一种miRNA-15A用于治疗高表达KIF3B肿瘤中的用途的制作方法

一种mirna
‑
15a用于治疗高表达kif3b肿瘤中的用途
技术领域
1.本发明涉及生物技术和生物医药领域，具体提供了一种mirna
‑
15a用于治疗高表达kif3b肿瘤中的用途。


背景技术：

2.三阴性乳腺癌
3.乳腺癌是全球发病率和致死率最高的癌症之一，2020年全球乳腺癌新发病例和死亡病例分别为226万和68万，占女性癌症新发病例24％和死亡病例15％，发病率和死亡率均为全球所有类型癌症第一。与其他国家和地区相似，乳腺癌也是中国女性癌症发病率第一，严重威胁着中国女性的生命健康安全。
4.面对严峻的形势，乳腺癌的研究和防治亟待重视。早期乳腺癌治疗主要以手术为主，致死率较低，痊愈率高；但乳腺癌具有浸润生长和转移的特性，中晚期乳腺癌常常伴有肝、肺和骨髓的其他脏器的转移，因此手术治疗效果不佳，中晚期乳腺癌治疗总体预后较差，容易复发、致死率高。为了降低乳腺癌患者承受的痛苦，提高乳腺癌患者的生存质量，增加乳腺癌的治愈率和改善预后，针对乳腺癌的靶向性治疗药物亟待开发。
5.三阴性乳腺癌(triple
‑
negative breast cancer，tnbc)是指雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)和人类表皮生长因子受体2(her
‑
2)的免疫组化检测均为阴性的一类乳腺癌，现阶段治疗和预后较差。三阴性乳腺癌是治疗难度最高的乳腺癌分型之一，约占乳腺癌病例的15％，但在所有与乳腺癌相关的死亡中占25％。与其他分子分型乳腺癌相比，三阴性乳腺癌复发率较高，无进展生存期短。由于靶向分子阴性，常见靶向药对三阴性乳腺癌治疗效果低，因此临床上对三阴性乳腺癌的内科治疗以化疗为主，治疗副作用大，疗效相对其他分型乳腺癌较差。而随着对三阴性乳腺癌分子分型的深入探索，靶向治疗的研究逐渐成为关注的焦点。
6.mirna
7.mirna是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链rna分子，它们在哺乳动物中参与转录后基因表达调控。mirna通常靶向一个或多个mrna，通过抑制翻译或降解靶标mrna而调节基因的表达。人类基因组中约存在1000条mirna，估计调节超过60％的哺乳动物基因；不同形式的细胞和组织类型mirna表达水平不同，可能参与了各器官生理功能的执行过程；而且在多种病理状态下，mirna呈现异常表达，在疾病发生、发展和转归中发挥了重要作用，使基于mirna的治疗方式研究呈现美好前景。
8.mirna基因通常是在核内由rna聚合酶ii(polii)转录的，最初产物为大的具有帽子结构(7mgpppg)和多聚腺苷酸尾巴(aaaaa)的pre
‑
mirna。pre
‑
mirna在核酸酶drosha和其辅助因子pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的pre
‑
mirna。ran
–
gtp和exportin5将pre
‑
mirna输送到细胞质中。随后，另一个核酸酶dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的mirna:mirna*双链。这种双链很快被引导进入沉默复合体(risc)复合体中，其中一条成熟的单链mirna保留在这一复合体中。成熟的mirna结合到与其互补的mrna的位点通过碱基
配对调控基因表达。
9.在哺乳动物中，与靶mrna不完全互补的mirna在蛋白质翻译水平上抑制其表达。每个mirna可以有多个靶基因，而几个mirnas也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个mirna来调控多个基因的表达，也可以通过几个mirnas的组合来精细调控某个基因的表达。最近的研究发现，mirna表达与多种癌症相关，大约50％得到注解的mirnas在基因组上定位于肿瘤相关位点，说明mirnas在肿瘤发生过程中起至关重要的作用。
10.wnt/β
‑
catenin信号通路
11.wnt信号通路，广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，对动物的生长发育起着至关重要的作用。在正常生长的成熟机体中，细胞的生长、增殖和分化等具有一定的规律性和有序性，有限生长的细胞在没有wnt信号分子刺激时，wnt通路呈关闭状态。但当wnt信号通路被激活，就可能导致许多细胞出现灾难性的变化，如：细胞出现异常的增生和分化，导致肿瘤形成。
12.经典的wnt信号通路，也称为wnt/β
‑
catenin信号途径，其激活是以β
‑
catenin异位于细胞核内为基础来启动wnt途径，从而推动细胞周期发展或产生异常蛋白，使细胞癌变。许多肿瘤细胞中存在不同程度β
‑
catenin基因突变，如结直肠癌、干细胞癌、甲状腺癌、卵巢癌和皮肤癌细胞等。
13.apc，gsk
‑
3和axin，可与β
‑
catenin形成复合物，促进β
‑
catenin发生磷酸化，进而与泛素化蛋白结合被泛素化降解。这些是wnt途径的负调控因子，起到负调控作用。在多数癌症细胞中表达这些因子的基因被检测到发生突变或缺失，β
‑
catenin将不再被磷酸化，而是在胞浆中集聚并被转运进入细胞核内。核内β
‑
catenin与t细胞因子/淋巴增强因子(tcf/lef)等转录因子和legless蛋白(bcl9和bcl9l)及pygo蛋白结合形成复合物，后启动靶基因fgf20、dkk1、ccnd1等的转录。


技术实现要素：

14.为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种以mirna治疗三阴性乳腺癌的方法，该mirna与靶基因kif3b的mrna序列具有高亲和力，能够通过与kif3b的mrna的结合来阻断kif3b，从而抑制wnt/β
‑
catenin信号通路的信号传导。由于研究发现在三阴性乳腺癌中wnt/β
‑
catenin信号通路异常激活，该mirna疗法在靶向抑制wnt/β
‑
catenin信号通路异常的三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成等方面起着重要的作用，其在三阴性乳腺癌靶向治疗方面具有巨大的应用价值。
15.本发明的另一目的在于提供上述mirna的衍生物，该衍生物也能够与kif3b具有特异性高亲和力，且特异性与kif3b结合。
16.本发明的再一目的在于提供上述mirna及其衍生物的应用。
17.为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
18.本发明一个方面提供了一种mirna、其前体pre
‑
mirna、或其的衍生物在制备抑制高表达kif3b的肿瘤细胞增殖的药物中的用途；所述mirna，其核苷酸序列如seq id no:1所示，uagcagcacauaaugguuugug seq id no：1；所述前体pre
‑
mirna在细胞内能通过核酸酶dicer加工成成熟的mirna，所述mirna的序列如seq id no.1所示。
19.本发明另一个方面提供了本发明所述的mirna、前体pre
‑
mirna、或其的衍生物在
制备促进高表达kif3b的肿瘤细胞凋亡药物中的用途；所述mirna，其核苷酸序列如seq id no:1所示，uagcagcacauaaugguuugug seq id no：1；所述前体pre
‑
mirna在细胞内能通过核酸酶dicer加工成成熟的mirna，所述mirna的序列如seq id no.1所示。
20.本发明再一个方面提供了本发明所述的mirna、mirna的衍生物在制备治疗降低高表达kif3b的肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力的药物中的用途。
21.本发明再一个方面提供了本发明所述的mirna、前体pre
‑
mirna、mirna的衍生物在制备治疗高表达kif3b的肿瘤疾病的药物中的用途。
22.在本发明的技术方案中，高表达kif3b的肿瘤细胞选自三阴性乳腺癌细胞系。例如三阴性乳腺癌细胞系为mda
‑
mb
‑
231。
23.在本发明的技术方案中，高表达kif3b的肿瘤疾病选自乳腺癌。
24.在本发明的技术方案中，所述的高表达kif3b的肿瘤疾病选自pr、er和her2三个指标均为阴性的三阴性乳腺癌。
25.本发明再一个方面提供了一种mirna、其前体pre
‑
mirna、或其的衍生物在制备kif3b蛋白抑制剂中的用途；所述mirna，其核苷酸序列如seq id no:1所示，uagcagcacauaaugguuugug seq id no：1；所述前体pre
‑
mirna在细胞内能通过核酸酶dicer加工成成熟的mirna，所述mirna的序列如seq id no.1所示。
26.本发明再一个方面提供了一种mirna、其前体pre
‑
mirna、或其的衍生物在制备中治疗kif3b蛋白升高导致的疾病的药物中的用途；所述mirna，其核苷酸序列如seq id no:1所示，uagcagcacauaaugguuugug seq id no：1；所述前体pre
‑
mirna在细胞内能通过核酸酶dicer加工成成熟的mirna，所述mirna的序列如seq id no.1所示。
27.优选地，kif3b蛋白升高导致的疾病为三阴性乳腺癌。
28.本发明再一个方面提供了一种mirna、其前体pre
‑
mirna、或其的衍生物在制备β
‑
catenin蛋白抑制剂中的用途；所述mirna，其核苷酸序列如seq id no:1所示，uagcagcacauaaugguuugug seq id no：1；所述前体pre
‑
mirna在细胞内能通过核酸酶dicer加工成成熟的mirna，所述mirna的序列如seq id no.1所示。
29.本发明再一个方面提供了一种药物，所述药物包含上述mirna、上述前体pre
‑
mirna或其衍生物中的至少一种。
30.在本发明的技术方案中，所述药物含有一种或者是多种药学上可以接受的载体。
31.在本发明的技术方案中，所述药学上可以接受的载体优选为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等；
32.在本发明的技术方案中，所述的药物的制剂形式为片剂、粒剂、胶囊、口服液或注射剂，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。
33.本发明再一个方面提供了一种用于检测kif3b检测试剂在制备检测三阴性乳腺癌检测试剂中的应用。
34.本发明再一个方面提供了前述mirna或mirna的衍生物的抗体。
35.有益效果
36.(1)本发明提供了一种抑制kif3b基因的mirna
‑
15a及其衍生物，所述的mirna及其衍生物能够专一性与kif3b核酸序列结合，并特异性抑制wnt/β
‑
catenin信号通路。
37.(2)本发明首次证明kif3b的高表达与三阴性乳腺癌的增殖、侵染、迁移、侵袭和克
隆形成能力相关，且证明了降低kif3b的表达，能够实现抑制三阴性乳腺癌的增殖、侵染、迁移、侵袭和克隆形成能力。
38.(3)本发明首次证明降低kif3b表达可增加β
‑
catenin的泛素化修饰从而增加β
‑
catenin的蛋白酶体途径降解，抑制wnt/β
‑
catenin信号通路信号传导。
39.(4)本发明筛选得到的mirna及其衍生物可以通过阻断wnt/β
‑
catenin的信号通路抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移、侵袭和克隆形成能力，可以作为kif3b蛋白表达的抑制类核酸药物，可用于制备预防和/或治疗三阴性乳腺癌药物。能够在医学与生物学领域得到广泛的应用，并产生巨大的社会与经济效益。
附图说明
40.图1为实施例1
‑
2的乳腺癌系统增殖、克隆、细胞迁移和侵袭能力的结果。mir
‑
15a分别抑制乳腺癌mda
‑
mb
‑
231和mcf7细胞系的细胞增殖、克隆形成、细胞迁移、侵袭等能力，mir
‑
15a对乳腺癌细胞的抑制不依赖er、pr和her2等常见靶标的表达。其中a为ncmimic mir
‑
15a、mir
‑
15a inhibitor，对mda
‑
mb
‑
231和mcf7细胞系细胞迁移、侵袭结果的细胞显微照片图，b为ncmimic mir
‑
15a、mir
‑
15a inhibitor，对mda
‑
mb
‑
231和mcf7细胞系细胞迁移、侵袭结果的数值统计结果。c为对照、ncmimic mir
‑
15a、mir
‑
15a inhibitor，对mda
‑
mb
‑
231和mcf7细胞系细胞ncmimic mir
‑
15a、mir
‑
15a inhibitor，对mda
‑
mb
‑
231和mcf7细胞系细胞增殖和克隆形成培养板照片结果，d为c数据统计结果图。
41.图2为实施例3中mirna
‑
15a下调β
‑
catenin的实验结果。在乳腺癌细胞系中mir
‑
15a可抑制wnt/β
‑
catenin通路下游信号，下调survivin、cyclin d1、c
‑
myc等与细胞增殖、存活相关基因。其中，a和b显示了针对mcf7和mda
‑
mb
‑
231细胞western blotting检测各组分和全细胞蛋白水平结果，c和d为以qpcr定量检测各基因表达实验结果。
42.图3为实施例3中mirna
‑
15a下调β
‑
catenin的实验结果。mir
‑
15a下调β
‑
catenin总蛋白水平，同时下调入核作为转录因子的β
‑
catenin的蛋白水平。
43.图4为抑制kif3b导致wnt/β
‑
catenin通路下游的激活的结果图，cyclind1、c
‑
myc、survivin等蛋白表达增加，从而导致细胞增殖，抑制凋亡。
44.图5为实施例4实验结果图，显示了kif3b基因是mir
‑
15a的靶标，mir
‑
15a抑制kif3b表达。
45.图6为实施例4实验结果图，显示了抑制kif3b可下调wnt/β
‑
catenin通路信号。
具体实施方式
46.为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
47.实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
48.实施例1mirna
‑
15a抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭
49.①
将乳腺癌细胞mcf7和三阴性乳腺癌细胞mda
‑
mb
‑
231以1
×
106个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为2ml，培养24h，更换新鲜带血清培养基；
50.②
分别将对照nc mimic、mir
‑
15a mimic和mir
‑
15a inihibitor以无血清培养基
稀释，并与同样以无血清培养基稀释的lipo3000混合，比例为每1μg rna添加2μl lipo3000；
51.mirna
‑
15a，其核苷酸序列如seq id no:1所示，uagcagcacauaaugguuugug seq id no：1
52.③
6孔细胞培养板按顺序分别加入第二步的混合物，每孔等比加入2.5
‑
5μg rna，孵育12h，更换新培养基；
53.④
消化细胞，无血清培养基重悬，分别接种于transwell细胞皿小室和预铺了matrigel的transwell细胞皿小室中，下室加入带血清培养基，24
‑
36h后以棉签擦除小室上侧细胞；
54.⑤
将小室下侧细胞以pbs清洗，2％多聚甲醛固定30min，结晶紫溶液染色45min，在显微镜下观察拍照，实验结果见图1a和b，实验结果显示：mir
‑
15a mimic对两种乳腺癌细胞系的迁移和侵袭均有抑制作用，而mir
‑
15a inhibitor对乳腺癌迁移和侵袭起促进作用，证明mir
‑
15a对乳腺癌细胞迁移和侵袭均有抑制效果，特别对于三阴性乳腺癌同样有效。
55.实施例2mirna
‑
15a抑制乳腺癌细胞的克隆形成能力
56.①
将mcf7和mda
‑
mb
‑
231以1
×
106个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为2ml，培养24h，更换新鲜带血清培养基；
57.②
分别将对照pbs、阴性对照mirna mimic、mir
‑
15a mimic和mir
‑
15a inihibitor以无血清培养基稀释，并与同样以无血清培养基稀释的lipo3000混合，比例为每1μg rna添加2μl lipo3000；
58.③
6孔细胞培养板按顺序分别加入第二步的混合物，每孔等比加入2.5
‑
5μg rna，孵育12h，更换新培养基；
59.④
24h后将处于对数生长期的mcf7和mda
‑
mb
‑
231细胞消化并计数，以每孔200个密度接种于6孔细胞培养皿中，细胞贴壁后更换为0.5％fbs培养基；
60.⑤
每3天重复一次上述转染步骤，至2周或较多细胞克隆形成(细胞数≥60)，pbs洗涤细胞，2％多聚甲醛固定30min，结晶紫染色45min，于显微镜下观察计数，实验结果见图1c和d，结果显示：mir
‑
15a mimic对两种乳腺癌细胞系的增殖均有抑制作用，而mir
‑
15a inhibitor对乳腺癌迁增殖起促进作用，这证明mir
‑
15a对抑制乳腺癌细胞增殖和克隆形成，对于三阴性乳腺癌同样有效。
61.实施例3mirna
‑
15a通过下调β
‑
catenin抑制wnt通路及其下游基因
62.①
将mcf7和mda
‑
mb
‑
231以1
×
106个/孔接种于6孔细胞培养板中，过夜后更换新鲜带血清培养基；
63.②
分别将阴性对照mirna mimic、mir
‑
15a mimic和mir
‑
15a inihibitor以无血清培养基稀释，并与同样以无血清培养基稀释的lipo3000混合，比例为每1μg rna添加2μl lipo3000；
64.③
6孔细胞培养板按顺序分别加入第二步的混合物，每孔等比加入5μg rna，孵育12h，更换新培养基；
65.④
48h后收集细胞提取rna，并以qpcr定量检测各基因表达，结果见图2c和d；
66.⑤
72h后收集细胞,取其中一部分细胞组分分离，以western blotting检测各组分和全细胞蛋白水平，实验结果见图2a、b以及图3。
67.实验结果显示：mir
‑
15a mimic可有效下调细胞β
‑
catenin蛋白水平，从而抑制wnt/β
‑
catenin通路下游基因如ccnd1和survivin表达；mir
‑
15a inhibitor可上调β
‑
catenin蛋白水平，激活wnt/β
‑
catenin通路及其下游基因表达。这证明了在乳腺癌中mir
‑
15a可通过抑制wnt/β
‑
catenin通路信号抑制肿瘤细胞。
68.实施例4mirna
‑
15a通过抑制kif3b表达调控β
‑
catenin
69.①
分别构建带有luciferase报告基因的kif3b
‑
u1
‑
wt和kif3b—u1
‑
mut稳定转染质粒，分别转染hek293t细胞并稳定筛选；
70.②
分别以阴性对照mir
‑
nc和mir
‑
15a mimic转染上述步骤中细胞，收集细胞测定luciferase assay，结果见图4b；
71.③
分别以阴性对照mir
‑
nc和mir
‑
15a mimic转染mda
‑
mb
‑
231细胞，48h后收集细胞并以western blotting检测kif3b蛋白表达水平，结果见图4a；
72.④
合成抑制kif3b的sirna，并按前述步骤对mda
‑
mb
‑
231乳腺癌细胞系瞬时转染，48h后收集细胞以western blotting检测蛋白水平，结果见图5
‑
6.
73.实验结果显示：kif3b基因是mir
‑
15a靶标，在三阴性乳腺癌细胞系mda
‑
mb
‑
231中mir
‑
15a可有效降低kif3b蛋白表达；下调kif3b可抑制wnt/β
‑
catenin信号通路，说明mir
‑
15a通过抑制kif3b蛋白水平下调wnt/β
‑
catenin通路信号，发挥对三阴性乳腺癌抑制作用。