葡萄果皮提取物的制作方法

本发明涉及以特定量含有锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷的葡萄果皮提取物。

背景技术

已知花色素苷显示出视觉障碍改善作用、抗氧化作用、血管强化作用、抗炎作用、抗肿瘤作用等各种生理活性，正在谋求含有花色素苷的生物资源的利用。

例如，关于蓝莓果实的提取物，报道有其作为抗癌剂(专利文献1)、脑功能改善用组合物(专利文献2)的应用。此外，还尝试了通过越橘所含的花色素苷来抑制β-淀粉样蛋白的凝聚(非专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2003-277271号公报；

专利文献2：日本特开2007-145825号公报。

非专利文献

非专利文献1：MY.Yoshida,et al.,\"Anthocyanin suppresses the toxicity of Aβdeposits through diversion of molecular forms in vitro and in vivo models of Alzheimer's disease\"Nutritional Neuroscience,2016年、Vol.19(1)、p.32-42。

技术实现要素：

发明要解决的问题

目前在日本，随着高龄化的进展，痴呆症患者数增加，痴呆症治疗剂市场持续大幅扩大，预计2022年的市场规模与2013年的市场规模相比扩大至1.75倍。通常，痴呆症的内科治疗方法存在副作用的问题等，患者的负担大。另一方面，来自生物资源的物质的副作用少、安全、适合每天或持续摄取。因此，期待来自生物资源的显示神经功能调节作用的物质。

关于生物资源，如上所述，关于花色素苷，迄今为止以蓝莓、越橘为中心进行了研究，关于葡萄、葡萄果皮的研究不能说是充分的。

本发明的目的在于提供一种显示神经功能调节作用的葡萄果皮提取物。

用于解决问题的方案

本发明人着眼于作为生物资源的葡萄，进行了研究，结果发现，特定的葡萄果皮提取物可以显示优异的神经功能调节作用。而且还发现，特定的葡萄果皮提取物的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷含量高，在花色素苷的组成中具有特异性。本发明是基于下述见解而完成的，即，通过在提取葡萄果皮时，将锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷的含量控制在特定的范围，可以得到具有优异的神经功能调节作用的提取物。

根据本发明，可提供一种葡萄果皮提取物，其在干燥质量中含有15mg/g以上的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷。

锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷由下述式(1)表示。

[化学式1]

在葡萄果皮提取物中，锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷可以具有反阴离子的形态，可举出例如氯化物。

此外，根据本发明，可提供含有飞燕草色素-3-葡萄糖苷的上述的葡萄提取物，还可提供相对于1摩尔的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷含有0.01摩尔以上且1.5摩尔以下的飞燕草色素-3-葡萄糖苷的上述的葡萄果皮提取物。

飞燕草色素-3-葡萄糖苷由下述式(2)表示。

[化学式2]

在葡萄果皮提取物中，飞燕草色素-3-葡萄糖苷可以具有反阴离子的形态，可举出例如氯化物。

此外，根据本发明，可提供含有锦葵色素-3-葡萄糖苷的上述的葡萄提取物，还可提供相对于1摩尔的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷含有0.01摩尔以上且1.5摩尔以下的锦葵色素-3-葡萄糖苷的上述的葡萄果皮提取物。

锦葵色素-3-葡萄糖苷由下述式(3)表示。

[化学式3]

在葡萄果皮提取物中，锦葵色素-3-葡萄糖苷可以具有反阴离子的形态，可举出例如氯化物。

此外，根据本发明，可提供含有锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷的上述的葡萄提取物，还可提供相对于1摩尔的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷含有0.01摩尔以上且2.0摩尔以下的锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷的上述的葡萄果皮提取物。

锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷由下述式(4)表示。

[化学式4]

在葡萄果皮提取物中，锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷可以具有反阴离子的形态，可举出例如氯化物。

此外，根据本发明，可提供含有锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷-5-葡萄糖苷的上述的葡萄提取物，还可提供相对于1摩尔的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷含有0.01摩尔以上且2.0摩尔以下的锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷-5-葡萄糖苷的上述的葡萄果皮提取物。

锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷-5-葡萄糖苷由下述式(5)表示。

[化学式5]

在葡萄果皮提取物中，锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷-5-葡萄糖苷可以具有反阴离子的形态，可举出例如氯化物。

此外，根据本发明，可提供含有白藜芦醇的上述的葡萄提取物，还可提供相对于1摩尔的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷含有0.001摩尔以上的白藜芦醇的上述的葡萄果皮提取物。

白藜芦醇由下述式(6)表示。

[化学式6]

根据本发明，可提供葡萄果皮为选自紫葛葡萄(Vitis Coignetiae)、葛藟葡萄(Vitis flexuosa)、紫葛葡萄(Vitis Coignetiae)与葛藟葡萄(Vitis flexuosa)的杂交种、紫葛葡萄(Vitis Coignetiae)与欧洲葡萄(Vitis Vinifera)的杂交种、以及葛藟葡萄(Vitis flexuosa)与欧洲葡萄(Vitis Vinifera)的杂交种中的1种以上的葡萄的果皮的上述任一项的葡萄果皮提取物。

此外，根据本发明，可提供含有上述任一项的葡萄果皮提取物的食品组合物，进一步可提供作为酒精度数小于3％的饮料的上述的食品组合物。

此外，根据本发明，可提供含有上述任一项的葡萄果皮提取物的药物组合物。

此外，根据本发明，可提供上述的葡萄果皮提取物的制造方法，其使用有机溶剂从葡萄果皮中提取包含锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷的成分，进一步可提供使用葡萄果皮干燥物作为葡萄果皮，使用含酸的有机溶剂、含酸的有机溶剂与水的混合溶剂进行提取的葡萄果皮提取物的制造方法。

发明效果

本发明的葡萄果皮提取物显示出优异的神经功能调节作用。此外，根据本发明，能够通过简便的方法制造这样的葡萄果皮提取物。

附图说明

图1为示出实施例1的细胞存活实验的结果的图。

图2为示出实施例2的动物实验(抗炎作用确认实验。TNF-α(肿瘤坏死因子)的表达)的结果的图。

图3为示出实施例2的动物实验(抗炎作用确认实验。IL-6(白细胞介素-6)的表达)的结果的图。

图4为示出实施例3的动物实验(神经递质减少的抑制作用确认实验。去甲肾上腺素量)的结果的图。

图5为示出实施例3的动物实验(神经递质减少的抑制作用确认实验。多巴胺量)的结果的图。

图6为示出实施例4的动物实验中的平台测试(到达平台的时间)的结果的图。

图7为示出实施例4的动物实验中的探针测试(穿过设置有平台的位置的次数)的结果的图。

图8为示出实施例4的动物实验中的探针测试(设置有平台的位置的停留时间)的结果的图。

具体实施方式

以下，详细地说明本发明。

＜葡萄果皮提取物＞

本发明的葡萄果皮提取物在干燥质量中含有15mg/g以上的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷。

(葡萄果皮)

从锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷的含量的方面出发，葡萄果皮优选紫葛葡萄(Vitis Coignetiae)、葛藟葡萄(Vitis flexuosa)、紫葛葡萄(Vitis Coignetiae)与葛藟葡萄(Vitis flexuosa)的杂交种、紫葛葡萄(Vitis Coignetiae)与欧洲葡萄(Vitis Vinifera)的杂交种、或者葛藟葡萄(Vitis flexuosa)与欧洲葡萄(Vitis Vinifera)的杂交种的葡萄的果皮，更优选紫葛葡萄(Vitis Coignetiae)与欧洲葡萄(Vitis Vinifera)的杂交种、或者葛藟葡萄(Vitis flexuosa)与欧洲葡萄(Vitis Vinifera)的杂交种的葡萄的果皮。葡萄果皮能够为一种或两种以上葡萄的果皮。

(花色素苷的组成)

葡萄果皮提取物在干燥质量中含有15mg/g以上的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷。从神经功能调节的方面出发，锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷优选为20mg/g以上，更优选为25mg/g以上。上限没有特别限定，能够为500mg/g以下，为例如100mg/g。

葡萄果皮提取物优选含有飞燕草色素-3-葡萄糖苷，从神经功能调节作用的互补性的方面出发，飞燕草色素-3-葡萄糖苷的含量相对于1摩尔的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷，优选为0.01摩尔以上，更优选为0.1摩尔以上，并且，从神经功能调节作用的平衡的方面出发，飞燕草色素-3-葡萄糖苷的含量相对于1摩尔的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷，优选为1.5摩尔以下，更优选为1.0摩尔以下。

葡萄果皮提取物优选含有锦葵色素-3-葡萄糖苷，从神经功能调节作用的互补性的方面出发，锦葵色素-3-葡萄糖苷的含量相对于1摩尔的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷，优选为0.01摩尔以上，更优选为0.03摩尔以上，并且，从神经功能调节作用的平衡的方面出发，锦葵色素-3-葡萄糖苷的含量相对于1摩尔的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷，优选为1.5摩尔以下，更优选为1.0摩尔以下。

葡萄果皮提取物能够含有锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷。锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷的含量相对于1摩尔的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷，能够为0.01摩尔以上且2.0摩尔以下，优选为0.05摩尔以上且1.5摩尔以下。

葡萄果皮提取物能够含有锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷-5-葡萄糖苷。锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷-5-葡萄糖苷的含量相对于1摩尔的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷，能够为0.01摩尔以上且2.0摩尔以下，优选为0.05摩尔以上且1.5摩尔以下。

葡萄果皮提取物能够含有白藜芦醇。白藜芦醇的含量相对于1摩尔的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷，能够为0.001摩尔以上，能够为例如0.003摩尔以上，并且，能够为例如0.100摩尔以下。

(用途)

本发明的葡萄果皮提取物显示出优异的神经功能调节作用。神经功能调节作用是指与防止神经功能恶化、维持现状、恢复、改善、预防相关的作用。在后述的实施例中，教导了本发明的葡萄提取物对神经细胞的保护有效，进而教导了还显示出抗炎作用和神经递质减少的抑制作用。其详细的机理尚不明确，但认为是以锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷为代表的葡萄提取物中所含的成分的作用。

本发明的葡萄果皮提取物对与神经细胞损伤、神经细胞数量减少相关的神经退行性疾病、各种症状有效，其中可举出抗老化。具体而言，本发明的葡萄果皮提取物能够以预防、改善阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等神经退行性疾病等、抗压力、抗疲劳为目的来使用。其中，本发明的葡萄果皮提取物也能够以健康人为对象，例如能够以提高健康人的学习能力、记忆力、反射反应能力等神经功能为目的来使用。本发明的葡萄果皮提取物能够用于抗老化、抗压力、抗疲劳、恢复/提高学习能力、恢复/提高记忆力、恢复/提高反射反应能力。

作为本发明的葡萄果皮提取物的施用对象，可举出哺乳动物，为例如人类、家畜(马、牛、猪等)、宠物(狗、猫等)、实验(试验)动物(小鼠、大鼠等)，优选为人类。

本发明的葡萄果皮提取物的施用量能够考虑施用对象、年龄、体重、症状等适当设定，在对例如人类施用的情况下，每1kg体重的施用对象，可举出0.2mg/天以上且100mg/天以下，优选为0.5mg/天以上，更优选为1.0mg/天以上，并且，优选为40mg/天以下，更优选为20mg/天以下。在施用对象是除了人类以外的情况下，能够通过适当增减上述范围来设定。施用可以是1天施用1次，也可以分成多次施用。施用时间能够考虑施用对象、年龄、体重、症状等适当设定，优选连续使用。

(制造方法)

葡萄果皮提取物能够通过使用有机溶剂从葡萄果皮中提取包含锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷的成分来得到。

在上述中，作为葡萄果皮，能够使用葡萄果皮干燥物，可举出例如将葡萄果皮温风或热风干燥而得的干燥物、冷冻干燥而得的干燥物。

提取优选使用含酸的有机溶剂、或含酸的有机溶剂与水的混合溶剂来进行。作为酸，优选强酸，可举出盐酸、硫酸、甲酸、三氟乙酸等，优选作为挥发性酸的盐酸、甲酸。作为有机溶剂，优选极性溶剂，可举出甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃等，优选甲醇、乙醇。酸的含量能够适当地进行调节。

能够通过将包含葡萄果皮的溶液使用均质器或高速高压提取装置来进行提取。从提取效率的方面出发，优选在高压下(例如，5MPa以上且15MPa以下)进行处理，得到上述溶液。能够将得到的溶液根据情况进行过滤，对滤液进行浓缩，使其干燥(例如温风干燥、热风干燥或冷冻干燥)，由此得到葡萄果皮提取物。或者，也可以将得到的溶液离心分离，回收上清，在上清溶液中加入分离用溶剂，分离包含葡萄果皮提取物的水层，浓缩该水层，使其干燥(例如温风干燥、热风干燥或冷冻干燥)，得到葡萄果皮提取物。作为分离用溶剂，只要是与水发生相分离的有机溶剂就没有特别限定，可举出乙酸乙酯、甲苯、乙酸丁酯、己烷、庚烷、二氯甲烷、环戊基甲基醚等。

＜食品组合物＞

根据本发明，可提供含有上述葡萄果皮提取物的食品组合物。食品组合物能够为功能性食品、营养辅助食品、健康辅助食品、营养强化食品、功能性标示食品、特别用途食品、特定保健用食品或营养功能食品。

食品组合物能够包含在食品制造上可接受的成分，可举出例如载体、赋形剂(例如乳糖、蔗糖、糊精、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮)、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、混悬剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、溶剂(水、盐水、乙醇等有机溶剂)。食品还能够包含蛋白质、糖类、脂类、维生素、矿物质、有机酸、有机碱、香料等。

食品组合物的形态没有特别限定，可举出固体、液体、混合物、混悬液、糊、凝胶、粉末、胶囊，能够制成饮料、零食、调味品、配菜和加工食品。食品组合物还可以为保健品。其中，优选饮料，更优选酒精度数小于3％的饮料。食品组合物能够通过在食品中配合上述葡萄果皮提取物而得到。

食品组合物的用途(作为对象的疾病和症状等、施用方法(施用对象、施用量、施用时间))能够与上述葡萄果皮提取物同样地设定。具体而言，可举出抗老化、抗压力、抗疲劳、恢复/提高学习能力、恢复/提高记忆力、恢复/提高反射反应能力用的食品组合物。施用量能够是使得葡萄果皮提取物的施用量满足上文对于葡萄果皮提取物所述的量的量。

＜药物组合物＞

本发明还涉及含有上述葡萄果皮提取物的药物组合物。药物组合物能够为药品或准药品(Quasi drug)。

药物组合物能够包含制药上可接受的成分，可举出例如载体、赋形剂(例如乳糖、蔗糖、糊精、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮)、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、混悬剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、溶剂(例如水、盐水、乙醇等有机溶剂)。还能够包含具有其他药理活性的药理成分。

药物组合物能够作为药品或准药品使用。药物组合物可以为口服施用用，也可以为非口服施用，优选口服施用。在口服施用的情况下，可举出散剂、片剂、包衣剂、糖衣片、软胶囊或硬胶囊、液剂、乳浊剂、混悬剂的形态。在非口服施用的情况下，可举出栓剂、注射剂、输液、软膏、霜、凝胶剂的形态。

医药组合物的用途(作为对象的疾病和症状等、施用方法(施用对象、施用量、施用时间))能够与葡萄果皮提取物同样地设定。具体而言，可举出抗老化、抗压力、抗疲劳、恢复/提高学习能力、恢复/提高记忆力、恢复/提高反射反应能力用的药物组合物。施用量能够是使得葡萄果皮提取物的施用量满足上文对于葡萄果皮提取物所述的量的量。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行更具体说明。但是，本发明的技术范围不被这些实施例所限制。

＜试样的制备＞

在试样的制备中，使用以下品种名的葡萄。

·富士的梦(行者的水(葛藟葡萄)与梅洛(欧洲葡萄)的杂交种)

·Eight Gold(行者的水(葛藟葡萄)与黑比诺(Pinot noir)(欧洲葡萄)的杂交种)

·猫眼葡萄(Pione)(杂种)

·甲斐路(杂种)

·Muscat Bailey A(杂种)

在试样的制备中，使用以下提取方法。

·提取方法1

压榨葡萄的果实，将除去果汁后的果皮以相互不接触的方式放置在不锈钢制的网笼上，使用干燥机吹70℃的温风，得到葡萄果皮干燥物。在6g的得到的葡萄果皮干燥物中加入40mL的2％甲酸甲醇水(甲醇∶超纯水∶甲酸＝70∶28∶2(v/v/v))，在室温遮光条件下搅拌(360rpm)12小时，得到提取液。将得到的提取液用滤纸(ADVANTEC株式会社制定量滤纸No.5A、110mm)进行过滤，将过滤后的提取溶液浓缩和冷冻干燥，得到葡萄果皮提取物的粉末。

·提取方法2

将葡萄果皮(6～7粒的量)放入到不锈钢制的笊篱中，用自来水清洗，不要使其破皮。将洗涤后的果皮放入到厚的带拉链的塑料袋中，进行冷冻干燥。将1g的冷冻干燥后的果皮置于高速高压提取装置(Nihon BUCHI K.K.制、E-914)中，用1％甲酸甲醇(甲醇∶甲酸＝99∶1(v/v))在10MPa的高压下提取3次，得到提取液。将100mL左右的得到的提取液使用旋转蒸发器进行浓缩和冷冻干燥，得到葡萄果皮提取物的粉末。

将上述得到的葡萄果皮提取物的粉末溶解于甲醇，进行高效液相色谱-质量分析(HPLC/MS)，确认1g的提取物粉末所包含的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷、锦葵色素-3-葡萄糖苷、飞燕草色素-3-葡萄糖苷、锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷、锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷-5-葡萄糖苷、白藜芦醇的量。成分的鉴定和定量在用LC-MS分析的库进行确认的同时通过与标准品的测定值的对比来进行。结果如下所示。

[表1]

使用上述提取物1、4和6制备以下的试样1～4。

试样1：将上述提取物1溶解于70％乙醇溶液(乙醇∶水＝70∶30(v/v))，调节至得到的溶液中的提取物粉末的浓度为100μg/mL。锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷的浓度为12.56μM(以氯化物计算)。

试样2：将上述提取物4溶解于70％乙醇溶液(乙醇∶水＝70∶30(v/v))，调节至得到的溶液中的提取物粉末的浓度为100μg/mL。锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷的浓度为1.43μM(以氯化物计算)。

试样3：将上述提取物6溶解于70％乙醇溶液(乙醇∶水＝70∶30(v/v))，调节至得到的溶液中的提取物粉末的浓度为100μg/mL。锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷的浓度为0.80μM(以氯化物计算)。

试样4：将上述提取物1溶解于超纯水(Milli-Q(注册商标)水)中，调节至得到的溶液中的提取物粉末的浓度为7.5mg/mL。溶液中的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷的浓度为651μg/mL(以氯化物计算)。

＜实施例1：细胞存活实验＞

通过以下的实验确认葡萄果皮提取物对神经细胞死亡的抑制作用。

在孔板(BD Biocoat株式会社制，孔数96)的各孔中，以2×10⁵个细胞/mL的浓度、以100μL/孔接种SH-SY5Y(神经细胞的模型细胞，ATCC株式会社制)，在37℃、5％CO2的条件下培养24小时。细胞培养基使用在F12/DMEM培养基(Gibco株式会社制)中混合1％非必需氨基酸(Gibco株式会社制)、15％FBS(Bio West株式会社制)、1％青霉素/链霉素(Lonza株式会社制)而成的培养基。

24小时后，用抽吸器完全除去培养基，以100μL/孔添加Opti-MEM(Gibco株式会社制)的培养基，在37℃、5％CO2的条件下培养24小时。

然后，用抽吸器完全除去Opti-MEM，以110μL/孔添加将MTT试剂(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，5mg/mL)混合在Opti-MEM中(MTT试剂∶Opti-MEM＝1∶10)得到的混合物，在37℃、5％CO2的条件下培养24小时。接着，以100μL/孔添加10％SDS(十二烷基硫酸钠)水溶液，在37℃、5％CO2的条件下培养24小时。

然后，使用酶标仪(大日本住友制药株式会社制)测定570nm处的吸光度，求出MTT甲臜产量，计算细胞相对存活率(图1中，“对照”)。

将SH-SY5Y细胞接种到孔板(BD Biocoat株式会社制、孔数96孔)中24小时后，利用抽吸器完全除去培养基，以100μL/孔添加将β-淀粉样蛋白(Beta-Amyloid 1-42、AnaSpec株式会社制)混合在Opti-MEM(Gibco株式会社制)中至最终浓度为15μM而成的混合物，在37℃、5％CO2的条件下培养72小时，诱导细胞死亡，除此以外，与上述同样地求出MTT甲臜产量，计算细胞相对存活率(图1中，“Aβ”)。

将SH-SY5Y细胞接种到孔板(BD Biocoat株式会社制、孔数96孔)中24小时后，利用抽吸器完全除去培养基，以90μL/孔添加将试样1混合在Opti-MEM中至最终浓度为200μg/mL而成的混合物，放置10分钟，接着以10μL/孔添加将β-淀粉样蛋白(Beta-Amyloid 1-42、AnaSpec株式会社制)混合在Opti-MEM中至浓度为150μM而成的混合物，在37℃、5％CO2的条件下培养72小时，诱导细胞死亡，除此以外，与上述同样地求出MTT甲臜产量，计算细胞相对存活率(图1中，“Aβ 提取物1”)。

使用试样2代替试样1，除此以外，与上述同样地进行，计算细胞相对存活率(图1中，“Aβ 提取物4”)。

使用试样3代替试样1，除此以外，与上述同样地进行，计算细胞相对存活率(图1中，“Aβ 提取物6”)。

比较图中的“对照”和“Aβ”，相对于前者，后者的细胞相对存活率显著降低，可知通过淀粉样β蛋白的处理诱导了细胞死亡。

图中的“Aβ 提取物1”的细胞相对存活率显著高于“Aβ”，可知得到了细胞死亡的抑制作用。其细胞相对存活率的高低与“对照”等同，教导了提取物1不仅具有细胞死亡的抑制作用，而且还可能具有细胞增殖作用。另一方面，相较于“Aβ”，“Aβ 提取物4”和“Aβ 提取物6”的细胞相对存活率得到改善，但不及“Aβ 提取物1”。

＜实施例2：动物实验(抗炎作用确认实验)＞

通过以下的实验确认葡萄果皮提取物的抗炎作用。

实验中使用的小鼠和施用内容如下。除了施用内容以外的饲养条件在所有的组中是一样的。

提取物施用(SAMP8)组：按照每天每1kg小鼠体重施用3.34mL的试样4的方式对10只快速老化小鼠(SAMP8)(从Japan SLC,Inc.获得。16周龄、体重28～30g)口服施用38天(图2和图3中，“快速老化小鼠 提取物1”)。在3.34mL的试样4中包含25mg的提取物粉末，包含2.17mg的锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷。

每1kg小鼠体重25mg提取物粉末的人类等效剂量是每1kg人类体重2.0mg提取物粉末。

此外，每1kg小鼠体重2.17mg锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷的人类等效剂量为每1kg人类体重0.18mg锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷。

水施用(SAMP8)组：将与施用至提取物施用(SAMP8)组的试样4大致相同量的超纯水(Milli-Q(注册商标)水)对10只快速老化小鼠(SAMP8)(从Japan SLC,Inc.获得。16周龄、体重28～30g)口服施用38天(图2和图3中，“快速老化小鼠”)

水施用(SAMR1)组：将与施用至提取物施用(SAMP8)组的试样4大致相同量的超纯水(Milli-Q(注册商标)水)对10只正常老化小鼠(SAMR1)(从Japan SLC,Inc.获得。16周龄、体重28.5～34g)口服施用38天(图2和图3中，“正常老化小鼠”)

动物实验的内容如下所述。

在口服施用结束后的第二天，从各组小鼠摘出大脑皮质，提取RNA，使用实时PCR法对TNF-α(肿瘤坏死因子)和IL-6(白细胞介素-6)的基因表达进行分析。

另外，关于RNA提取，将ISOGEN试剂(由Nippon Gene Co.，Ltd.制)加入到摘出的大脑皮层中，用均质器均化，然后根据Nippon Gene Co.，Ltd.推荐的方案提取RNA(参照URL：https：//www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/tds/tds#isogen-rna-dna-protein.pdf参照)。

此外，关于实时PCR法，使用TaqMan Real-TimePCR用试剂盒(Thermo Fisher Scientific株式会社制)，按照Thermo Fisher Scientific株式会社推荐的方案进行(参照URL：https：//assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manual s/4304449#TaqManPCRMM#UG.pdf)。

如图2和图3所示，相对于正常老化小鼠，在快速老化小鼠中确认了作为炎症性细胞因子的TNF-α和IL-6的表达显著增加。另一方面，在施用了提取物的快速老化小鼠中，表达被抑制到与正常老化小鼠相同的程度。

＜实施例3：动物实验(神经递质减少的抑制作用确认实验)＞

通过以下的实验确认了葡萄果皮提取物对神经递质减少的抑制作用。

实验中使用的小鼠和施用内容如下。除了施用内容以外的饲养条件在所有的组中是一样的。

提取物施用(SAMP8)组：按照每天每1kg小鼠体重施用3.34mL的试样4的方式对10只快速老化小鼠(SAMP8)(从Japan SLC,Inc.获得。16周龄、体重28～30g)口服施用38天(图4和图5中，“快速老化小鼠 提取物1”)。

水施用(SAMP8)组：将与施用至提取物施用(SAMP8)组的试样4大致相同量的饮用水对10只快速老化小鼠(SAMP8)(从Japan SLC,Inc.获得。16周龄、体重28～30g)口服施用38天(图4和图5中，“快速老化小鼠”)

水施用(SAMR1)组：将与施用至提取物施用(SAMP8)组的试样4大致相同量的饮用水对10只正常老化小鼠(SAMR1)(从Japan SLC,Inc.获得。16周龄、体重28.5～34g)口服施用38天(图4和图5中，“正常老化小鼠”)

动物实验的内容如下所述。

口服施用结束后的第二天，从各组小鼠摘出大脑皮质，在大脑皮质中加入RIPA Lysis Buffer System(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)，使用均质器进行均化，进行蛋白质提取。然后进行离心(10000×g、30分钟)，回收上清，进行去甲肾上腺素和多巴胺的定量。

去甲肾上腺素的定量按照酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(LDN株式会社制、BAE-5200)进行。定量是通过测定450nm处的吸光度，由使用了浓度已知的多巴胺的标准曲线得到。

多巴胺的定量按照酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(LDN株式会社制、BAE-5300)进行。定量是通过测定450nm处的吸光度，由使用了浓度已知的多巴胺的标准曲线得到。

如图4和图5所示，相对于正常老化小鼠，在快速老化小鼠中确认了作为神经递质的去甲肾上腺素和多巴胺的显著减少。另一方面，在施用了提取物的加速老化小鼠中，基因的表达与正常老化小鼠为相同程度。

＜实施例4：动物实验(学习记忆能力的改善作用确认实验)＞

通过以下的实验确认了施用葡萄果皮提取物对动物的学习记忆能力的改善作用。

实验中使用的小鼠和施用内容如下。除了施用内容以外的饲养条件在所有的组中是一样的。

提取物施用(SAMP8)组：按照每天每1kg小鼠体重施用3.34mL的试样4的方式对10只快速老化小鼠(SAMP8)(从Japan SLC,Inc.获得。16周龄、体重28～30g)口服施用30天(图6～图8中，“快速老化小鼠 提取物1”)。

水施用(SAMP8)组：将与施用至提取物施用(SAMP8)组的试样4大致相同量的饮用水对10只快速老化小鼠(SAMP8)(从Japan SLC,Inc.获得。16周龄、体重28～30g)口服施用30天(图6～图8中，“快速老化小鼠”)。

水施用(SAMR1)组：将与施用至提取物施用(SAMP8)组的试样4大致相同量的饮用水对10只正常老化小鼠(SAMR1)(从Japan SLC,Inc.获得。16周龄、体重28.5～34g)口服施用30天(图6～图8中，“正常老化小鼠”)。

单品(M3，5G)施用(SAMP8)组：为了参考，将锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷氯化物(富士胶片和光纯药株式会社制)按照每1天的施用量为每1kg小鼠体重2.17mg的量对10只快速老化小鼠(SAMP8)(从Japan SLC,Inc.获得。16周龄、体重28～30g)口服施用30天(图6～图8中，“快速老化小鼠 单品(M3，5G)”)。

动物实验的内容如下所述。

对于各组的小鼠，从口服施用结束的第二天开始进行Morris水迷宫试验(平台测试、探针测试)。作为Morris水迷宫，准备直径120cm、深45cm的水池。使用如下的水池：在水池的水面下设置透明的台(平台)，在水池的内壁以等间隔设置4处记号。

平台测试：

将小鼠放入水池中，测量小鼠到达平台所花费的时间。在此，将限制时间设为60秒，在无法到达的情况下记作60秒。到达后，将小鼠置于平台上15秒。对于每组中的每只小鼠，每天进行1次该实验，持续7天。结果示于图6。

探针测试：

在试验最后一天，移除平台并同样地将小鼠放入水池中，测定在60秒内小鼠穿过设置有平台的位置的次数和小鼠在同位置停留的时间。将结果示于图7和图8。

平台测试是将小鼠依靠记号等视觉刺激到达平台所花费的时间作为指标来评价空间学习记忆的试验。如图6所示，对于正常老化小鼠(施用水)，到达时间渐渐缩短，与此相对，对于快速老化小鼠(施用水)，未观察到到达时间的缩短。在施用了提取物的快速老化小鼠中，观察到与正常老化小鼠(施用水)相同程度的到达时间的缩短。与施用了锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷的快速老化小鼠相比，施用了提取物1的快速老化小鼠的到达时间的缩短幅度大。

探针测试是根据穿过设置有平台的位置的次数和在同位置的停留时间来评价小鼠的记忆保持能力的试验。如图7和图8所示，快速老化小鼠(施用水)与正常老化小鼠(施用水)相比，穿过次数显著减少，并且，停留时间显著缩短。在施用了提取物1的快速老化小鼠中，观察到与正常老化小鼠(施用水)相同程度的穿过次数和停留时间。与施用了锦葵色素-3,5-双葡萄糖苷的快速老化小鼠相比，施用了提取物的快速老化小鼠的穿过次数多并且停留时间长。

如上所述，确认了通过本发明的提取物的施用，动物的学习记忆能力得到改善。

产业上的可利用性

本发明的葡萄果皮提取物对神经细胞保护有效，通过该保护发挥神经功能调节作用，能够期待改善、预防阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等神经退行性疾病等，能够期待发展为保健品等食品、药品及相关市场的扩大。本发明的葡萄果皮提取物来源于天然物质，因此认为是安全且适于每天或持续摄取的。综上所述，本发明在产业上的有用性高。