杆细胞和/或视锥细胞或光感受器起作用或保留时施用。
在某些实施例中，所述方法包含进行另外的研究，例如功能和成像研究，以确定治疗的功效。对于动物，此类测试包含通过视网膜电图(ERG)观察视杆和视锥光感受器功能来评估视网膜和视觉功能、视动性眼球震颤、瞳孔测量法、水迷宫测试、明暗偏好、光学相干断层扫描术(测量视网膜各层的厚度)、组织学(视网膜厚度、外核层中的成排细胞核、记录转基因表达的免疫荧光、视锥光感受器计数、用花生凝集素染色视网膜切片-所述花生凝集素会识别视锥光感受器鞘)。
具体对于人受试者而言，在施用本说明书中所描述的组合物的一定剂量之后，使用以下来测试对所述受试者的治疗功效：检查视杆和视锥光感受器功能的视网膜电图(ERG)、瞳孔测量法视敏度评估、对比敏感度色觉测试、视野测试(汉弗莱视野(Humphrey visual fields)/戈德曼视野(Goldmann visual fields))、视野检查移动测试(障碍课程)和/或阅读速度测试。受试者在用本文所描述的药物组合物进行治疗之后接受的其它有用的治疗后功效测试包含：功能性磁共振成像(fMRI)、全场光敏感测试、视网膜结构研究(包含光学相干断层扫描术)、眼底照相、眼底自发荧光(FAF)、自适应光学激光扫描检眼镜检查、移动测试、阅读速度和准确性的测试、微视野检查和/或检眼镜检查。美国专利第8,147,823号和共同未决的国际专利申请公开WO 2014/011210或WO 2014/124282中描述了这些和其它功效测试，所述美国专利和共同未决的国际专利申请公开通过引用并入本文。
在又其它实施例中，以上描述的方法中的任何方法都与另一种疗法或二次疗法组合进行。在仍其它实施例中，治疗这些眼部疾病的方法涉及用本文详细描述的组合物与另一种如抗生素治疗、疼痛的姑息治疗等疗法的组合来治疗受试者。所述另外的疗法可以是任何目前已知的或至今仍未知的疗法，所述目前已知的或至今仍未知的疗法帮助预防、阻止或改善这些突变或缺陷或与其相关的任何作用。可以在施用以上描述的组合物之前、同时或之后施用所述二次疗法。在某些实施例中，二次疗法涉及用于维持视网膜细胞健康的非特异性方法，如施用神经营养因子、抗氧化剂、抗凋亡剂。通过注射蛋白质、重组DNA、重组病毒载体、干细胞、胎儿组织或经基因修饰的细胞来实现所述非特异性方法。后者可以包含包封的经基因修饰的细胞。
在某些实施例中，产生重组rAAV的方法包括获得含有以上描述的AAV表达盒的质粒，并在存在足以允许将AAV病毒基因组包装到感染性AAV包膜或衣壳中的病毒序列的情况下培养携带所述质粒的包装细胞。产生rAAV载体的具体方法在以上有所描述并且可以被采用以产生rAAV载体，所述rAAV载体可以递送以上所描述的或在以下实例中所描述的表达盒或载体基因组。
在又其它实施例中，提供了包括本文所描述的表达盒中的任何表达盒的载体。如以上所描述的，此类载体可以是各种起源的质粒并且可在某些实施例中用于产生如本文进一步描述的重组复制缺陷型病毒。
应注意的是，术语“一个(a)”或“一个(an)”是指一个或多个。如此，术语“一个(a或an)”、“一个或多个”和“至少一个”在本文可互换地使用。词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被解释为是包含性而非排他性的。词语“由……组成(consist)”、“由……组成(consisting)”及其变体将被解释为是排他性的而非包含性。虽然说明书中的各个实施例是使用“包括”语言来呈现的，但是在其它情况下，也意图使用“由……组成”或“基本上由……组成”的语言来解释和描述相关的实施例。如本文所使用的，除非另有说明，否则术语“约”意指相对于给定参考的10％的变化性。如本文所使用的，术语“调控”或其变体是指组合物抑制生物通路的一个或多个组件的能力。
除非在本说明书中另有定义，否则本文所使用的技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员和参照公开文本所通常理解的相同含义，这为本领域的技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指南。
以下实例仅是说明性的，并且不旨在限制本发明。
实例
超过250个已知基因内的突变与遗传性视网膜变性相关联。归因于RPE65突变的先天性失明的基因替代疗法之后的临床成功为开发靶向遗传性眼部疾病的其它形式的上游治疗建立了平台。不幸运地，几个与复杂疾病病理学相关的挑战和当前基因转移技术的局限性阻碍了针对遗传性视网膜变性的每个特定形式的相关策略的开发。在这里，描述了一种基因增强策略，所述策略通过刺激光感受器存活和结构维持所必需的合成代谢特征来延迟视网膜变性。在视网膜色素变性的小鼠模型中通过AAV介导的基因增强来靶向典型胰岛素/AKT/mTOR通路中的两个关键调控点。表达丝氨酸/苏氨酸激酶AKT3的AAV载体促进光感受器数量、结构和部分视觉功能的显著保留。这种保护作用与光感受器代谢朝与细胞生长和存活相关联的通路的成功重新编程相关联。总的来说，这些发现强调了AKT活性和与合成代谢相关联的下游通路在光感受器存活和维持中的重要性。
实例1：材料与方法
动物
C57B1/6和Pde6brd10小鼠获自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)并在12小时的光照/黑暗循环中饲养。在符合关于实验室动物护理和使用的ARVO指导方针以及机构和联邦法规的情况下，动物圈养在宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)。
AAV载体
编码含有N端豆蔻酰化(MYR)和HA标签的人AKT3 cDNA序列的质粒由威廉·塞勒斯公司(William Sellers)友情提供(Addgene质粒共享信息库(addgene)#9017质粒)。使用In-Fusion HD克隆系统(Clonetech公司(Clonetech))扩增MYR-HA-hAKT3序列并将所述序列克隆到AAV前病毒表达质粒中。人Rheb cDNA克隆从奥瑞基因公司(Origene)获得。采用反向PCR诱变来产生具有以下引物序列的S16H突变：5′[磷酸]CACGTGGGGAAATCCTCATTGAC 3′(S16H正向)(SEQ ID NO：14)和5′CCGGTAGCCCAGGAT 3′(SEQ ID NO：15)。然后使用In-Fusion HD克隆系统将含有S16H突变的人Rheb cDNA克隆到AAV前病毒表达质粒中。为产生病毒载体，表达AAV7m8 Cap的辅助质粒由约翰·弗兰纳里(John Flannery)和大卫·沙弗(David Schaffer)友情提供(Addgene质粒共享信息库#64839质粒)。使用先前描述的方法46产生AAV7m8-AKT3和AAV7m8-eGFP载体，并由高级视网膜和眼科治疗中心(Center for Advanced Retinal and Ocular Therapeutics，CAROT)研究载体核心(美国宾夕法尼亚州的宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania，PA，USA))使用CsCl梯度超速离心法进行纯化。
细胞培养和AAV转导
84-31细胞由詹姆斯威尔逊博士(Dr.James Wilson)(宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania))友情提供，并在补充有10％FBS和1％青霉素-链霉素的杜氏改良的伊格尔氏培养基-谷氨酰胺(DMEM-GlutaMax)中进行培养。对于AAV转导，将84-31细胞以2.5×105个细胞/孔的密度铺板在6孔培养皿中。之后，立即用AAV7m8载体以1×106感染复数(MOI)转导细胞。在37℃下用5％CO2维持细胞。
RNA分离和基因表达分析
使用Macherey-Nagel Nucleospin RNA试剂盒分离RNA。利用SuperScriptIII第一链合成系统，按照制造商的方案使用500ng总RNA进行第一链cDNA合成。利用应用生物系统(Applied Biosystems)7500Fast系统，使用Power SYBR green PCR主混合物(英杰公司(Invitrogen))进行实时PCR。使用以下引物序列：5′CCACTCCTCCACCTTTGAC 3′(人GAPDH正向；SEQ ID NO：16)、5′ACCCTGTTGCTGTAGCCA 3′(人GAPDH反向；SEQ ID NO：17)、5′ACTCCTACGATCCAACCATAGA 3′(人Rheb正向；SEQ ID NO：18)、5′TGGAGTATGTCTGAGGAAAGATAGA 3′(人Rheb反向；SEQ ID NO：19)、5′AGGATGGTATGGACTGCATGG 3′(人AKT3正向；SEQ ID NO：20)和5′GTCCACTTGCAGAGTAGGAAAA 3′(人AKT3反向；SEQ ID NO：21)。用ΔΔCT方法量化相对基因表达并归一化为GAPDH。
视网膜下注射
如先前所描述进行视网膜下注射。每个视网膜接受1uL的载体制剂。向单独接受了AAV.eGFP载体的眼睛以2×109个载体基因组给药。向接受了AAV.eGFP加AAV.AKT3或AAV.caRheb的组合的眼睛以每个载体1×109个载体基因组(2×109个总载体基因组)给药。
视网膜电图
如先前所描述对小鼠进行麻醉和维持。用1％托吡卡胺(德克萨斯州沃思堡市的爱尔康实验室(Alcon Laboratories，Fort Worth，TX))扩大瞳孔。使用带有嵌入式铂丝的透明塑料隐形眼镜来记录光反应，并将铂丝环放置到动物口中以充当参比电极。用Espion E2系统(马萨诸塞州洛厄尔的Diagnosys公司(Diagnosys，Lowell，MA))记录ERG。用以下参数记录了三个ERG反应：暗视反应(暗适应，0.01scot cd s m-2刺激)、最大混合视杆-视锥反应(暗适应，500scot cd s m-2刺激)、最大视锥反应。
视动反应
如先前所描述的，使用OptoMotry软件和设备(加拿大阿尔伯塔省梅蒂逊哈特市的Cerebral Mechanics公司(Cerebral Mechanics，Inc，Medicine Hat，AB，Canada))通过测量视动反应(OKR)来评估视敏度。录音由对实验治疗不知情的研究者进行。
免疫组织化学
如先前所描述的，将眼睛摘出、收获并制备为冷冻切片(Dooley SJ等人(2018).“剪接体介导的前mRNA反式剪接可以修复CEP290 mRNA(Spliceosome-mediated pre-mRNA trans-splicing can repair CEP290 mRNA)”.《分子治疗核酸(Mol Ther Nucleic Acids)》12：294-308)。将切片在含有磷酸盐-缓冲盐水(PBS)、10％正常山羊血清(CST)和2％Triton X-100的封闭缓冲液中在室温下温育一小时。之后，将切片在含有先前所描述的组分和以下抗体的组合的加湿室中在第一抗体溶液中温育过夜：兔抗视锥抑制蛋白(1:400；密理博公司(Millipore)#ab15282)、兔抗磷酸-S6-Ser240/244(1:100；细胞信号传导技术公司(CST)#5364)、兔抗磷酸-AKT-Ser273(1:100；细胞信号传导技术公司#4060)、小鼠抗视紫红质(1:400；艾博抗(Abcam)#ab5417)、兔抗HA(1:100；细胞信号传导技术公司#3724)、兔抗Ki67(1:400；艾博抗#ab15580)、小鼠抗PCNA(1:400；艾博抗#ab29)、鸡抗GFAP(1:400；艾博抗#ab4674)、兔抗AKT(1:100；细胞信号传导技术公司#4691)。第一抗体温育之后，将切片用PBS洗涤三次，并在含有PBS、10％正常山羊血清、2％Triton X-100和以下第二抗体的组合的加湿室中在室温下在第二抗体溶液中温育2小时：alexa fluor-594山羊抗鸡(1:500；艾博抗#ab150176)、alexa fluor-594山羊抗小鼠(1:500；#ab150116)、alexa fluor-594山羊抗兔(1:500；艾博抗#ab150080)、Cy5偶联山羊抗兔(1:500；KPL公司(KPL)#072-02-15-16)。将切片从第二抗体温育中移除并用PBS洗涤三次。将针对存在磷酸化抗原而染色的切片在含有Tris缓冲盐水(TBS)而非PBS的溶液中温育并洗涤。
ONL测量
利用EVOS FL Auto 2细胞成像系统，使用40X物镜平铺显示全部视网膜切片。在每个图像中，在三个等距点处测量ONL厚度，所述等距点间隔75-100μm。将这些测量值在所有图像之间取平均值，以表示切片的平均ONL厚度。每个样品取三个视网膜切片的平均值。通过对每个200μm区的GFP ONL细胞的数量进行计数来量化来自用载体转导的视网膜的特定区域的ONL数量。再一次地，每个样品取三个视网膜切片的平均值来获得这些测量值。
蛋白质印迹
使用NuPage电泳系统(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))分离蛋白质样品。将样品在70℃下加热并加载到4-12％的Bis-Tris蛋白质凝胶上(赛默飞世尔公司)。然后将经分离的蛋白质在35伏下转移到具有XCell II印迹模块(赛默飞世尔公司)的PVDF膜上，持续1.5小时。蛋白质转移之后，将膜在含有0.1％(v/v)吐温20(伯乐公司(BioRad))(TBST)和5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))的Tris缓冲盐水中在室温下温育1小时。之后，在含有以下第一抗体的先前所描述的溶液中温育印记：兔抗498磷酸-S6-Ser240/244(1:1000；细胞信号传导技术公司#5364、兔抗S6(1:1000；细胞信号传导技术公司#2217)、兔抗GAPDH(1:1000；细胞信号传导技术公司#5174)。将第一抗体在4℃下温育过夜。将印迹从第一抗体溶液中移除并在TBST中洗涤三次，每次5分钟。之后，将其在室温下放置于由TBST、5％BSA和HRP偶联抗兔ECL(1:10,000；GE医疗保健公司(GE Healthcare))构成的第二抗体溶液中1小时。将膜在TBST中洗涤三次，随后根据制造商的说明用ECL2(赛默飞世尔公司)温育5分钟。最后，使用Amersham Imager 600(GE医疗保健公司)在化学发光设置下对膜进行成像。
统计
除非另有说明，否则所有数据均表示为平均值±SEM。使用非配对学生t-检验比较两个治疗组之间的差异。使用单向方差分析(ANOVA)和随后的Tukey真实显著差异检验比较三个或更多个实验组之间的差异。使用GraphPad Prism 7.0确定统计显著性的计算。差异在P＜0.05时被认为是统计显著的。
实例2：用于治疗眼部疾病的AKT3基因疗法
AKT3或caRheb过表达对视网膜色素变性的Pde6brd10(rd10)小鼠模型的影响
rd10小鼠模型中的疾病是由编码视杆磷酸二酯酶(PDE)的β-亚基的基因中的点突变引起的，所述点突变使得PDE复合物失去功能并在视杆光转导级联中产生阻断。此外，PDE在将cGMP再循环为GMP的过程中起着关键作用，从而促进电压门控离子通道的关闭。PDE复合物活性的丧失促进Na 和Ca2 离子的组成型流入和细胞死亡级联的激活。Rd10小鼠在出生后第18天(PN18)附近开始显示出光感受器外核层(ONL)的逐渐变薄。到PN30时，视网膜中央和周边区域的光感受器显著丧失，并且通常在PN45时在中央视网膜中保留一层异常视锥细胞体。在以下所描述的研究中，评估了AKT3或Rheb递送对视觉功能、结构形态和光感受器保留的神经保护性潜力。通过检查指示mTOR激活的标志物的表达，进一步研究了神经保护性作用的潜在机制。另外，还检查了AKT3或Rheb过表达对视网膜神经元的致癌增殖的潜力的长期安全性。
AAV7m8载体的设计和表征
源自AAV的基因转移载体已成为用于靶向神经元组织的最佳基因递送平台。AAV7m8是通过体内选择产生的AAV2的变体，并显示出增强的视网膜和细胞转导性质。产生了AAV7m8载体，所述载体编码人AKT3的过度活跃版本(AAV.AKT3)、组成型活性Rheb突变体(AAV.caRheb)和作为对照的增强型绿色荧光蛋白报告基因(AAV.eGFP)(图1A)。AKT3转基因含有N端豆蔻酰化(MYR)序列，从而增强膜靶向和定位。caRheb转基因含有典型的S16H突变，所述突变赋予对TSC介导的GTPase激活蛋白(GAP)活性的抗性。与未经处理的对照相比，用AAV.caRheb或AAV.AKT3载体转导的84-31细胞显示出强烈的靶基因mRNA表达(图1B-图1C)。AAV7m8的视网膜下递送会产生小鼠视网膜中光感受器、视网膜色素上皮(RPE)和缪勒氏细胞的强烈标记(图1D-图1E)。实验载体与报告载体的共同注射使得转基因表达特别地定位到视网膜下递送区(图1G-图1H)，从而允许充分识别经处理的视网膜区域。
caRheb基因转移未能减轻Pde6brd10小鼠的视网膜变性
研究了caRheb基因增强对Pde6brd10视网膜的作用。在PN13-14时(视杆死亡开始前的时间点)，动物接受了单侧视网膜下注射携带实验转基因的AAV以及含有eGFP的AAV(以便可以识别视网膜的经注射的部分)。对照包含单独注射含有eGFP的AAV或不注射AAV。注射之后，用视网膜电图(ERG)和视动反应(OKR)测量视觉功能。在PN45时，检查视网膜组织学以确定AAV.caRheb对光感受器存活的作用(图2A-图2C)。每个视网膜总ONL厚度的量化显示，在实验与对照处理(未经处理或单独注射AAV.eGFP)中剩余光感受器细胞体的数量没有显著差异(图2B)。除了总ONL厚度外，还测量了单独用AAV.eGFP转导或与AAV.caRheb共转导的视网膜中的每200μm切片区域的GFP ONL细胞数量。再一次地，没有观察到这些组之间ONL细胞数量的统计学显著变化(图2C)。此外，与分别用ERG(图2D-图2F)和OKR(图2G)测量的对照相比，AAV.caRheb没有保留视网膜或视觉功能。总的来说，这些数据表明caRheb基因转移不会促进Pde6brd10小鼠视网膜中的光感受器神经保护。
AKT3基因增强促进Pde6brd10视网膜中光感受器存活和结构保留
检查了AKT3基因增强对Pde6brd10视网膜中的感受器存活和结构完整性的作用。在PN13-14时注射AAV.AKT3之后，PN30和PN45时的视网膜结构的组织学分析揭示了对特别是与eGFP共标记的视网膜区域中的光感受器的强大的神经保护性作用(如处理组之间的免疫染色和ONL测量所反映的)(图3C)。在任何时间点与未经处理的眼睛相比，经AAV.GFP注射的眼睛没有组织学挽救的证据。为探测被保持的特定类型的光感受器而进行的免疫染色揭示，用AAV.AKT3载体转导的视网膜区域中保留了视锥光感受器(如通过针对视锥抑制蛋白进行的染色所评估的)(图3D-图3F)。类似地，针对视紫红质进行的免疫染色揭示，AAV.AKT3-转导的区域(但不是视网膜或AAV.eGFP或未经处理的对照视网膜的未经暴露的区域)中保留了视杆光感受器。
显著地，与对照相比，针对视紫红质进行的免疫染色还揭示了在PN30收获点时的视杆外段的增强保留，这表明这一通路在介导视杆光感受器超微结构的存活和保持中的重要性(图3A-图3C)。
AKT3基因转移对Pde6brd10视网膜中视网膜和视觉功能的作用
分别通过视网膜电图(ERG)和视动反应(OKR)测量评估了在PN30和PN45时间点的视网膜和视觉功能。对用AAV.AKT3处理的眼睛的混合的视杆-视锥细胞反应的分析揭示，在PN30时，与未经处理的对照以及经AAV.eGFP处理的对照相比，a-波振幅有所改善(图4A)。另外，与经AAV.eGFP处理的眼睛相比，用AAV.AKT3处理的眼睛的刺激还引起了混合的b-波反应的增加(图4B)，但在这个时间点与未经处理的眼睛相比，仅存在朝保留增加的趋势。然而，在PN45时，处理组之间的这些结果测量没有显著差异(图4A-图4B)。还测量了视锥特异性b-波反应，但在测试的任何时间点均未观察到处理组之间的统计学显著差异(图4C)。通过测量视动反应(OKR)检查了响应于基因转移的视敏度。数据表示这些记录的右/左眼比率，在所述纪录中，未经处理的左眼充当动物内对照，而右眼用AAV.eGFP单独处理或与AAV.AKT3组合处理。在任何时间点，相对于AAV.eGFP对照，用AAV.AKT3/AAV.eGFP的处理均未保留视敏度(图4D)。总的来说，此数据表明，AKT3基因转移会在疾病早中期延长细胞存活和某些功能，但可能不足以用于长期保持。
AKT3基因增强会刺激生物合成和细胞存活通路
假设AKT3诱导的神经保护性反应会激活与合成代谢和细胞存活相关联的通路。为了评估这种可能性，使用针对指示mTOR激活的典型下游标志物的抗体对视网膜切片进行免疫染色(图5A-图5H)。与未经暴露或未经处理的视网膜相比，特定地用AAV.AKT3转导的视网膜的区域证明，磷酸化核糖体蛋白S6(pS6)的表达增强(图5E-图5H)。有趣的是，还观察到特定暴露于AAV.AKT3的区域内的mTORC2标志物(pAKTS473)的表达增加，这表明刺激了与细胞存活和抗逆性相关联的另外的功能(图5A-图5D)。从未经处理的组和AAV.GFP对照组获得的视网膜切片未显示这些标志物的表达增强，这意味着AKT3诱导的神经保护至少部分地由mTORC1和mTORC2通路驱动(图5D和图5H)。
AKT3过表达不会打破光感受器静态但会刺激Müller细胞激活
失调的AKT信号传导是许多人癌症的共同标志。通过用细胞增殖的典型标志物进行免疫染色，检查了AKT3基因转移对视网膜静态的影响。将Ki67的表达限制到占据未经处理的和经AAV.eGFP处理的Pde6brd10视网膜中的神经节细胞层的细胞。
用针对GFAP的抗体进行的共染色将这种Ki67 细胞群识别为Müller胶质细胞。在内稳态条件下，这些细胞通过介导神经营养因子的释放、调节细胞外离子平衡和清除碎片，为其它视网膜细胞类型提供结构和代谢支持。重要的是，占据ONL的细胞未对Ki67标志物表现出阳性免疫反应性，这表明AKT3诱导的保护性反应不是光感受器静态退出的意外结果(图6H和图6I)。有趣的是，特定地用AAV.AKT3转导的视网膜区域内的Müller细胞证明了表示星形胶质细胞增生症的形态变化，如GFAP表达的上调和神经过程在不同视网膜层的延伸(图6G-图6I)。类似地，检查了这些标志物在被注射载体板的野生型动物中的表达。野生型动物在PN13时接受视网膜下注射并在PN125时随访以进行组织学分析。没有观察到单独长期过表达报告载体的动物的结构或细胞变化(图11A-图11B)。相反，用普遍存在的AAV.AKT3载体处理的动物显示出广泛的视网膜解体和光感受器结构标志物的丧失(图11-图11D)。此外，与未经处理和经AAV.eGFP处理的视网膜相比，特定地用AAV.AKT3载体转导的区域也显示出Müller细胞的慢性激活(图7A-图7K)。
AKT3的光感受器限制的表达会介导Pde6brd10视网膜中的神经保护性作用
通过产生由先前所描述的GRK1启动子驱动的AAV载体，检查了特别是在光感受器内的AKT3介导的神经保护(图8A)。这些载体在Pde6brd10视网膜内的应用对视网膜功能产生了与先前所描述的由普遍存在的CAG启动子驱动的载体类似的作用(图8B-图8D)。具体地，利用AAV.GRK1.AKT3的处理在PN30时保留了混合的a-波和b-波振幅，但在PN45时的晚期变性中未保留混合的a-波和b-波振幅。与先前的发现类似，与对照处理相比，这些载体没有介导视锥特异性b-波振幅的保留。在组织学水平上，这些载体证明了光感受器内的特异性转基因表达(图8E)。此外，与未经处理和经AAV.eGFP处理的对照眼睛相比，AAV.GRK1.AKT3还改善了光感受器存活(图8F)。
由光感受器特异性启动子调控的AKT3载体不会刺激
Pde6brd10视网膜中的反应性胶质增生
假设，用GRK1驱动的载体将AKT3转基因表达限制到光感受器层将减轻先前用由普遍存在的CAG启动子调控的AKT3载体观察到的慢性müller细胞激活。再一次地，用针对GFAP和Ki67的抗体对源自PN45 Pde6brd10小鼠的视网膜切片进行免疫染色，所述小鼠用AAV.GRK1.AKT3和示踪剂载体共注射(图9A-图9H)。与未经处理的样品相比，利用AAV.GRK1.AKT3的处理未揭示Pde6brd10中Müller细胞的异常激活和迁移(图9A-图9F)。
此外，未经处理的视网膜区域和视网膜下注射部位之间的过渡区域揭示出类似的组织学发现，这进一步表明光感受器限制的AKT3基因转移减轻了先前用普遍存在的载体系统观察到的Müller细胞的慢性激活(图9G和图9H)。这些结果强调了细胞和组织特异性启动子绕过与神经保护性基因转移策略相关联的潜在有害脱靶效应的重要性。
实例3：通过AAV介导的基因转移刺激mTOR通路
以上实例2中所描述的研究证明了在用AAV介导的基因转移刺激mTOR通路之后，在RP动物模型中重新编程细胞代谢的治疗潜力。mTOR信号传导在神经变性疾病背景中的确切作用仍然是有争议的话题。通过典型mTOR抑制剂雷帕霉素的处理来下调mTOR活性可以减弱多种神经变性模型的病理机制，所述神经变性包含帕金森病(Parkinson′s disease)、亨廷顿病(Huntington′s disease)和阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)。相反，其它研究表明，刺激胰岛素/AKT/mTOR轴可以介导相关神经变性疾病模型的有益结果。在以上所描述的研究中，在两个不同的调控点靶向mTOR通路会产生对光感受器存活、结构完整性和视网膜功能的不同作用。
之前的若干项研究强调了在神经变性疾病模型的背景下靶向Rheb激活以改善治疗结果的保护性潜力。然而，在此下游调控点用caRheb基因转移刺激mTOR通路并没有介导Pde6brd10视网膜的保护性作用。有趣的是，AAV.caRheb载体证明了在体外对mTORC1活性的强大刺激，这显示了典型mTORC1激活标志物pS6的表达增强。这种活性没有在体内转化，如通过过表达caRheb转基因的视网膜切片中pS6的阴性免疫染色所显示的。这表明存在抑制caRheb在光感受器内刺激mTORC1的能力的内在机制(图10A和图10B)。这些观察结果与先前的研究中所报告的观察结果不同，在所述研究中，caRheb基因转移刺激了各种神经元群中的mTORC1活性，并在帕金森病、亨廷顿病和视神经创伤模型中赋予了抗逆性。其它证据线表明，Rheb可能在响应于不同形式的细胞应激而促进细胞死亡信号传导程序的方面发挥有竞争力的作用。UV或TNFα诱导的细胞应激与Rheb过表达相组合增强了体外细胞凋亡信号传导，而Rheb敲低或用雷帕霉素的处理提供了部分保护以免受这些细胞毒性药剂的影响。在视网膜变性的上下文中，视网膜神经节细胞(RGC)的光诱导的损伤导致Rheb表达的上调，所述上调与变性前细胞凋亡标志物的增加相关联。综上所述，Rheb的保护或促凋亡功能很可能由通过所讨论的特定病理学引起的机制决定。此外，通过基因转移放大Rheb活性可能会根据特定的疾病背景而调节对细胞生物学的不同作用。
进一步地，AAV介导的AKT3基因转移刺激了对光感受器存活和形态保留的强大的神经保护性作用。这种保护性作用与特定地用AAV.AKT3载体转导的视网膜的区域中的mTORC1和mTORC2的刺激相关联。我们的发现首次报告了与光感受器神经保护相关联的mTORC2信号传导活性的上调。此数据不同于先前由Venkatesh等人(2015)所进行的观察，在所述观察中，mTORC2活性于Pde6brd1小鼠视网膜中Pten的转基因消融和视锥存活增强之后减弱。
尽管由AKT3基因转移介导的细胞保留显著，但在通过视网膜电图和OKR评估之后观察到对功能保留的不同作用。在PN30测量时而非在晚期变性期间，观察到混合的视杆-视锥a-波反应和在一些情况下的b-波反应在用CAG或GRK1启动子驱动的AKT3载体处理的眼睛中的统计学上的显著保留。尽管具有AKT3转基因表达的视锥结构在形态学上得以保留，但在任何测试的时间点，与对照相比，都没有观察到视锥特异性光反应的改善。这一发现与之前的研究不同，所述研究检查了类似疾病模型中视锥光感受器神经保护的策略。这些差异可以通过研究设计的变化来解释，所述变化不仅涉及转基因盒，还涉及载体剂量、注射途径、与模型系统相关联的变性动力学以及载体递送的定时。在本研究中，载体是在光感受器死亡刚开始之前的时间点注射的，而之前的研究是在出生后并在视网膜成熟和疾病机制开始之前立即施用实验干预。实验设计中的这些差异可能具有与以下相关的重要下游影响：视网膜覆盖率、载体募集动力学和与神经变性机制发作相关的表达，以及最终的治疗结果测量。
在临床转化之前，基于重新编程细胞代谢的策略的基因疗法的推进必须符合高度严格的安全标准。虽然没有观察到肿瘤形成的证据，但在野生型动物中由普遍存在的启动子调控的AKT3的长期过表达导致了广泛的视网膜解体并最终导致光感受器的丧失。这种表型对应于特定地用在野生型和Pde6brd10动物中观察到的普遍存在的载体转导的视网膜区域中的Müller细胞的慢性激活。反应性胶质增生是通常与组织损伤相关联的反应，在所述反应中，这些细胞被激活并增殖以介导各种功能，所述功能包含组织重塑、神经营养因子释放、细胞碎片的清除。虽然这种反应旨在抑制进一步的视网膜损伤，但慢性激活可能对邻近细胞有害并破坏视网膜内稳态。例如，已观察到激活的Müller细胞会上调各种促炎分子的表达和分泌，所述促炎分子包含肿瘤坏死因子(TNF)和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)。
此外，已知它们会分泌过量的一氧化氮(NO)，这会产生可能对邻近细胞造成损害的自由基41。这一发现并不令人意外，因为细胞需要在这些代谢组分中保持微妙的平衡以适应其精确的生理学需求，而对此类通路的过多刺激可能会对细胞活力产生有害作用。通过基因增强或沉默策略确定和实现这种平衡在将这些方法转化到临床中时将是巨大挑战。
如细胞特异性启动子(如在此示出的)、应激反应性启动子或诱导系统等另外的调控元件将可能在刺激有效代谢通路的神经保护性基因转移策略的临床开发中发挥关键作用。
总的来说，这项研究证明了在遗传性视网膜变性模型中在基因增强之后对光感受器活力和结构的广泛保护性作用。这些发现强调了AKT活性和与合成代谢相关联的下游通路在光感受器存活和维持中的重要性。此外，所述结果强调了重新编程细胞代谢的复杂性和微妙性，以及使用“通用”基因疗法策略阻止复杂神经变性疾病的进展的重要安全问题。
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