一种颈动脉粥样硬化家兔模型造模及检测方法与流程

1.本发明涉及中医研究技术领域，尤其涉及一种颈动脉粥样硬化家兔模型造模及检测方法。


背景技术：

2.现代医学研究证实，高脂血症和糖尿病在动脉粥样硬化中占有非常重要的地位，某些代谢因素如同型半胱氨酸增高患者，冠心病的发病率明显增高，如合并糖尿病则更加加重其严重程度，而糖尿病亦可合并脂质代谢异常。
3.在治疗动脉粥样硬化的过程中，建立动脉粥样硬化动物模型可以更好地研究动脉粥样硬化的发病机制，也是进行动脉粥样硬化病理研究和药物开发的关键问题。近年来，许多学者应用各种动物模型对动脉粥样硬化进行了大量的实验研究。
4.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
5.在现有的模型造模中常用家兔、鼠、小型猪、非人灵长类和鸟类等动物来复制人类动脉粥样硬化病理模型，所采用的方法包括高脂喂养法，机械损伤法，转基因法，免疫法等。由于常规高脂喂养造模的成功率不够高。因此，为解决此类问题，我们提出一种颈动脉粥样硬化家兔模型造模及检测方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种颈动脉粥样硬化家兔模型造模及检测方法。
7.为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
8.一种颈动脉粥样硬化家兔模型造模及检测方法，包括选取实验材料、分组、造模、取材、血清制备、石蜡切片、检测七个步骤，其特征在于，所述造模步骤中包括饲养和施术两个过程。
9.优选的，所述选取实验材料过程中，包括如下步骤：采用新西兰雄性家兔，4月龄，普通级，体重2.0
‑
2.5kg。
10.所述分组过程中，包括如下步骤：家兔适应性饲养后，称重，将新西兰家兔随机分成正常对照组、模型组两组。
11.所述饲养过程中，包括如下步骤：
12.t1：正常对照组中，每兔每日进食普通颗粒饲料150g，自由饮水，喂养1周后灌服双蒸水5ml/kg/d，连续灌胃11周；
13.t2：模型组中，每兔每日进食高脂饲料(2％胆固醇、2％猪油、96％家兔普通颗粒饲料) 150g，自由饮水，1周后实施右颈动脉内膜空气干燥术，术后继续高脂喂养并同时灌服双蒸水5ml/kg/d，连续灌胃11周。
14.所述施术过程中，包括如下步骤：实验动物术前12h禁食，不禁水。在严格无菌条件下，动物经3％戊巴比妥钠30mg/kg静脉麻醉，颈部脱毛清洁消毒后，作颈正中切皮，于甲状
软骨上方水平分离右侧颈总动脉，长约2.5cm，两端以动脉夹阻断血流，4号头皮针尽可能平行于血管纵轴方向穿刺进入阻断血流的血管，生理盐水冲洗置换出管腔内的血液后，按上已调节好流量为250ml/min的气流，历时5min，造成内皮干燥，然后管腔内充满生理盐水，放开临时动脉夹恢复血流。湿润棉片轻轻压迫穿刺点3
‑
5min止血，待颈总动脉完全止血且血流通畅后缝合皮肤。术后每只给予庆大霉素肌注(按照成人等效剂量换算)，连续3天。
15.所述取材过程中包括如下步骤：
16.12周后，耳缘静脉注射空气10
‑
20ml处死家兔，取右侧颈总动脉。暂且放入液氮罐中保存24h，取部分放入4％多聚甲醛液固定(用于he染色)，余放入
‑
80℃冰箱冷冻保存。
17.所述血清制备过程中包括如下步骤：
18.腹主动脉取血，装于10ml离心管内，标记组别编号，3000rpm离心15min,制备血清，用于测定总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl
‑
c)及低密度蛋白胆固醇(ldl
‑
c)
‑
80℃保存备用。
19.所述石蜡切片过程中包括如下步骤：
20.组织在4％多聚甲醛液固定48h后，清水浸泡，流水洗净，常规石蜡包埋：
21.(1)48h后，清水浸泡2h，流水缓慢冲洗30min。
22.(2)组织切片：刀片切下0.3
‑
0.5cm的切片，边缘保持平整。
23.(3)冲洗脱水透明：放在组织包埋框中，自来水冲洗，然后放入吊篮，进入半封闭自动脱水机中脱水加透明。
24.(4)石蜡包埋：包埋盒底膜上先接蜡，在冷台上待底部凝固，将脱水后的组织平面朝下，用镊子压平，确认固定，将包埋框扣住，接满纯蜡，移到冷台待其完全凝固。
25.(5)修片：先固定好蜡块，调整好切片刀与蜡块的距离与角度，一般刀的倾斜度为4
‑
6 度，根据切片厚度调节厚度标志器。
26.(6)切片：一手转动转轮，另一手持笔在刀口下端接住切下的蜡带，选取切取较完整的蜡带，轻挑起并平放于装有自来水的盆中，保持转动均匀注。
27.(7)展片：将石蜡从自来水中用载玻片垂直捞出，放入40℃恒温水浴锅，待其在水浴锅中完全展开后，载玻片进行捞片。
28.(8)烘烤：恒温烤箱进行烤片，温度37℃烘烤过夜。
29.所述检测过程中包括如下步骤：
30.j1:需要使用到如下仪器：组织脱水机、轮转切片机、制冰机、超纯水系统、旋涡振荡器、摇床、低温高速离心机、电热恒温水槽、电热恒温培养箱、4℃冰箱、
‑
80℃冰箱、全自动生化分析仪、旋涡震荡器、96孔培养板、加样器吸头、超净工作台、电热恒温干燥箱、酶标仪 j2：检测方式中包括：he染色、内皮细胞生存率、血脂检查。
31.(1)he染色
32.1)脱蜡：60℃烤箱1h，二甲苯i 5min，二甲苯ii 5min,二甲苯iii 5min,二甲苯iv 5min。
33.2)水化：100％酒精5min,95％酒精5min,85％酒精5min,80％酒精5min,70％酒精5min, 蒸馏水洗10s。
34.3)染色：苏木精染色15min，自来水洗10s，0.5％盐酸分色5s，自来水(或温水)冲洗蓝化，蒸馏水冲洗，伊红染色5s。
35.4)再次脱水：85％酒精5min，95％酒精5min，无水酒精ⅰ5min，无水酒精ⅱ5min，二甲苯ⅰ5min，二甲苯ⅱ5min，二甲苯iii 5min，二甲苯iv 5min，树胶封片。(标本经二甲苯透明后，折射率改变，透明度提高，上色的部位更清晰的显示出来)
36.5)中性树胶封片：在标本上的二甲苯尚未干透之前加一滴树胶50ul，仔细覆盖上盖玻片(24
×
50mm)，避免产生气泡，勿拖动盖玻片，避免标本破坏。
37.6)显微镜下观察he染色结果。
38.(2)内皮细胞生存率
39.将内皮细胞用0.25％胰蛋白酶消化，以1.6
×
103/cm3浓度取200μl/孔种植于96孔板，每组8个孔，放入培养箱内培养24小时，然后按分组进行实验。分别取不同的组各加入mtt50 μl，再培养4
‑
6小时后加入dmso 200μl，在576nm处用酶标仪测定od值。
40.(3)血清血脂测定
41.1)将储存在
‑
80℃的兔血清解冻后10000rpm离心后取上清。
42.2)按照试剂盒说明书将1000ul工作液加入比色皿中，以加入10ul蒸馏水为空白管，以加入10ul校准品为校准管，样本管分别加入不同组样品10ul。
43.3)混匀后37℃孵育10min，波长510nm，光径0.5cm，蒸馏水调零，测定各组吸光度值。
44.本发明中通过前期选取实验材料、分组、造模建立完整的颈动脉粥样硬化模型，通过取材、血清制备、石蜡切片整理检测材料，通过检测验证模型完成度。
附图说明
45.图1为本发明提出的一种颈动脉粥样硬化家兔模型造模及检测方法的流程图；
46.图2为本发明提出的一种颈动脉粥样硬化家兔模型造模及检测方法的he染色右颈动脉的对照表；
47.图3为本发明提出的一种颈动脉粥样硬化家兔模型造模及检测方法的he染色右颈动脉内膜厚度的对照图；
48.图4为本发明提出的一种颈动脉粥样硬化家兔模型造模及检测方法的he染色右颈动脉中膜厚度的对照图；
49.图5为本发明提出的一种颈动脉粥样硬化家兔模型造模及检测方法的血脂指标的对照图；
50.图6为本发明提出的一种颈动脉粥样硬化家兔模型造模及检测方法的内皮细胞生存率的对照图。
具体实施方式
51.为了使本领域的技术人员可以更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明。需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后
……
)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
52.另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第
二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
53.实施例
54.如图1
‑
6所示，一种颈动脉粥样硬化家兔模型造模及检测方法，包括选取实验材料、分组、造模、取材、血清制备、石蜡切片、检测七个步骤，造模步骤中包括饲养和施术两个过程。
55.选取实验材料过程中，采用新西兰雄性家兔，4月龄，普通级，体重2.0—2.5kg。
56.家兔适应性饲养后，称重，在分组过程中，将新西兰家兔随机分成正常对照组、模型组两组。进一步说明，正常对照组中，每兔每日进食普通颗粒饲料150g，自由饮水，喂养1 周后灌服双蒸水5ml/kg/d，连续灌胃11周；模型组中，每兔每日进食高脂饲料(2％胆固醇、2％猪油、96％家兔普通颗粒饲料)150g，自由饮水，1周后实施右颈动脉内膜空气干燥术，术后继续高脂喂养并同时灌服双蒸水5ml/kg/d，连续灌胃11周。
57.施术过程前，实验动物术前12h禁食，不禁水；
58.在实验中，严格无菌条件下进行，动物经3％戊巴比妥钠30mg/kg静脉麻醉，颈部脱毛清洁消毒后，作颈正中切皮，于甲状软骨上方水平分离右侧颈总动脉，长约2.5cm，两端以动脉夹阻断血流，4号头皮针尽可能平行于血管纵轴方向穿刺进入阻断血流的血管，生理盐水冲洗置换出管腔内的血液后，按上已调节好流量为250ml/min的气流，历时5min，造成内皮干燥，然后管腔内充满生理盐水，放开临时动脉夹恢复血流；
59.湿润棉片轻轻压迫穿刺点3
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5min止血，待颈总动脉完全止血且血流通畅后缝合皮肤；
60.术后每只给予庆大霉素肌注(按照成人等效剂量换算)，连续3天。
61.12周后，耳缘静脉注射空气10
‑
20ml处死家兔，取右侧颈总动脉。暂且放入液氮罐中保存24h，取部分放入4％多聚甲醛液固定(用于he染色)，余放入
‑
80℃冰箱冷冻保存。
62.血清制备的方法为：
63.腹主动脉取血，装于10ml离心管内，标记组别编号，3000rpm离心15min,制备血清，用于测定总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl
‑
c)及低密度蛋白胆固醇(ldl
‑
c)
‑
80℃保存备用。
64.石蜡切片的方法为：组织在4％多聚甲醛液固定48h后，清水浸泡，流水洗净，常规石蜡包埋。进一步说明，石蜡切片的具体方法为：
65.(1)48h后，清水浸泡2h，流水缓慢冲洗30min；
66.(2)组织切片：刀片切下0.3
‑
0.5cm的切片，边缘保持平整；
67.(3)冲洗脱水透明：放在组织包埋框中，自来水冲洗，然后放入吊篮，进入半封闭自动脱水机中脱水加透明；
68.(4)石蜡包埋：包埋盒底膜上先接蜡，在冷台上待底部凝固，将脱水后的组织平面朝下，用镊子压平，确认固定，将包埋框扣住，接满纯蜡，移到冷台待其完全凝固；
69.(5)修片：先固定好蜡块，调整好切片刀与蜡块的距离与角度，一般刀的倾斜度为4
‑
6 度，根据切片厚度调节厚度标志器；
70.(6)切片：一手转动转轮，另一手持笔在刀口下端接住切下的蜡带，选取切取较完整的蜡带，轻挑起并平放于装有自来水的盆中，保持转动均匀注；
71.(7)展片：将石蜡从自来水中用载玻片垂直捞出，放入40℃恒温水浴锅，待其在水浴锅中完全展开后，载玻片进行捞片；
72.(8)烘烤：恒温烤箱进行烤片，温度37℃烘烤过夜。
73.检测方式中包括：he染色、内皮细胞生存率和血脂检查。进一步说明，需要使用到如下仪器：组织脱水机、轮转切片机、制冰机、超纯水系统、旋涡振荡器、摇床、低温高速离心机、电热恒温水槽、电热恒温培养箱、4℃冰箱、
‑
80℃冰箱、全自动生化分析仪、旋涡震荡器、96孔培养板、加样器吸头、超净工作台、电热恒温干燥箱、酶标仪
74.(1)he染色
75.1)脱蜡：60℃烤箱1h，二甲苯i 5min，二甲苯ii 5min,二甲苯iii 5min,二甲苯iv 5min。
76.2)水化：100％酒精5min,95％酒精5min,85％酒精5min,80％酒精5min,70％酒精5min, 蒸馏水洗10s。
77.3)染色：苏木精染色15min，自来水洗10s，0.5％盐酸分色5s，自来水(或温水)冲洗蓝化，蒸馏水冲洗，伊红染色5s。
78.4)再次脱水：85％酒精5min，95％酒精5min，无水酒精ⅰ5min，无水酒精ⅱ5min，二甲苯ⅰ5min，二甲苯ⅱ5min，二甲苯iii 5min，二甲苯iv 5min，树胶封片。(标本经二甲苯透明后，折射率改变，透明度提高，上色的部位更清晰的显示出来)
79.5)中性树胶封片：在标本上的二甲苯尚未干透之前加一滴树胶50ul，仔细覆盖上盖玻片(24
×
50mm)，避免产生气泡，勿拖动盖玻片，避免标本破坏。
80.6)显微镜下观察he染色结果。
81.(2)内皮细胞生存率
82.将内皮细胞用0.25％胰蛋白酶消化，以1.6
×
103/cm3浓度取200μl/孔种植于96孔板，每组8个孔，放入培养箱内培养24小时，然后按分组进行实验。分别取不同的组各加入mtt50 μl，再培养4
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6小时后加入dmso 200μl，在576nm处用酶标仪测定od值。
83.(3)血清血脂测定
84.1)将储存在
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80℃的兔血清解冻后10000rpm离心后取上清。
85.2)按照试剂盒说明书将1000ul工作液加入比色皿中，以加入10ul蒸馏水为空白管，以加入10ul校准品为校准管，样本管分别加入不同组样品10ul。
86.3)混匀后37℃孵育10min，波长510nm，光径0.5cm，蒸馏水调零，测定各组吸光度值。
87.本实施例的优点在于：设置正常对照组和模型组，在实验检测过程中，检测各项数据参数，例如he染色、内皮细胞生存率、血脂检查，通过对比参数的形式，确保颈动脉粥样硬化模型的完成度；通过本发明的造模方法，实现创伤小、操作简便、动物存活率高、造模成功率高且其他因素影响小，克服了现有技术中构建颈动脉粥样硬化斑块动物模型存在的问题，可用于筛选治疗动脉粥样硬化斑块药物等，对于颈动脉粥样硬化的研究具有重要意义。
88.以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的
普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本技术给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本技术的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。