一种乌梅的检测和质量控制方法与流程

1.本发明涉及中药检测领域，具体涉及一种乌梅的检测和质量控制方法。


背景技术：

2.乌梅为蔷薇科植物梅prunus mume(sieb.)sieb.et zucc.的干燥近成熟果实，是由青梅经熏制或烘制的方法加工制成的。乌梅性平，味酸涩，归肝、脾、肺、大肠经，具有敛肺涩肠、生津止渴、驱虫止痢的功效，用于治疗肺虚久咳，久痢滑肠，清热消渴，蛔厥，呕吐腹痛，口干烦渴，胆道蛔虫症。其中具有的有机酸具有显著的药理活性，能够抑菌、抗氧化、抗生育、抑制结石形成和抑制黑色素，与其传统功效相关。因此，对于乌梅中的有机酸类成分进行控制尤为必要。《中国药典》(2015年版)乌梅项下，均以枸橼酸作为含量测定控制指标，乌梅发挥药效作用是其多种物质共同作用的结果，仅对枸橼酸进行控制过于片面，难以保证其临床疗效，因此需要对其进行整体性的控制。
3.中药传统用药采用煎煮汤剂的形式，而中药配方颗粒是以传统中药饮片为原料，经过提取、浓缩、干燥、制粒等生产工艺，加工制成的一种统一规格、剂量、质量标准的新型配方用药。在中医理论指导下使用，中药配方颗粒与传统中药汤剂相比，具有服用方便、易贮藏、便携带、质量可控等特点。而对于乌梅而言，乌梅发挥疗效的基础是标准汤剂中的有机酸，因此，对标准汤剂中的有机酸的种类及量进行控制，更符合临床的要求，保证用药的有效性。
4.但乌梅标准汤剂中的有机酸极性较大，保留时间短，具有分离效果不好的风险，传统的分析方法中多选用缓冲盐作为流动相，虽然能够达到较好的分离效果，但对仪器损害较大，且随着目前人们对医疗需求的日益提高及中医药的普及程度提高，中药的使用量逐步增大，对于中药及中药配方颗粒检验量也逐步增大。因此，对于仪器损害造成的成本增加是企业的一个重要的负担，对于乌梅的检测而言，需要一个快速、准确且能够整体评价乌梅及乌梅配方颗粒的对仪器损害小的质量控制方法，但目前尚未见相关报道。


技术实现要素：

5.因此，本发明要解决的技术问题在于：现有的分析方法中在保证分离效果时，通常采用缓冲盐作为的流动相，导致对仪器的损害较大的问题；提供一种对仪器损害小，且能准确且完整检测和评价乌梅的检测方法。
6.一种乌梅的检测方法，采用液相色谱进行检测，检测时的色谱条件为：
7.采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以甲醇为流动相a，以质量浓度为0.1％-0.2％的磷酸为流动相b，按以下梯度洗脱程序进行洗脱：
8.9.所述梯度洗脱程序还包括：
[0010][0011][0012]
其中a为23-25min。
[0013]
供试品溶液：取供试品，加入溶剂经过预处理后制备得到供试品溶液。
[0014]
所述供试品为乌梅配方颗粒时，供试品溶液的处理过程为：取乌梅配方颗粒，精密称定，加入溶剂混合均匀后，称定重量，超声处理，冷却后再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤后获得滤液，滤液即为供试品溶液；其中，乌梅配方颗粒的浓度为2-8mg/ml。
[0015]
所述供试品为乌梅饮片时，供试品溶液的处理过程为：取乌梅饮片，精密称定，加入溶剂混合均匀后，预处理，冷却后再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤后获得滤液，滤液即为供试品溶液；其中，乌梅饮片的浓度为10-40mg/ml。
[0016]
所述预处理方式为超声、回流或振摇，超声处理的条件为：功率200w-500w，频率40khz-100khz，预处理的处理时间为20min-40min。
[0017]
所述液相色谱为uplc，所述色谱条件中进样量为1μl-5μl，色谱柱柱温为25℃-35℃，检测波长为210nm-230nm，理论塔板数按枸橼酸所对应的峰计算均不低于3000。
[0018]
所述梯度洗脱程序为：
[0019][0020]
所述供试品溶液中采用的溶剂为水。
[0021]
一种乌梅的质量控制方法，采用上述的乌梅的检测方法进行检测获得特征图谱，
[0022]
获得的特征图谱中包括6个特征峰，以枸橼酸对应的峰作为参照峰s,其余各特征峰与参照峰s的相对保留时间控制在规定值的
±
10％之内；各个特征峰的相对保留时间的规定值依次为0.52(峰1)、1.00(峰2s)、2.00(峰3)、2.99(峰4)、4.05(峰5)、4.20(峰6)。
[0023]
本发明的质量控制方法中，还包括对供试品中枸橼酸含量进行测定；当供试品为乌梅饮片时，乌梅饮片中枸橼酸含量范围为15.3％～19.9％；当供试品为乌梅配方颗粒时，供试品中枸橼酸含量范围为20％～40％。
[0024]
本发明技术方案，具有如下优点：
[0025]
1.本发明提供了一种采用液相色谱对乌梅的成分进行检测的方法，该检测方法的色谱条件中，将对比文件及药典中的流动相以甲醇-磷酸代替缓冲盐溶液，不仅降低了对仪器的损害，还使图谱呈现的成分极性更多元化；同时，采用变流速梯度的方式，使有机酸类
指标成分延长了保留时间，得到较好的分离效果，因此，本发明中的检测方法在获得较为完整的指纹图谱进而满足整体检测的同时，也能实现重点指标成分的定量分析，为质量控制提供了有效前提，大大节约了检测时间与检测成本。
[0026]
2.本发明提供了一种乌梅的质量控制方法，主要是乌梅中有效成分的整体质量控制方法，具体为从饮片到配方颗粒过程中整体的质量控制，在该整体质量控制中，采用6个特征峰进行控制；由于乌梅发挥疗效的基础是标准汤剂中有机酸，通过对特征峰结构推断，6个特征峰中，峰1为苹果酸，峰2为枸橼酸，峰4或5为绿原酸/奎宁酸；因此，通过本发明中上述6个特征峰的控制，能很好的保证乌梅饮片和乌梅配方颗粒的有效成分与乌梅标准汤剂的物质组成一致，更符合临床的要求，保证用药的有效性；
[0027]
3.本发明进一步提供了有效成分含量的质量控制，具体为乌梅中枸橼酸含量的控制，当乌梅饮片中枸橼酸含量范围为15.3％～19.9％，乌梅配方颗粒中枸橼酸含量范围为20％～40％时，则可认定为合格产品；
[0028]
4.本发明的乌梅的质量控制方法，还可以实现对物质传递过程的质量控制，即，可以对乌梅饮片至乌梅配方颗粒过程中的中间物的质量进行控制，保证从饮片到配方颗粒过程中的质量一致，更好地保证制备出合格的乌梅配方颗粒；
[0029]
5.本发明的检测方法和质量控制方法中均采用uplc进行检测，检测更高效、灵敏、准确。
附图说明
[0030]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0031]
图1是本发明中乌梅的标准特征图谱。
[0032]
图2是本发明中乌梅饮片的特征图谱。图中s1-s18分别为18批次乌梅饮片的特征图谱，r为18批乌梅饮片经相似度软件生成的对照图谱。
[0033]
图3是本发明中其中同一批次乌梅饮片和其制备得到的乌梅标准汤剂冻干粉的特征图谱。
[0034]
图4是本发明中三批次乌梅饮片制备得到的乌梅配方颗粒的标准特征图谱。
[0035]
图5是本发明中枸橼酸的线形图。
[0036]
图6是本发明中同一批次乌梅饮片制备乌梅配方颗粒过程中各个中间物的特征图谱。
[0037]
图7是对比例1中等速洗脱程序的特征图谱。
[0038]
图8是实施例5中不同的变速洗脱程序的特征图谱。
[0039]
图9是实施例6中不同的色谱条件下的特征图谱。
具体实施方式
[0040]
实施例1
[0041]
一种乌梅的检测方法，包括乌梅饮片、乌梅标准汤剂冻干粉以及乌梅配方颗粒的
检测。
[0042]
其中，乌梅标准汤剂冻干粉的制备工艺如下：采用不同批次的乌梅饮片制备获得乌梅标准汤剂冻干粉。具体包括：
[0043]
取乌梅饮片，置于砂锅中，一煎加入饮片量6倍水，浸泡30分钟，500w武火煮沸后，200w文火煎煮30分钟，趁热过滤，迅速冷却，备用；二煎加饮片量4倍水，500w武火煮沸后，200w文火煎煮20分钟，趁热过滤，迅速冷却备用；合并滤液得到生产提取液，50℃浓缩，浓缩至料液比约为1:1(即，50℃相对密度为1.05-1.10)，冷冻干燥，即得。
[0044]
乌梅配方颗粒的制备工艺如下：
[0045]
取乌梅饮片2600g，加水煎煮，滤过，滤液浓缩成清膏(干浸膏出膏率为19％-29％)，加辅料适量，干燥(或干燥，粉碎)，再加辅料适量，混匀，制粒，制成1000g，即得。
[0046]
本实施例中采用超高效液相色谱法对乌梅饮片、不同批号的乌梅饮片制备得到乌梅标准汤剂冻干粉、乌梅配方颗粒进行检测。其中，超高效液相色谱法的色谱条件具体如下：
[0047]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱的柱长为10cm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm；以甲醇为流动相a，以0.2％磷酸为流动相b，按下表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm；柱温30℃；理论板数按枸橼酸峰计算应均不低于3000。
[0048]
表1
[0049][0050]
对照品参照物溶液的制备：取枸橼酸对照品适量，精密称定，加质量浓度为10％的甲醇溶液制成每1ml含4.0mg的对照品参照物溶液。
[0051]
对照药材参照物溶液的制备：取中国食品药品检定研究院购买的乌梅对照药材(批号：121208-201305)约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加水25ml，密塞，超声处理30分钟，放冷，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液，其中超声条件为：功率250w，频率40khz。
[0052]
饮片供试品溶液的制备：取供试品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加水25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，其中超声条件为：功率250w，频率40khz。
[0053]
冻干粉及配方颗粒供试品溶液的制备：取供试品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置锥形瓶中，精密加水25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，其中超声条件为：功率250w，频率40khz。
[0054]
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液2μl，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。
[0055]
本实施例中采用18批次的乌梅饮片参照饮片供试品溶液的制备方法制备得到不
同批次的乌梅饮片供试品溶液，采用乌梅饮片供试品溶液进行超高效液相色谱分析，获得18批次的乌梅饮片的特征图谱，如图2所示。采用批号为180606-355000-01的乌梅饮片和与其对应的乌梅标准汤剂冻干粉做乌梅饮片-乌梅标准汤剂特征图谱传递情况图，如图3所示。采用其中三种批号(180606-355000-01、180606-672600-07、180627-611300-13)的乌梅饮片制备获得乌梅配方颗粒，对乌梅配方颗粒进行检测，检测结果如图4所示。
[0056]
本发明还对18批次的乌梅饮片进行枸橼酸的含量测定，采用乌梅饮片溶液进行超高效液相色谱分析，测定出的结果如表2和表3所示。表2为18批次的乌梅饮片中枸橼酸含量测定结果，表3为其中几个批次的乌梅饮片采用本方法测定和药典方法测定得到的枸橼酸含量测定结果。
[0057]
表2
[0058][0059][0060]
表3
[0061][0062]
通过上述表2-表3以及图2-图4所示，本方法采用uplc通过变流速梯度的方式，使有机酸类指标成分延长了保留时间，得到较好的分离效果。即，本发明的检测方法能够很好的实现乌梅中有机酸的分离，具有较好的分离效果，在保证整体控制的基础上同时满足重点指标的定量控制；并且，通过表3所示，药典方法与本方法检测结果的rsd值均小于1.9％，因此，代表性成分枸橼酸的检测结果与药典方法基本一致，证明：本发明的检测方法在达到减少对检测仪器的损伤的情况下，能达到分离优异、检测结果准确且快速等优点。
[0063]
实施例2
[0064]
本实施例对实施例1中的特征图谱检测方法的重复性、中间精密度、稳定性进行验证，验证过程和结果如下：
[0065]
1、重复性
[0066]
取6份供试品溶液，获得其特征图谱，以2号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算rsd。结果各特征峰的相对保留时间rsd在0.0％～0.2％范围内，相对峰面积的rsd在0.3％～1.1％范围内，表明该特征图谱的重复性较好。
[0067]
2、中间精密度
[0068]
采用waters uplc h-class，tuv检测器，取供试品溶液，获得其特征图谱，以2号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间，并计算rsd。结果采用waters uplc h-class，tuv检测器获得的特征图谱中，各特征峰的相对保留时间rsd在0.2％～0.4％范围内，相对峰面积的rsd在1.1％～2.0％范围内。不同仪器间相对保留时间rsd范围是1.2％～3.8％，相对峰面积rsd％范围是0.2％～1.9％，表明该特征图谱的在不同仪器间相对保留时间、相对峰面积符合分析要求。
[0069]
3、稳定性
[0070]
取供试品溶液，分别于0、2、4、8、10、12、24h按上述方法测定，获得其特征图谱，以2号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算rsd。结果各特征峰的相对保留时间rsd在0.3％～0.4％范围内，相对峰面积的rsd在2.0％～3.4％范围内，表明溶液中化学成分在24小时稳定性较好。
[0071]
实施例3
[0072]
本实施例对实施例1中的枸橼酸含量测定检测方法的准确度、精密度、线性进行验证，验证过程和结果如下：
[0073]
1、准确度
[0074]
精密称取枸橼酸对照品571.123mg，置100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。取重复性项下已知含量的样品，研细，取约0.1g，精密称定，共九份，将样品分为3组，分别按对品含量比例为1:0.5、1:1、1:1.5，向样品中分别精密加入(枸橼酸(571.23μg/ml)对照品溶
液10ml、15ml，至中、高浓度组样品中，加水适量，使其总量为25ml；另取枸橼酸对照品112.968mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，分别精密量取25ml置低浓度组样品中。上述三组样品按正文方法进行含量测定，并计算枸橼酸的含量，利用以下公式计算回收率。
[0075][0076]
结果所测得的回收率范围为95.55％～101.64％，平均回收率为97.9％，rsd值为2.3％，符合方法学验证回收率要求，表明利用该方法测得的结果准确。
[0077]
2、精密度
[0078]
2.1重复性：取6份供试品溶液，按上文方法测定，并计算枸橼酸含量。所测得的枸橼酸平均含量为57.1％，其rsd为0.4％，符合方法学验证重复性要求。
[0079]
2.2中间精密度：不同分析人员不同时间不同仪器waters uplc h-class液相色谱仪(tuv检测器)进行中间精密度试验。取6份供试品溶液，按上文方法测定，并计算枸橼酸含量。结果中间精密度试验所测得的枸橼酸平均含量为54.9％，rsd值为0.5％，与重复性试验的检测结果的rsd为2.8％，符合方法学验证精密度要求。
[0080]
3、线性
[0081]
标准曲线的制备：取枸橼酸对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml含枸橼酸20.1688mg对照品溶液；吸取对照品溶液5ml置于10ml容量瓶中，加10％甲醇至刻度，作为线性4；吸取线性4溶液5ml置于10ml容量瓶中，加10％甲醇至刻度，作为线性3；吸取线性3溶液5ml置于10ml容量瓶中，加10％甲醇至刻度，作为线性2；吸取线性2溶液5ml置于10ml容量瓶中，加10％甲醇至刻度，作为线性1。精密吸取上述续滤液1μl，注入超高效液相色谱仪，按正文方法测定枸橼酸色谱峰峰面积，以枸橼酸色谱峰的峰面积为纵坐标，枸橼酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线，求得枸橼酸回归方程为y＝1e 06x-71009，r＝1.0000，其线性范围为1.26055-20.1688mg/ml，结果见表4和图5所示。
[0082]
表4
[0083][0084]
通过表4和图5可知，本发明的方法绘制出的标准曲线线性佳。
[0085]
4、稳定性
[0086]
取一份供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h按上文方法进行测定，记录枸橼酸峰面积的变化情况。结果样品在24小时内枸橼酸的峰面积rsd值为0.3％，符合分析要求。
[0087]
实施例4
[0088]
一种乌梅的质量控制方法，包括建立特征图谱，采用实施例1中的18批中药饮片按照乌梅饮片的供试品溶液的制备方法制备得到不同批次的乌梅饮片溶液，得到乌梅饮片溶液的液相图谱，根据图3同批次乌梅饮片-乌梅标准汤剂冻干粉特征图谱传递情况和图4不同批次乌梅配方颗粒的特征图谱检测结果可知，乌梅饮片-乌梅标准汤剂-乌梅配方颗粒过
程中，6个特征峰具有良好的传递效果，故确定采用其中6个共有峰作为特征峰。
[0089]
本实施例对各个特征峰进行结构推断，确定了6个特征峰的分子式，峰1为c4h6o5，峰2为c6h8o7，峰3为c6h6o3，峰4为c
16
h
18
o9，峰5为c
16
h
18
o9，峰6为c
16
h
24
n3o9/c18h
26
o
10
。并参考乌梅化学成分相关文献，推断了5个特征峰：峰1推断为苹果酸，峰2推断为枸橼酸，峰3推断为5-羟甲基糠醛，峰4或5推断为绿原酸/奎宁酸。
[0090]
采用18批次的乌梅饮片对应制备得到的乌梅标准汤剂冻干粉进行特征峰相对保留时间的测定，检测得到的18个批次的乌梅标准汤剂冻干粉中对应的各个特征峰的相对保留时间，如表5所示，采用相对保留时间的平均值作为特征图谱中特征峰的相对保留时间的规定值，具体测定值为：0.52(峰1)、1.00(峰2s)、2.00(峰3)、2.99(峰4)、4.05(峰5)、4.20(峰6)。
[0091]
由上可以确定，乌梅标准汤剂冻干粉特征图谱标准为：供试品特征图谱中应有6个特征峰，并应与实施例1中对照药材参照物的色谱峰中的6个特征峰相对应，以2号枸橼酸对应的峰为s峰，计算特征峰1～6的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％之内。
[0092]
本实施例还对乌梅标准汤剂冻干粉的特征图谱中对应的特征峰的峰面积进行统计，结果如表6所示。其中三批次的乌梅饮片制备得到的乌梅配方颗粒作为供试品时获得的各个特征峰的相对保留时间如表7所示。
[0093]
表5
[0094][0095][0096]
表6
[0097][0098]
表7
[0099][0100]
根据上述表6所示的结果可知，相对峰面积差异较大，因此不做规定，通过表7可知：3批配方颗粒检测结果符合标准汤剂标准范围，表明化学物质基础具有一致性，即符合
质量控制要求。
[0101]
同时，本发明还对不同批次乌梅标准汤剂冻干粉及乌梅配方颗粒进行枸橼酸含量测定，并根据乌梅配方颗粒的制成量规定，将乌梅标准汤剂冻干粉中枸橼酸含量折合成乌梅配方颗粒中枸橼酸含量，其中，乌梅配方颗粒的制成量为：根据研究的处方投料量和制成颗粒量，进行折算得到的相应含量值，结果如下表8所示：
[0102]
表8
[0103][0104][0105]
根据以上测定结果可知，乌梅标准汤剂中枸橼酸含量范围为53.1％～65.4％，按照制成量对其含量进行折算，其含量范围为21.4％～27.6％，乌梅配方颗粒枸橼酸含量限度公示标准为20％～40.0％，三批乌梅配方颗粒枸橼酸含量分别为22.0％、20.9％、25.0％，在标准含量范围内，表明乌梅配方颗粒与标准汤剂具有较好的一致性，符合要求。
[0106]
本实施例还对制备乌梅配方颗粒时，相同批次的乌梅饮片在不同工艺阶段的物质进行检测，具体工艺过程如下：
[0107]
取乌梅饮片2600g，加水煎煮，滤过，滤液浓缩成清膏(干浸膏出膏率为19％-29％)，加辅料适量，干燥(或干燥，粉碎)，再加辅料适量，混匀，制粒，制成1000g，即得。
[0108]
检测结果如图6所示，图6中s1为乌梅标准汤剂冻干粉；s2为乌梅生产提取液；s3为乌梅生产浓缩液；s4为乌梅生产喷雾粉；s5为乌梅配方颗粒。
[0109]
通过工艺研究各环节样品的液相图谱分析，通过6个共有峰的变化情况即可有效
对乌梅饮片至乌梅配方颗粒过程中的中间物的质量进行控制，保证从饮片到配方颗粒过程中的质量一致，更好地保证制备出合格的乌梅配方颗粒。本实施例中，6个共有峰稳定，未发生明显变化，因此确定本发明采用的工艺条件符合要求。
[0110]
实施例5
[0111]
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中采用不同的变速洗脱程序，其他与实施例1相同，具体变速洗脱程序如下：
[0112][0113]
检测样品为批号为180606-355015-05的乌梅饮片对应制备得到的乌梅标准汤剂冻干粉，通过上述不同洗脱程序得到的检测图谱如图8所示。
[0114]
实施例6
[0115]
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中采用不同的色谱条件，具体设置如下：
[0116]
以质量浓度为0.1％的磷酸为流动相b，预处理方式为回流，回流处理时间为30min；进样量为1μl，色谱柱柱温为25℃，检测波长为230nm。
[0117]
检测样品为批号为180606-355015-05的乌梅饮片对应制备得到的乌梅标准汤剂冻干粉，通过上述不同色谱条件得到的检测图谱如图9所示。
[0118]
对比例1
[0119]
本发明还提供了不同超高效液相色谱的色谱条件作为对照实施例，本对照例中采用等速洗脱程序，其他条件与实施例1相同，具体等速洗脱程序如下表9所示，流速为0.1ml/min。
[0120]
表9
[0121][0122]
通过上述不同洗脱程序得到的检测图谱如图7所示。由图7可知，相较于等速洗脱程序和不同的变速洗脱程序，本发明的分离度更高，不仅解决了仪器损害造成的成本增加问题，还使图谱呈现的成分极性更多元化，得到较好的分离效果。
[0123]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。