一种基于消除小分子电极的电化学装置的制作方法

1.本发明属于生物电化学领域，具体涉及一种基于脱氢酶
‑
小分子酶膜电极和消除小分子电极的电化学装置，该装置用于发酵液中目标物质的检测。


背景技术：

2.生物发酵产业是工业生物技术领域中的重要产业之一，在国民经济尤其是食品、饲料、医药、化工、能源等行业中具有相当重要的地位。生物发酵过程监控、产品品质分析、安全检疫及成分鉴别对发酵产品的质量至关重要。目前，以氧化还原酶为识别元件的电化学生物传感器已经广泛地应用在生物发酵行业，如葡萄糖氧化酶、乙醇氧化酶、乳酸氧化酶等传感器。基于氧化酶构建的电化学生物传感器主要以溶解氧或电子媒介体作为电子传递剂，具有操作简单方便、灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强、价格低廉等优势。然而自然界中脱氢酶占了氧化还原酶的80％，大部分发酵原料、中间代谢产物或最终产物缺乏与之对应的专一性氧化酶，如木糖、葡萄糖6磷酸、甲酸、苹果酸、富马酸、大部分氨基酸等。因此，为了检测这些只具有专一性脱氢酶的发酵产品，亟需发展以脱氢酶为识别元件的电化学生物传感器。
3.脱氢酶在识别目标底物时，以氧化态辅酶作为电子受体，将其催化转化成为还原态。换能器可获取氧化态辅酶电化学再生过程中的氧化电流，根据氧化电流与目标底物之间的响应关系，实现对目标底物的检测。然而，对于构建脱氢酶电极，尤其是构建用于发酵液成分检测的脱氢酶电极，主要存在两个问题：(1)脱氢酶识别目标底物时以小分子作为电子受体，在实际检测样品时需反复添加小分子，使实验操作繁琐复杂，为了解决这个问题，脱氢酶与小分子共固定化成为构建脱氢酶传感器的关键之一。(2)发酵液成分复杂，当脱氢酶电极用于发酵液成分检测时，脱氢酶能够准确识别目标物质，然尔发酵液中固有的小分子会使脱氢酶传感器检测值出现偏差，对发酵过程监控、产品品质分析造成严重干扰。因此，消除发酵样品中小分子的干扰是构建脱氢酶传感器，实现准确检测的另一关键。


技术实现要素：

4.针对现有用于发酵液成分检测的脱氢酶电化学生物传感器所存在的缺陷，本发明的目的是提供一种脱氢酶
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小分子酶膜电极和利用电化学方法消除小分子的电极相结合的新型电化学检测装置。采用该检测装置对发酵样品中的目标分子进行检测，可有效消除实际样品中小分子的干扰，提高了检测的准确性。
5.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.第一方面，本发明提供一种基于消除小分子电极的电化学装置，在所述装置的外壳内包括底板、过滤膜a、清洗液进液口a、消除小分子反应室、废液排放口a、中层隔板、过滤膜b、清洗液进液口b、酶促反应室、废液排放口b、顶板，其中，底板上设置兼具进液口a和抽气孔a作用的孔，所述孔与抽气口管路相连，抽气口管路上设置有阀门，当需要待测发酵液进入消除小分子工作室时，打开阀门，待进样完成，则关闭阀门；中层隔板将消除小分子反
应室和酶促反应室隔开，中层隔板分上、下层，上层设置兼具进液口b和抽气孔b的孔；顶板上设置抽气孔c和酶膜电极安装孔，抽气孔c外接抽气泵，通过抽压方式经抽气孔a和b，使电化学装置内部形成负压，使待测发酵液透过进液口a及过滤膜a进入消除小分子反应室中，中层隔板上层的抽气孔b为孔数大于1的多个小孔组成；消除小分子的电化学反应之后的反应液继续经抽气孔b通过抽压方式透过进样口b及过滤膜b进入酶促反应室；所述消除小分子反应室内依次包括设置在中层隔板下层的消除小分子电极、参比电极a、对电极a，所述参比电极a为银丝，所述对电极a为铂丝，消除小分子电极面积占中层隔板下层面积的1％
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90％，优选为70％，所述消除小分子电极选自镍、钛、不锈钢、碳等中的至少一种，电极形式为泡沫形式或者片层形式；所述酶促反应室内依次包括设置在顶板上作为工作电极的脱氢酶
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小分子酶膜电极、参比电极b、对电极b，所述参比电极b为银丝，所述对电极b为铂丝，所述脱氢酶
‑
小分子酶膜电极包括依次连接的基础电极、醋酸纤维素膜、固定化酶层、聚碳酸酯微孔膜和固定胶圈，此外，在消除小分子反应室一侧设有清洗液进液口a，另一侧设有废液排放口a；在酶促反应室一侧设有清洗液进液口b，另一侧设有废液排放口b，便于反应室的清洗，过滤膜a或b为微滤膜，消除小分子电极、脱氢酶
‑
小分子酶膜电极、参比电极a或b、对电极a或b分别通过导线连接电化学工作站，实现实时检测。
7.优选地，所述外壳为有机玻璃。
8.优选地，所述底板、中间隔板、顶板的形状选自圆形、椭圆形、多边形，在底板和顶板中央设置的抽气孔a或b的直径为1～5mm，优选为3mm。
9.优选地，所述消除小分子反应室选用有机玻璃，体积即反应体积为300～600μl，优选为450μl。
10.优选地，所述消除小分子电极选自镍、钛、不锈钢、碳等中的至少一种，电极形式为泡沫形式或者片层形式，厚度为0.1
‑
1mm之间，优选为0.5mm；所述消除小分子电极占中间隔板面积的70％。
11.优选地，所述消除小分子的电化学方法选自恒电位法或循环伏安法；优选为循环伏安法，扫描范围为
‑
10v到 10v之间，优选
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3v到 3v之间；扫描速率为1mv/s到100mv/s之间，优选为100mv/s。
12.优选地，所述脱氢酶
‑
小分子酶膜电极包括依次连接的基础电极、醋酸纤维素膜、固定化酶层、聚碳酸酯微孔膜和固定胶圈。
13.优选地，所述基础电极为检测小分子的电极。
14.进一步优选地，所述基础电极包括纳米电催化剂或生物催化剂中的一种。
15.优选地，所述纳米电催化剂选自铂、金、铂金合金、石墨烯、碳纳米管等中的至少一种。
16.优选地，所述生物催化剂选自黄递酶(di)和电子中介体如维生素k3(vk3)、二氯异丙醚(dcip)、苄基紫晶(bv)、甲基紫晶(mv)等中的至少一种。
17.进一步优选地，固定化酶层包含选自木糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、富马酸脱氢酶等中的至少一种与小分子构成的复合物、成膜剂、酶膜稳定剂及导电材料。
18.优选地，所述成膜剂选自nafion、壳聚糖等中至少一种。
19.优选地，所述酶膜稳定剂选自聚乙二醇辛基苯基醚(triton x
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100)、吐温(tween)、蔗糖(sucrose)、海藻糖(trehalose)、甘油(glycerol)、聚乙二醇(peg)、氯化钠
(nacl)、硫酸铵((nh4)2so4)中的至少一种。
20.优选地，所述导电材料选自石墨烯、纳米管、碳气凝胶、聚吡咯、聚噻吩、聚苯胺、二硫化钼、二硫化钨、mofs、mxenes等中的至少一种。
21.优选地，所述酶促反应室选用有机玻璃，体积为300～600μl，空腔腔体体积为450μl。
22.优选地，所述清洗液进液口a或b、废液排放口a或b直径均为1～5mm，优选为2mm。
23.优选地，所述微滤膜选自醋酸纤维素膜、醋酸
‑
硝酸纤维素混合膜、聚碳酸酯膜、聚酰胺膜中的至少一种。
24.第二方面，本发明提供上述电化学装置在检测发酵液中目标物质中的应用。
25.本发明技术方案的有益效果：
26.本发明提供一种用于发酵液成分检测的电化学检测装置，首先实际样品以发酵液为主，通过第一层过滤膜a进入消除小分子反应室，施加电化学方法，消除小分子，本领域公知，使用不同材料作为工作电极，nadh的氧化电位通常为0
‑
1.5v之间，在此电位之间，nadh可被氧化为生物活性nad ，继续被利用；nad 的氧化电位通常在
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1.5v
‑
0v之间，在此电位之间，nad 可被还原为生物活性nadh，继续被利用。本技术发明人观察到超过
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1.5v或者1.5v，nad 和nadh会失去生物活性，转变成二聚体等其他物质。因此，本发明使用循环伏安法(
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3v到 3v)或者交替施加恒电位(
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3v和 3v)的方法去除nad 和nadh。继续通过第二层过滤膜b，进入酶促反应室，接触脱氢酶
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小分子酶膜电极，实现对目标分子的检测。本发明的电化学检测装置可有效消除实际样品尤其是发酵样品中的小分子干扰，准确实现对发酵过程监控和产品品质分析。
附图说明
27.图1为基于消除小分子电极的电化学装置结构示意图。
28.其中，1.底板，2.过滤膜a，3.消除小分子反应室，4.清洗液进样口a，5.废液排放口a，6.参比电极a：银丝，7.对电极a：铂丝，8.中层隔板，9.过滤膜b，10.泡沫镍，11.酶促反应室，12.顶板，13.抽气口管路，14.阀门，15.清洗液进样口b，16.废液排放口b，17.参比电极b：银丝，18.对电极b：铂丝。
29.图2为基于消除小分子电极的电化学装置消除发酵液中活性nad

及nadh的效果图。
30.其中，样品1和2是大肠杆菌发酵液，样品3和4是酵母发酵液。
31.图3为基于消除小分子电极的电化学装置对木糖的响应图。
32.图4为基于消除小分子电极的电化学装置的检测范围图。
33.图5为基于消除小分子电极的电化学装置的稳定性图。
具体实施方式
34.下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
35.除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已
知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
36.除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
37.实施例1脱氢酶
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小分子酶膜电极的制备
38.本发明脱氢酶
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小分子酶膜电极包括依次连接的基础电极、醋酸纤维素膜、固定化酶层、聚碳酸酯微孔膜和固定胶圈。其中，基础电极为铂电极。固定化酶层包括苹果酸脱氢酶
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nad

复合物10μl、成膜剂nafion 2μl、酶膜稳定剂聚乙二醇辛基苯基醚10μl及导电材料碳纳米管10μl。苹果酸脱氢酶
‑
nad

复合物酶膜电极制备方法参照cn 110938667 a中说明书具体实施方式1
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3。
39.实施例2基于消除小分子电极的电化学装置构造及作用原理
40.整个电化学装置为有机玻璃材料。如图1所示：电化学装置的底板1中抽气口管路13与发酵罐装置相连接，当测试发酵液时，管路13上的阀门14处于打开状态，顶板12抽气孔c通过管路连接抽气泵，利用抽压方式使发酵液通过底板1上的进样口a和过滤膜a2进入消除小分子反应室3中，关闭阀门14。在消除小分子反应室3中，消除小分子电极泡沫镍10作为工作电极，厚度为0.5mm。消除小分子室3中消除小分子电极泡沫镍10、铂丝电极对电极a7和银电极参比电极a6设置在中层隔板8的下层，消除小分子电极泡沫镍10面积占据中层隔板8的下层面积的70％，空腔腔体体积即反应体积为450μl。消除小分子的电化学方法为循环伏安法，扫描范围
‑
3v到 3v之间；扫描速率为100mv/s，反应之后的反应液继续通过顶板12的抽气口c利用抽压方式透过中层隔板8的进液口b和过滤膜b9进入酶促反应室11。在酶促反应室11中，顶板嵌入脱氢酶
‑
小分子辅酶酶膜电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极b18，银电极作为参比电极b17；酶促反应室11体积为450μl。此外，在消除小分子反应室3及酶促反应室11一侧分别设有清洗液进液口a4及清洗液进液口b15，直径为2mm，另一侧分别设有废液排放口a5及废液排放口b16，直径为2mm，便于反应室的清洗。所述底板1、中间隔板8、顶板12的形状选自圆形，过滤膜a2和b9为醋酸纤维素膜。消除小分子电极泡沫镍10、脱氢酶
‑
小分子酶膜电极、参比电极a6或b17、对电极a7或b18分别通过导线连接电化学工作站，实现实时检测。
41.本实施例中生物活性nad

检测方法：在含有100mu甲酸脱氢酶(tsfdh)，10mm甲酸和不同浓度的nad

的500μl0.05mm pbs(ph 7.0)中检测到生物活性nad

，并在340nm处的吸光度下记录吸光度。
42.生物活性nadh检测方法：在含有152mu di(心肌酶，diaphorase)，50mm dcip(2,6
‑
二氯靛酚钠盐，2,6
‑
dichlorophenolindophenolsodium salt)和不同浓度的nadh的500μl0.05 mm pbs(ph 7.0)中分析生物活性nadh，并在515nm的吸光度下记录吸光度。
43.当上述电化学检测装置中的消除小分子电极为消除nad

和nadh，脱氢酶
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小分子辅酶酶膜电极上固定了苹果酸脱氢酶
‑
nad

复合物时，利用该装置消除4种发酵液样品中生物活性nad

与nadh，其中样品1和2是大肠杆菌发酵液，样品3和4是酵母发酵液。进入电化学检测装置20min之后，nad 与nadh基本消除干净(图2)。图2中的纵坐标百分比是检测到的nad 或者nadh与起始nad 或者nadh的比值。
44.实施例3含有木糖脱氢酶传感器的基于消除小分子电极的电化学检测装置
45.按照实施例2的结构，所述用于发酵液成分检测的含有木糖脱氢酶传感器的电化学检测装置包括消除小分子反应室和酶促反应室，其中，消除小分子反应室内包括过滤膜a；消除小分子电极，并且银作为参比电极，铂作为对电极；酶促反应室内包括过滤膜b，木糖脱氢酶
‑
nad 酶膜电极，并且银作为参比电极，铂作为对电极。
46.用于发酵液成分检测的含有木糖脱氢酶传感器的电化学检测装置为有机玻璃外壳。所述木糖脱氢酶
‑
nad

酶膜电极包括依次连接的基础电极、醋酸纤维素膜、固定化酶层、聚碳酸酯微孔膜和固定胶圈。所述基础电极包括黄素酶和电子中介体vk3。所述固定化酶层包括木糖脱氢酶
‑
nad

复合物、成膜剂、酶膜稳定剂及导电材料。所述成膜剂为壳聚糖，所述酶膜稳定剂为吐温(tween)，所述导电材料为mxenes。
47.酶促反应室及消除小分子反应室选用有机玻璃；所述反应室为圆柱形空腔，所述空腔腔体体积为350μl。圆柱形空腔中央设置有气孔，气孔直径为3mm，所述圆柱形空腔一侧设有进液管，直径为为2.5mm。所述圆柱形空腔另一侧设有排液管，直径为2.5mm。
48.所述过滤膜为聚碳酸酯膜。所述消除小分子电极为镍片电极，电极面积占剖面a3整个面积的50％。
49.消除小分子的电化学方法为恒电位法，电位为为
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3v和 3v；时间优先为0
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60min，更优选为5min。即交替施加恒电位，优先
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3v施加5min， 3v施加5min，施加0
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10个循环或 3v施加5min，
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3v施加5min，施加0
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10个循环。更有选
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3v施加5min， 3v施加5min，施加2个循环。
50.利用本发明的装置首先对木糖进行差分脉冲伏安法(dpv)测试(图3)。当样品中加入木糖之后，电流响应明显增强，说明本装置可用于木糖检测。
51.利用本发明的装置对木糖进行了检测范围测试。本发明的装置检测范围为0.5
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10g/l(图4)。检测限为0.01g/l。并且本发明的装置保持稳定性的时间为35天(图5)。
52.利用本发明的装置对实际含有木糖的发酵液进行检测，并且与高效液相色谱法(hplc)进行比较，如表1所示。两种方法所检测的结果基本一致，这表明本发明的装置能够精确检测发酵液中的木糖。
53.表1.本新型脱木糖氢酶传感器及hplc对发酵液中木糖的检测
[0054][0055]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。