一种载黄芩苷醇质体的可溶性透明质酸微针阵列及其制备方法和用途与流程

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种载黄芩苷醇质体的可溶性透明质酸微针阵列及其制备方法和用途。


背景技术：

2.银屑病是一种常见的具有特征性皮损的慢性易于复发的炎症性皮肤病，多为棕红色斑块，边界清楚，周围有炎性红晕，基底浸润明显，表面覆盖多层干燥的灰白色或银白色鳞屑。目前研究发现，银屑病患者除皮肤损害外,在遗传因子、生化、免疫、微循环、内分泌等方面也有异常。男女老幼均可患病,青壮年期发病者约占80％。从世界范围来说，白种人发病率较高，约占总人口的1％到3％，黄种人次之，发病率约为0.1％～0.3％。
3.目前对于治疗银屑病的药物和制剂已有诸多研究。黄芩苷是唇形科植物黄芩的主要有效成分之一，具有清热解毒、抑菌抗炎等诸多功效。已有研究发现黄芩苷能够通过抑制白三烯b4(ltb4)引起的中性粒细胞(pmn)趋化反应，阻断ltb4与pmn膜特异性受体结合，对银屑病起到治疗作用。此外，在诸多药物剂型中，外用制剂由于使用方便，安全性高等优点获得了越来越多的关注，但皮肤屏障的阻碍作用对药效的发挥影响较大。因此，如何以黄芩苷为活性成分制成药物制剂，在实际治疗过程中使得黄芩苷能够有效穿透皮肤屏障，靶向到达病灶部位并累积有效剂量，仍是其应用于临床治疗所亟需解决的问题。
4.为了穿透皮肤屏障，研究人员不断进行透皮给药制剂例如脂质体等的研究与改进，但传统的脂质体载药系统仍容易被皮肤最外层亲脂性角质层阻隔，透皮效果并不理想。在传统脂质体研究的基础上，醇质体作为一种新型的经皮给药制剂载体，与普通的脂质体相比，具有粒径小，结构稳定，有更好的柔性等优势，能形成渗透性和包封率更好的脂质囊泡，并具有良好的稳定性和皮肤耐受性。
5.除了对透皮给药制剂的改进外，还可使用微针直接刺穿皮肤角质层障碍，为药物提供传递的微孔道。微针阵列是指由一系列长为25～2000μm微米级的阵列形式的针状结构(即阵列形式排布的微针)，可以由金属、硅、高分子材料等制备而成，是生物医药领域的一种新型的微创给药方式。药物通过微针阵列造成的的多个微孔道，直接经毛细血管吸收进入血液，避免首过效应的同时避免了患者吞咽问题、药物经过胃肠道时药物利用率低的问题以及药物稳定性问题，改善了患者顺应性问题，是目前局部透皮给药的研究热点。
6.根据微针阵列给药方式的不同，大致可以分为：固体微针阵列、涂层微针阵列、空心微针阵列、可溶性微针(凝胶微针)阵列几类。其中，固体微针阵列通常由金属材料和非降解聚合物制备而成，给药方式包括先使用微针穿刺皮肤表面形成微孔道；然后将药物敷在微针穿刺部位，药物由孔道被动渗透进入皮肤两个步骤。
7.例如，程亮(sin
‑
hc1“微针阵列—传递醇质体”组合大通量经皮释药规律研究[d].西北大学,2013)就提出了一种以微针阵列
‑
醇质体相结合的新型透皮给药系统，利用金属的固体微针阵列先打破角质层的物理及脂性屏障，然后以龙胆苦苷、盐酸青藤碱为模型药
物制成传递醇质体，进行透皮效果验证，发现透皮效果提高。固体微针机械性能优异，利于打破角质层屏障；然而，金属的固体机械微针阵列不可溶，不可降解，给药过程中一旦出现断针或损坏，就会导致针体滞留在皮肤内，造成安全隐患，而且需要复杂精密的设备进行制造，制备工艺复杂。而该透皮给药的方案需要这种先用微针阵列处理皮肤，后再用醇质体递药，操作繁琐不便，难以广泛推广应用。
[0008]
涂层微针阵列与固体微针阵列类似，为了简化给药步骤，将药物包裹在微针针体表面，药物随着微针刺入皮肤进而溶解释放，但由于微针比表面积有限，严重限制了涂层微针阵列的载药量。空心微针阵列则相当于一种微米级别的注射器，刺入皮肤后将空心孔内的药液注射到皮下，然而，空心微针的空心结构导致制备工艺更为复杂，且由于真皮组织的致密性，空心微针阵列插入皮肤时，针体内腔易被堵塞，影响药物的传递。
[0009]
可溶性微针阵列主要由水溶性聚合物制备而成，药物分布于针尖基质，刺入皮肤后针尖吸收少量组织液溶解并释放药物，兼具制备方法简单、药物递送高效、确保药物稳定、安全性高等诸多优势。然而，水溶性聚合物制备的微针阵列往往机械性能较差，难以有效破坏皮肤屏障促进药物透皮。
[0010]
因此，提供一种成本低、生物安全性好、能够大量生产应用且机械性能好、透皮给药效果优异的可溶性载药微针阵列，具有非常重要的意义。


技术实现要素：

[0011]
本发明的目的在于提供一种具有优异透皮给药效果，治疗银屑病的可溶性载药微针阵列。
[0012]
本发明提供了一种可溶性微针阵列，它以透明质酸为基体，负载有黄芩苷醇质体，所述透明质酸与黄芩苷醇质体的质量比为(50～100):(1～5)；
[0013]
所述黄芩苷醇质体由如下原料制备而成：黄芩苷、载体材料、油相溶剂、水相溶剂、乳化剂、表面活性剂；
[0014]
所述载体材料为大豆卵磷脂、plga或peg
‑
plga的一种或多种；
[0015]
所述油相溶剂是乙醇、丙三醇、1,2
‑
丙二醇或聚乙烯醇中的一种或多种；
[0016]
所述水相溶剂是蒸馏水、pbs缓冲溶液、pva水溶液中的一种或多种；
[0017]
所述乳化剂为棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或丙烯酸异丙酯中的一种或多种；
[0018]
所述表面活性剂为吐温
‑
80、peg
‑
聚氧乙烯蓖麻油或聚乙二醇中的一种或多种。
[0019]
优选地，所述所述载体材料为大豆卵磷脂；所述油相溶剂是1,2
‑
丙二醇；所述水相溶剂是pbs缓冲溶液；所述乳化剂为肉豆蔻酸异丙酯；所述表面活性剂为吐温
‑
80。
[0020]
进一步地，上述透明质酸与黄芩苷醇质体的质量比为(80～100):(1～3)，优选为100:1。
[0021]
进一步地，上述黄芩苷、载体材料、油相溶剂、乳化剂、表面活性剂、水相溶剂的质量体积比例为：7:(40～60):(100～200):(100～200):(40～80):(2～10)mg/mg/μl/μl/μl/ml；优选为7:50:200:100:60:8mg/mg/μl/μl/μl/ml。
[0022]
进一步地，上述透明质酸分子量为5kda和40kda，其中分子量为5kda的透明质酸的质量百分比为30％～70％；所述黄芩苷醇质体的粒径为100～200nm。
[0023]
进一步地，上述微针阵列的微针为正四棱锥结构，四棱锥高度为600μm，底部宽度
为290μm，相邻两个微针尖端距离为800μm。
[0024]
本发明还提供了上述的可溶性微针阵列的制备方法，包括如下步骤：
[0025]
(1)黄芩苷醇质体的制备：将计量的载体材料、油相溶剂、乳化溶剂、表面活性剂混合均匀得到油相；将计量的黄芩苷溶于水相溶剂中得到水相，将水相加入油相，分散均匀，均质，即得黄芩苷醇质体；
[0026]
(2)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液的制备：将计量的透明质酸、步骤(1)得到的黄芩苷醇质体和蒸馏水混合均匀，得到黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液；
[0027]
(3)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸微针阵列的制备：将步骤(2)得到的所述黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液静置后，涂抹在pdms微针阵列模具的表面；所述pdms微针阵列模具任意一个四棱锥的高度为600μm，底部宽度为290μm；相邻的2个四棱锥的尖端距离为800μm；真空处理、常压干燥后剥离pdms微针阵列模具，即得到可溶性微针阵列。
[0028]
更进一步地，步骤(1)所述水相加入油相的速度为200μl
·
min
‑1～500μl
·
min
‑1；所述均质压力为1～200bar，均质时间为5～30min；优选地，所述均质压力为100～200bar，均质时间为15～30min；
[0029]
和/或步骤(3)所述黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液涂抹用量为100～1000μl；所述静置时间为2～12h，优选为8～12h；所述真空处理为在
‑
0.01～
‑
0.1mpa真空环境下放置2～5min，所述常压干燥温度为10～30℃，优选为20～30℃，干燥时间为10～15h。
[0030]
本发明还提供了上述的可溶性微针阵列在制备治疗银屑病的药物中的应用；优选地，所述治疗银屑病的药物为抑制胸腺萎缩，和/或脾脏肿大，和/或降低炎症因子表达的药物。
[0031]
本发明还提供了一种药物，它是由上述的可溶性微针阵列加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂；优选地，所述制剂为外用制剂；更优选地，所述外用制剂为贴剂。
[0032]
本发明的有益效果包括：
[0033]
可溶性微针阵列所用的材料透明质酸是一种生物相容性好、可溶解、易溶于水、廉价易得的高分子材料，有利于扩大该微针阵列的制备和应用。
[0034]
本发明制备工艺较为简单，在常温和负压的条件下，可以制备出不同浓度的结构规整、透明质酸分子量不同的微针阵列，整个过程耗时短，重复性强，便于推广大规模的生产。
[0035]
本发明提供可溶性微针阵列，不仅增加了微针阵列的机械强度，还使得该微针阵列具有治疗银屑病的应用。
[0036]
本发明提供的载黄芩苷醇质体的透明质酸可溶性微针阵列，在对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病的治疗后，治疗效果明显，适用于银屑病的治疗。
[0037]
本发明中的微针阵列的制备方法，是将黄芩苷醇质体的制备、黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液的制备、载黄芩苷醇质体
‑
透明质酸微针阵列的制备步骤三者相结合，最终得到载有黄芩苷醇质体
‑
透明质酸微针阵列。在黄芩苷醇质体的制备中，药脂比，pbs缓冲液的ph值，醇质体均质功率，均质时间等均会对黄芩苷醇质体的粒径、包封率等造成影响；而在载有黄芩苷醇质体的透明质酸水溶液中，透明质酸选用的分子量等也会对黄芩苷醇质体的透明质酸水溶液的制备成型和微针的机械强度发挥关键作用；在载有黄芩苷醇质体的透明质
酸微针阵列的制备步骤中，表面涂抹含有黄芩苷醇质体的水溶液的涂抹用量、真空环境中的真空度、干燥温度和干燥时间等都会对制备所得到的载有黄芩苷醇质体的透明质酸微针阵列的性质产生影响；微针中黄芩苷的负载量也会对透皮给药效果、治疗效果带来影响。本发明对上述多个方面进行处方工艺的改进与优化，最终得到了结构规整，具有高载药量且机械性能优异的黄芩苷醇质体透明质酸微针阵列，能够高效透皮给药，作为治疗银屑病的外用制剂具有非常好的应用前景。
[0038]
术语说明：
[0039]
plga：聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物；peg
‑
plga：聚乙二醇
‑
聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物；peg
‑
40
‑
聚氧乙烯蓖麻油：聚乙二醇
‑
40
‑
聚氧乙烯氢化蓖麻油，指聚乙二醇40和聚氧乙烯氢化蓖麻油的嵌段共聚物。
[0040]
综上，本发明改进了微针阵列的制备工艺，简化了现有的制备微针阵列的方法：在常温和负压的条件下，可以制备出不同浓度的结构规整、透明质酸分子量不同的微针阵列，整个过程耗时短，重复性强，便于推广大规模的生产。制备出相同规格的pdms模型，将透明质酸溶液浇注在模具上，选用真空干燥的方式，即可制得本发明载药的微针阵列。减少了如像金属微针、滚轮微针等微针复杂的制作方式，可根据模型的数量实现批量生产。本发明融合了纳米给药技术，相较于传统的微针给药，具有靶向性。利用具有优异机械强度的可溶性微针阵列先打破角质层的物理及脂性屏障，同时利用醇质体的亲水特性，使药物大通量地穿过活性表皮层，从而提高药物的透皮效果。
[0041]
本发明所述的“黄芩苷、载体材料、油相溶剂、乳化剂、表面活性剂、水相溶剂的质量体积比例为：7:(40～60):(100～200):(100～200):(40～80):(2～10)mg/mg/μl/μl/μl/ml”是指：每2～10ml的水相溶剂对应的黄芩苷用量为7mg，对应的载体材料用量为40～60mg，对应的油相溶剂用量为100～200μl，对应的乳化剂用量为100～200μl，对应的表面活性剂用量为40～80μl。该比例关系不仅限于“7mg黄芩苷、40～60mg载体材料、100～200μl油相溶剂、100～200μl乳化剂、40～80μl表面活性剂和2～10ml水相溶剂的组合”，还包括成倍扩大或缩小的原料用量的组合。例如“70mg黄芩苷、0.4～0.6g载体材料、1～2ml油相溶剂、1～2ml乳化剂、0.4～0.8ml表面活性剂和20～100ml水相溶剂的组合”、“0.7mg黄芩苷、4～6mg载体材料、10～20μl油相溶剂、10～20μl乳化剂、4～8μl表面活性剂和0.2～1ml水相溶剂的组合”、“0.7g黄芩苷、4～6g载体材料、10～20ml油相溶剂、10～20ml乳化剂、4～8ml表面活性剂和0.2～1l水相溶剂的组合”等，以此类推。
[0042]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0043]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0044]
图1为(a)黄芩苷醇质体的粒径分布图，(b)黄芩苷醇质体的透射电镜扫描图。
[0045]
图2为(a)制备得到的黄芩苷醇质体透明质酸微针阵列的光学显微镜图和可视的外观图；(b)制备得到的黄芩苷醇质体透明质酸微针阵列的扫描电镜图和制备得到的黄芩
苷醇质体透明质酸微针阵列单颗微针的扫描电镜图；(c)以罗丹明b代替黄芩苷醇质体制备的透明质酸微针阵列的倒置荧光显微镜图。
[0046]
图3为(a)测试罗丹明b代替黄芩苷醇质体制备的透明质酸微针阵列在小鼠离体皮肤中的穿刺强度效果图，(b)小鼠离体皮肤在倒置荧光显微镜明场观察下的显微图，(c)是小鼠离体皮肤在倒置荧光显微镜荧光环境观察下的显微图。
[0047]
图4为激光共聚焦显微镜观察下的罗丹明b代替黄芩苷醇质体制备的透明质酸微针阵列在小鼠离体皮肤的荧光观察，以红色荧光最强的地方作为起始面，收集x
‑
y面的荧光皮肤，可以看到皮肤下300μm处仍有荧光。
[0048]
图5为(a)透明质酸微针阵列的体外释放实验累积释放量和(b)体外膜透皮实验的累积透过量。
[0049]
图6是载有黄芩苷醇质体的透明质酸微针阵列对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠的治疗效果图，图6(a)是各组别小鼠的实验过程后背部皮肤变化图，证明该实验造模成功。微针阵列给药组的治疗优于黄芩苷原料药给药，黄芩苷醇质体给药。图6(b)是各组别小鼠的实验过程中的体重变化情况，证明咪喹莫特对小鼠的体重有抑制作用。图6(c)是小鼠的脾脏、胸腺所测得的脏器指数，结果证明黄芩苷微针阵列的治疗能够较模型组有显著性的差异。
[0050]
图7是通过酶联免疫吸附法测定的小鼠皮肤中炎症因子tnf
‑
α，il
‑
23,il
‑
2，il
‑
17a的表达。
具体实施方式
[0051]
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0052]
实施例1、本发明可溶性微针阵列的制备
[0053]
(1)黄芩苷醇质体的制备
[0054]
采用注入均质法，将大豆卵磷脂250mg、1,2
‑
丙二醇1.0ml、肉豆蔻酸异丙酯0.5ml混合置于ep管中，在45℃，100r
·
min
‑1的条件下称量黄芩苷原料药10mg溶于油相中磁力搅拌至全溶，加入300μl的吐温
‑
80后继续搅拌混匀。向油相中以500μl
·
min
‑1的速度注入水相8ml，水相为pbs缓冲液，ph为7.2，确保其能够均匀分散在油相中，全部加完后搅拌1个小时。将搅拌制备的溶液倒于高压均质机中，均质机的功率在压力160bar；均质时间25min。待均质为黄色透明状澄清的溶液，即得黄芩苷醇质体。
[0055]
(2)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液的制备：
[0056]
将透明质酸均匀分散到含有黄芩苷醇质体的1ml溶液中，得到含有黄芩苷醇质体的透明质酸水溶液，所述的含有黄芩苷醇质体的透明质酸水溶液中所述的黄芩苷醇质体浓度为1mg
·
ml
‑1，所述的透明质酸的浓度为100mg
·
ml
‑1，所述的透明质酸的平均分子质量为5kda和40kda，质量占比为5kda:40kda＝3:7。
[0057]
(3)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸微针阵列的制备：
[0058]
将所述步骤(2)得到的所述黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液静置12h，然后，取1000μl所述步骤(2)得到的所述黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液涂抹在pdms微针阵列模具的表面；接着将该pdms微针阵列模板至于26℃，
‑
0.08～
‑
0.1mpa真空度的真空环境中放置5分钟使透明质酸溶液充分进入微针阵列模具的空隙，然后进一步在26℃的真空干燥箱中常压固
化干燥12h，接着使用镊子将所述pdms微针阵列模具剥离，即得到载有黄芩苷醇质体的可溶性透明质酸微针阵列。
[0059]
实施例2、本发明可溶性微针阵列的制备
[0060]
(1)黄芩苷醇质体的制备
[0061]
黄芩苷原料药用量为20mg，水相用量为8ml，水相为pbs缓冲液，ph为7.2，其余步骤同实施例1。
[0062]
(2)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液的制备：
[0063]
将透明质酸均匀分散到含有黄芩苷醇质体的1ml溶液中，得到含有黄芩苷醇质体的透明质酸水溶液，所述的含有黄芩苷醇质体的透明质酸水溶液中所述的黄芩苷醇质体浓度为2mg
·
ml
‑1，所述的透明质酸的浓度为100mg
·
ml
‑1，所述的透明质酸的平均分子质量为5kda和40kda，占比为5kda:40kda＝3:7。
[0064]
(3)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸微针阵列的制备：
[0065]
步骤同实施例1。
[0066]
实施例3、本发明可溶性微针阵列的制备
[0067]
(1)黄芩苷醇质体的制备
[0068]
黄芩苷原料药用量为35mg，水相用量为8ml，水相为pbs缓冲液，ph为7.2，其余步骤同实施例1。
[0069]
(2)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液的制备：
[0070]
将透明质酸均匀分散到含有黄芩苷醇质体的溶液中，得到含有黄芩苷醇质体的透明质酸水溶液，所述的含有黄芩苷醇质体的透明质酸水溶液中所述的黄芩苷醇质体浓度为3.5mg
·
ml
‑1，所述的透明质酸的浓度为100mg
·
ml
‑1，所述的透明质酸的平均分子质量为5kda和40kda，占比为5kda:40kda＝3:7。
[0071]
(3)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸微针阵列的制备：
[0072]
步骤同实施例1。
[0073]
实施例4、本发明可溶性微针阵列的制备
[0074]
(1)黄芩苷醇质体的制备
[0075]
黄芩苷原料药用量为35mg，水相用量为8ml，水相为pbs缓冲液，ph为7.2，其余步骤同实施例1。
[0076]
(2)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液的制备：
[0077]
将透明质酸均匀分散到含有黄芩苷醇质体的溶液中，得到含有黄芩苷醇质体的透明质酸水溶液，所述的含有黄芩苷醇质体的透明质酸水溶液中所述的黄芩苷醇质体浓度为3.5mg
·
ml
‑1，所述的透明质酸的浓度为80mg
·
ml
‑1，所所述的透明质酸的平均分子质量为5kda和40kda，占比为5kda:40kda＝3:7。
[0078]
(3)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸微针阵列的制备：
[0079]
步骤同实施例1。
[0080]
实施例5、本发明可溶性微针阵列的制备
[0081]
(1)黄芩苷醇质体的制备
[0082]
黄芩苷原料药用量为35mg，水相用量为8ml，水相为pbs缓冲液，ph为7.2，其余步骤同实施例1。
[0083]
(2)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液的制备：
[0084]
将透明质酸均匀分散到含有黄芩苷醇质体的溶液中，得到含有黄芩苷醇质体的透明质酸水溶液，所述的含有黄芩苷醇质体的透明质酸水溶液中所述的黄芩苷醇质体浓度为3.5mg
·
ml
‑1，所述的透明质酸的浓度为90mg
·
ml
‑1，所所述的透明质酸的平均分子质量为5kda和40kda，占比为5kda:40kda＝3:7。
[0085]
(3)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸微针阵列的制备：
[0086]
步骤同实施例1。
[0087]
实施例6、本发明可溶性微针阵列的制备
[0088]
(1)黄芩苷醇质体的制备
[0089]
步骤同实施例1。
[0090]
(2)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液的制备：
[0091]
所述的透明质酸的平均分子质量为5kda和40kda，占比为5kda:40kda＝2:8。其余步骤同实施例3。
[0092]
(3)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸微针阵列的制备：
[0093]
步骤同实施例1。
[0094]
实施例7、本发明可溶性微针阵列的制备
[0095]
(1)黄芩苷醇质体的制备
[0096]
步骤同实施例1。
[0097]
(2)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液的制备：
[0098]
所述的透明质酸的平均分子质量为5kda和40kda，占比为5kda:40kda＝1:9。其余步骤同实施例3。
[0099]
(3)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸微针阵列的制备：
[0100]
步骤同实施例1。
[0101]
实施例8、本发明可溶性微针阵列的制备
[0102]
(1)黄芩苷醇质体的制备
[0103]
步骤同实施例1。
[0104]
(2)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液的制备：
[0105]
所述的透明质酸的平均分子质量为5kda和40kda，占比为5kda:40kda＝4:6。其余步骤同实施例3。
[0106]
(3)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸微针阵列的制备：
[0107]
步骤同实施例1。
[0108]
对比例1、不含黄芩苷醇质体的可溶性微针阵列的制备
[0109]
(1)黄芩苷醇质体的制备
[0110]
黄芩苷用量为0mg，其余步骤同实施例1。
[0111]
(2)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液的制备：
[0112]
黄芩苷醇质体的浓度为0mg/ml，其余步骤同实施例1。
[0113]
(3)黄芩苷醇质体
‑
透明质酸微针阵列的制备：
[0114]
步骤同实施例1。
[0115]
试验例1、黄芩苷醇质体的处方工艺优化
[0116]
参照实施例1的步骤(1)的制备方法，单因素调节原料用量比、水相ph、吐温
‑
80的加入量、均质功率，制备多种黄芩苷醇质体，对其粒径、包封率和载药量进行检测计算，得到结果如表1所示。
[0117]
表1
[0118][0119]
注：表中药脂比具体指药物黄芩苷和载体材料卵磷脂的质量比(mg/mg)。
[0120]
根据以上结果，以药脂比7:50，水相ph为7.2，药物：吐温
‑
80质量体积比7:60，药物：(油相溶剂 乳化剂)质量体积比7:300，均质压力功率160bar作为优选参数(即实施例3的方案)，制备三批黄芩苷醇质体并进行表征，结果如表2所示：
[0121]
表2
[0122][0123]
可见，在优化的制备参数下制得的黄芩苷醇质体具有高包封率和载药量，稳定性好。
[0124]
实验例2、微针阵列制备处方工艺优化
[0125]
参照实施例1的步骤(2)的制备方法，将透明质酸均匀分散到不含黄芩苷醇质体的溶剂中制备透明微针阵列，探讨溶剂的种类、用量、透明质酸的分子量对微针阵列性能的影响：
[0126]
1、溶剂筛选
[0127]
筛选将透明质酸分散到黄芩苷醇质体溶液中所加入的溶剂种类，结果如下：
[0128][0129]
可见，使用蒸馏水作为黄芩苷醇质体
‑
透明质酸的溶剂，进一步进行微针阵列成型的成型性最好，且基本无气泡，因此采用水作为溶剂，进一步验证水的用量对微针阵列性能的影响。在制备载黄芩苷醇质体透明质酸微针阵列的过程中，采用不含乙醇的水相溶液(例如pbs缓冲液、pva水溶液等)作为分散液。
[0130]
2、加水量
[0131][0132]
可见，加水量为1ml时，制得微针阵列的成型性好，含针量高，且机械强度优异。因此，在制备载黄芩苷醇质体透明质酸微针阵列的过程中，采用将透明质酸分散到1ml黄芩苷醇质体溶液中的制备步骤。
[0133]
3、透明质酸分子量
[0134][0135]
可见，透明质酸采用5kda/40kda分子量时，成型性和坚硬程度相较于其它分子量的透明质酸更为优异。
[0136]
4、透明质酸分子量比例的机械性能考察
[0137]
[0138][0139]
可见，5kda/40kda分子量的透明质酸在5kda：40kda比例为3:7～7：3的范围内制得的微针阵列成型性好且具有优异的机械性能。
[0140]
实验例3、微针阵列制备工艺的优化
[0141]
在得到制备微针阵列的溶液后，将其涂抹在微针阵列模具表面，对微针阵列的成型工艺：(1)为了使溶液充分进入微针阵列模具的空隙，进行抽真空的时间；以及(2)干燥固化的时间进行探究，结果如下：
[0142]
1、抽真空时间对成型性和含针量的影响：
[0143][0144]
可见，真空条件下放置5分钟内能够使溶液充分进入微针阵列模具的空隙，具有良好的成型性，优选地，真空时间5min时的成型性优异，微针数量最高。而真空时间太长，达到10分钟则会导致药液从模具中溢出，或者导致水分的蒸发，导致无法形成微针。因此，在微针阵列制备过程中采取5min的真空处理时间。
[0145]
2、干燥固化温度对微针阵列的影响：
[0146][0147]
上述结果说明，在较低温度下(30℃以下)干燥微针阵列的成型性较好，气泡较少，为优选的干燥固化条件。其中，在26℃下恒温干燥12h
±
1h，成型好，气泡少，为最优选的实验方案。
[0148]
实验例4、本发明黄芩苷醇质体和可溶性微针阵列的表征
[0149]
以马尔文粒度仪测定实施例3的黄芩苷醇质体的粒径和pdi，得到图1(a)；取制备的黄芩苷醇质体0.3ml，采用3k分子量的超滤离心管，进行高速冷冻离心(离心力16000r，4
℃，15min)后，吸取下层游离的药物。过滤，进样，计算峰面积。代入标准曲线从而得到包封率和载药量，计算方法如下：
[0150]
包封率ee(％)＝(包封进去药物/总的药物投药量)
×
100％；
[0151]
载药量dl(％)＝(包封进去药物/醇质体的总重量)
×
100％；
[0152]
色谱条件：色谱柱为swell c
‑
18(150mm x 4.6mm,5μm)；流动相a：40％甲醇水溶液；流动相b：60％磷酸水溶液；体积流量1ml/min；检测波长278nm；进样量10μl；柱温30℃。理论塔板数≥5000，分离度＞1.5。
[0153]
透射电镜扫描方法：取适量醇质体，用ph7.0的pbs稀释10倍后，取20μl滴加在铜网上，吸收5min后，加1％的磷钨酸适量染色1min，自然风干后，在透射电镜(tem)下观察其形状并进行拍照。得到图1(b)。
[0154]
对可溶性微针阵列的外观进行观察，并进行光学显微镜、扫描电镜观察。由于黄芩苷的本身荧光弱，因此本实验选用具有荧光的罗丹明b代替黄芩苷醇质体制备透明微针阵列，用荧光显微镜进行观察。可以在荧光环境中观察到微针的形状，大小，高度等。
[0155]
2、实验结果
[0156]
从图1(a)中可以看出实验所制备的黄芩苷醇质体的粒径在100nm左右，通过计算其包封率为79.09％，载药量为2.77％；从图1(b)中可以看到，所制备的黄芩苷醇质体为类球形，分散均匀；图2(a)制备的黄芩苷醇质体微针阵列的便携式显微镜图和图2(b)的扫描电镜图可以观察到，微针阵列的针型完好，以具有荧光的罗丹明b代替黄芩苷醇质体制备透明微针，图2(c)在倒置荧光显微镜下观察到，微针阵列的各个微针的针尖完好，分布均匀，微针呈正棱锥形，四棱锥的高度为600μm，底部宽度为290μm；相邻的2个四棱锥的尖端距离为800μm。说明如下结论：本实验所制备的黄芩苷醇质体的包封率、载药量高，粒径小，所制备的微针阵列的微针针尖完好，分布均匀。证明本实验所制备的黄芩苷醇质体透明质酸微针阵列的方法可行，且黄芩苷醇质体载药量和包封率均较高。
[0157]
实验例5、本发明透明质酸微针阵列对皮肤的穿刺效果验证
[0158]
1、实验方法
[0159]
取小鼠处死、脱毛后冷冻保存备用，实验之前取鼠皮解冻，生理盐水浸泡后，用医用手术刀分离成1.5cmx 1.5cm的正方形，去除脂肪层。将制备好的微针阵列(实施例3)贴片插入离体皮肤中5min后移除，用滤纸擦拭皮肤表面，以便携式显微镜、倒置荧光显微镜观察微针阵列在皮肤的状态。用罗丹明b代替实施例3的微针阵列中的黄芩苷醇质体，采用倒置荧光显微镜进行观察。
[0160]
2、实验结果(后续实验结果都是以实例3制备的微针进行实验)
[0161]
从图3可以看出微针阵列刺破皮肤后，留下明显的孔隙，空隙之间分布均匀(图3(a))，以倒置荧光显微镜观察微针阵列在明场状态和荧光状态下在皮肤内的分布，明场下微针阵列呈现粉红色(图3(b))，荧光条件下微针阵列发出淡蓝色的光泽(图3(c))。图4为激光共聚焦显微镜观察下的罗丹明b代替黄芩苷醇质体制备的透明质酸微针阵列在小鼠离体皮肤的荧光观察，以红色荧光最强的地方作为起始面，收集x
‑
y面的荧光皮肤，可以看到皮肤下300μm处仍有荧光。说明如下结论：本实验所制备的微针能够穿过皮肤角质层，穿透性能良好。
[0162]
实验例6、本发明微针阵列中黄芩苷醇质体的释放和透皮效果
[0163]
1、实验方法
[0164]
体外释放实验：模拟人体环境，以生理盐水为释放介质，对制得的微针阵列进行体外研究，将实施例3制备的黄芩苷醇质体
‑
透明质酸水溶液装入透析袋中在50ml的生理盐水中于37℃水浴，60r/min动态透析，在0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24h吸取1ml的同时补足同等温度的1ml生理盐水，测定透析介质中游离黄芩苷含量，从而计算黄芩苷脂质体纳米粒的累积释放率。
[0165]
cn＝(m1 m2
···
mn)/m
总
*100％
[0166]
其中cn为累积释放率，m总为理论上100％释放的释放量，mn为各时间点所得的释放量，mn＝c*v
[0167]
体外透皮实验：利用franz透皮扩散试验仪进行实验。将实施例3制备的醇质体
‑
微针阵列与醋酸纤维膜紧密贴合，再贴上之前准备好的背衬凝胶层，接受池中装满生理盐水作为接受介质，温度设为32℃，转速设为200r/min。分别于0，2，4，6，8，10，12h，24h，48h吸取500μl，同时补加等量等温新鲜生理盐水，0.22μm微孔滤膜滤过，进样，按下式计算累积透过量(qn)，测定48h内黄芩苷醇质体
‑
微针阵列累积渗透量。
[0168]
qn＝(cn
×
v)/a cn＝c1 c2
……
cj
[0169]
上式中，qn为单位面积累积渗透量(g/cm2)，cn为第n个时间点测定的药物浓度(g/ml)，v为取样体积(ml)，a为接受池面积(cm2)。本实验中，v＝15ml，a＝1.54cm2。
[0170]
2、实验结果
[0171]
如图5所示，透明质酸微针阵列的累积释放量为57.43％，累积膜透过量为77.93％，透明质酸微针阵列相较于原料药释放较缓，在12h后，释放速度变缓。分别对3种制剂在48h内的膜渗透的单位面积累积渗透量进行计算，可以看到48小时时前两个剂型释放趋于平缓，而微针组的药物仍在缓慢的透过醋酸纤维膜，起到了缓释的效果。
[0172]
实验例7、本发明可溶性微针阵列对银屑病的治疗效果
[0173]
1、实验方法
[0174]
以咪喹莫特诱导的银屑病小鼠的病理皮肤：
[0175]
通过随机分组的方法分为六组，每组六只。空白对照组、模型组、醇质体组、微针组、阳性药对照组、原料药对照组，适应性饲养一周。balb/c小鼠背部脱毛，面积约为1.5cm*1.5cm脱毛部位光滑无伤口。balb/c小鼠背部涂抹咪喹莫特，给药剂量为62.5mg/(cm2·
天)，图6a证明造模成功。
[0176]
在第三天开始每日下午给予实施例3的微针阵列治疗，将该微针阵列按压在有银屑病的小鼠的病理皮肤处5min，再给予一层背衬粘性凝胶层，以固定微针阵列于小鼠的背部，每次治疗持续4h，连续治疗5天，在第8天后，称重后处死小鼠，取下小鼠的背部皮肤，脾脏组织和胸腺组织，并对小鼠皮肤进行he染色。通过酶联免疫吸附法测定的小鼠皮肤中炎症因子tnf
‑
α，il
‑
23,il
‑
2，il
‑
17a的表达。
[0177]
2、实验结果
[0178]
如图6b所示，证明咪喹莫特对小鼠的体重有抑制作用，且会造成胸腺萎缩(胸腺作为免疫器官，其萎缩反映免疫功能下降)、脾脏肿大(说明有炎症产生)。
[0179]
如图6c所示，小鼠的脾脏、胸腺所测得的脏器指数变化证明黄芩苷醇质体微针阵列能有效的抑制咪喹莫特诱导所导致的脾脏肿大和胸腺萎缩，并证明黄芩苷微针阵列的治
疗组较模型组有显著性的差异，并且相比于黄芩苷原料药和黄芩苷醇质体的效果也有进一步提升。
[0180]
从图7可以看出本发明可溶性微针阵列抑制典型的银屑病炎症因子的效果显著，且相比于单独的黄芩苷醇质体表现出增强作用。
[0181]
以上结果说明，本发明黄芩苷醇质体微针阵列能有效的抑制咪喹莫特诱导所导致的脾脏肿大、胸腺萎缩，降低银屑病特征炎症因子的表达，具有应用于银屑病治疗的巨大潜力。
[0182]
综上，本发明提供了一种治疗银屑病的可溶性微针阵列，成本低、制备方法简单，适于工业化大量生产；本发明微针阵列的生物相容性好、安全性高、机械强度好，透皮给药效果优异，可用于银屑病的治疗，具有非常好的应用前景。