一株福建鸡滑液囊支原体及其培养基的制作方法

1.本发明属于病原分离鉴定及病原培养技术领域，具体涉及一株鸡滑液囊支原体及其培养基。


背景技术：

2.鸡滑液囊支原体（mycoplasma synoviae，ms）是一种主要引起鸡和火鸡出现呼吸道症状和传染性滑膜炎症状的急性或慢性传染性疾病，该病四季均可发生，但主要在冬春季多发。鸡滑液囊支原体可以直接侵入鸡类软骨组织，导致家鸡的关节肿大肿胀、滑液囊及腱鞘发炎、跛行和瘫痪；鸡滑液囊支原体感染还能够降低蛋鸡产蛋率、蛋品质和孵化率，降低饲料转化率，使酮体废弃率升高，而且鸡滑液囊支原体可以垂直传播，给鸡群滑液囊支原体的扑灭带来很大困难。目前滑液囊支原体在全世界鸡场中都广泛存在，而且鸡滑液囊支原体容易与其他病原体发生交叉感染，加剧各病原体致病力，增加了死亡率，给养鸡业造成严重的经济损失。
3.鸡滑液囊支原体属于柔膜体纲支原体属，直径约0.2~0.4 μm，能通过0.45 μm的细菌滤器，以芽生方式或二分裂法繁殖，经姬姆萨染色后效果良好，在电子显微镜下观察具有多形性，大部分显示为圆形或梨形；鸡滑液囊支原体只有一个血清型，不同菌株的致病力有差异，引起的症状也因病原的趋向性而不同。鸡滑液囊支原体具有一般支原体的特征：即发酵葡萄糖，不水解精氨酸，不利用尿素。鸡滑液囊支原体是一类无细胞壁的原核生物，由于细胞壁的缺乏使其对影响细胞壁合成的大环内脂类抗生素不敏感，如青霉素等；但是，它们比那些具有细胞壁的病原对环境因素更敏感，鸡滑液囊支原体在羽毛中仅可存活时间3 d，在棉织物中仅能够存活2 d，在木头、秸秆中12 h后即可死亡，因此鸡滑液囊支原体具有更复杂的营养需求，人工培养时，培养基内必须加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶i)，另外还需加入牛或猪的血清，最适的培养温度为37℃。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一株鸡滑液囊支原体及其培养基。用本发明的鸡滑液囊支原体培养基培养所分离的鸡滑液囊支原体毒株具有培养方法简便，培养周期短，所需试剂少的优势，在培养和生产鸡滑液囊支原体中有很好的应用前景。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术如下：一株鸡滑液囊支原体，所述鸡滑液囊支原体，其分类命名为：mycoplasmasynoviae ms
‑
fj01 ；已保藏至中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no: m 2021210，保藏日期为2021年3月8号。
6.上述一株福建鸡滑液囊支原体分离于福州患有鸡滑液囊支原体的病鸡附关节，经纯化培养，并进行细菌学鉴定和动物感染试验，表明其病原特性稳定。
7.一对检测上述鸡滑液囊支原体的特异性引物，其核苷酸序列如下：ms
‑
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1：5
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ms
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jd506
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2：5
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。
8.一种上述鸡滑液囊支原体培养基，包括以下组分：脑心浸出液肉汤21 g、酵母浸出粉5.6 g、1wt%的酚红溶液2 ml、50 mg/ml的l
‑
半胱氨酸溶液2 ml、50 mg/ml的精氨酸溶液8 ml和250 mg/ml的辅酶i溶液0.4 ml，定容至900ml，加入灭活的胎牛血清100 ml、添加80万单位/l的青霉素，ph7.6～7.8。
9.进一步的，上述的培养基中还添加1wt%的琼脂粉，制备成鸡滑液囊支原体优化固体培养基。
10.上述鸡滑液囊支原体培养基在培养鸡滑液囊支原体中的应用。
11.上述鸡滑液囊支原体mycoplasma synoviae ms
‑
fj01在制备鸡滑液囊支原体疫苗中的应用。
12.本发明的有益效果：1、本发明中的鸡滑液囊支原体mycoplasma synoviae ms
‑
fj01属于福建省典型毒株，病原特性稳定，能够引起spf鸡出现典型的关节肿胀症状。
13.3、本发明的鸡滑液囊支原培养基所需试剂少，培养方法简便，培养周期短，能有效抑制杂菌对滑液囊支原体的影响。
14.4、鸡滑液囊支原体mycoplasma synoviae ms
‑
fj01在鸡滑液囊支原体培养基培养36 h即达到生长峰值，并且培养的滑液囊支原体活菌计数不低于10
12 ccu/ml。
15.附图说明：图1为鸡滑液囊支原体菌落图。
16.图2为将鸡滑液囊支原体攻毒至spf鸡后出现的临床症状。
17.图3为鸡滑液囊支原体16s rrna基因的进化树分析。
18.图4为鸡滑液囊支原体mycoplasma synoviae ms
‑
fj01核酸电泳鉴定图，其中m为marker，1为设计引物的鉴定结果，2为引用参考文献的引物鉴定结果。
19.图5为四种不同配方的鸡滑液囊支原体优化培养基培养鸡滑液囊支原体所测得的生长曲线图。
20.具体实施方式：下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
21.下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
22.实施例1、一株鸡滑液囊支原体的分离鉴定（一）鸡滑液囊支原体的分离采集福州鸡场疑似感染鸡滑液囊支原体的病鸡肿胀跗关节腔内的关节液及内容物，在无菌操作条件下，接种于改良frey氏液体培养基中，置37℃恒温振荡培养48h，待菌液由红色变成黄色时，将菌液用0.45μm过滤器过滤，并按滤液与改良frey氏液体培养基体积比为1∶10的比例重新接种到改良frey氏液体培养基中再次培养，收取第2代菌液用于病原菌的鉴定。
23.（二）鸡滑液囊支原体的鉴定1、菌体形态鉴定将分离的第2代菌液涂片，经吉姆萨染色后镜检，观察的菌体形态特征为球形或球杆型。
24.2、菌落形态观察取过滤后的菌种接种于改良frey氏固体培养基上，并置于体积分数为5%的co2培养箱中，37℃条件下培养7d，于显微镜下观察发现细小、光滑、致密的小菌落，表现为“煎蛋样”，半凹陷于培养基内（见图1）。
25.3、菌体l型鉴定取分离的第2代菌液接种在不含青霉素和醋酸铊的改良frey氏液体培养基，连续传代培养10次，再将培养菌液接种改良frey氏固体培养基，37℃恒温培养后观察菌落形态并进行涂片镜检。结果表明分离菌为菌体l型阴性。
26.4、鸡红细胞吸附试验制作1wt%鸡红细胞悬液，取5 ml悬液于已培养好分离菌的改良frey氏固体培养基表面, 室温孵育20 min，弃悬液，用生理盐水洗涤3次，于低倍显微镜下观察红细胞吸附情况。在低倍显微镜下可观察到菌落表面有红细胞吸附。
27.3、生化鉴定使用2.1g的脑心浸出液肉汤(环凯微生物)，10vol%的猪血清，1.12g的酵母浸出粉，1wt%的酚红配制成90ml的基础培养基，将葡萄糖，乳糖，精氨酸，尿素分别制成10wt%溶液，分别取10ml这些10wt%溶液加入上述基础培养基中；葡萄糖分解用培养基ph调整至7.6，精氨酸和尿素分解试验用培养基ph调整至7.0。在基础培养基中去掉酚红，加入2wt%的氯化三苯四氮唑，制成四氮唑还原试验培养基，然后过滤除菌。将分离的第2代菌液在加入了10vol%猪血清的心浸液肉汤中培养24h，取1ml接种于检测培养基中。结果显示该菌株能分解葡萄糖、乳糖；还原四氮唑；不分解精氨酸、尿素。
28.6、人工感染鉴定取分离的第2代菌液0.5 ml，经滴鼻点眼及脚垫内注射接种spf雏鸡，40 d 后感染鸡出现跛行、瘫痪、关节肿大、龙骨处有干酪样沉积物等明显的临床症状（见图2）。7、16s rrna基因的进化树分析扩增鸡滑液囊支原体毒株16s rrna基因，对扩增出来的基因序列进行测序，并与其他已知的几种鸡滑液囊支原体毒株进行比对和进化树分析。如图3所示，该鸡滑液囊支原体毒株与亚洲鸡滑液囊支原体毒株具有较高的同源性。
29.7、分子生物学鉴定根据genbank中登录的鸡滑液囊支原体基因全序列，使用primer 5软件设计合成一对特异性引物，分别为ms
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jd506
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1：5
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cttctatgcttaaactttcc
‑3’
，ms
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jd506
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2：5
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taaagatattac
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‑3’
，预期由两条引物扩增的目的片段大小为506 bp。并根据吴移谋主编的支原体学第二版合成目的片段大小为208 bp的一对引物，ms
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，ms
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208
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r：5
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‑3’
。用鸡滑液囊支原体特异性引物pcr扩增此分离株，如图4所示，鸡滑液囊支原体毒株能扩增出约506 bp和208bp的特异性片段。
30.通过以上各项鉴定结果表明，所分离的鸡滑液囊支原体毒株均符合鸡滑液囊支原体特性。
31.（三）鸡滑液囊支原体的保藏将鸡滑液囊支原体培养至稳定期，收集菌液60~100ml，使用超高速离心机离心收
集到鸡滑液囊支原体菌体沉淀物，使用18%脱脂乳将沉淀悬浮，采用冻干机进行冻干保存，送往中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏。所述的鸡滑液囊支原体其分类命名为：mycoplasmasynoviae ms
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fj01 ，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no: m 2021210，保藏日期为2021年3月8号。
32.实施例2、鸡滑液囊支原体培养基的制备（一）不同配方鸡滑液囊支原体液体培养基的制备1、取脑心浸出液肉汤、酵母浸出粉、酚红溶液、l
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半胱氨酸溶液、精氨酸溶液和辅酶i溶液混合溶解，用去离子水定容至900 ml。
33.2、使用盐酸将上述培养液的ph值调整为7.6~7.8。
34.3、在无菌的情况下往上述培养基中加入100 ml灭活的胎牛血清，并使用0.22 μm的细菌滤器过滤培养基至新的无菌容器中，最后加入80万单位/l的青霉素完成制备。
35.制备了4种成分比例不同的鸡滑液囊支原体液体培养基，具体方案见表1，以此筛选出培养鸡滑液囊支原体培养基的最佳方案。
36.表1：鸡滑液囊支原体液体培养基成分配比（二）鸡滑液囊支原体生长曲线的测定将所分离的鸡滑液囊支原体mycoplasma synoviae ms
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fj01菌液按1：10的体积比接种于上述4种培养基中，置于37℃培养箱中静置培养，每隔12h抽取1 ml菌液，使用紫外分光光度计在620nm的激发光下绘制鸡滑液囊支原体生长曲线。不同方案液体培养基的生长曲线结果表明：方案二液体培养基中的鸡滑液囊支原体36h后即可达到生长峰值然后进入稳定期，方案四培养基中的鸡滑液囊支原体在60h后才达到生长峰值，而方案一和方案三液
体培养基中的鸡滑液囊支原体几乎不生长（见图5）。这可能是由于过高的酵母浸出粉对鸡滑液囊支原体的生长造成了影响。
37.（三）鸡滑液囊支原体活菌计数将所分离的鸡滑液囊支原体mycoplasma synoviae ms
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fj01菌液按1:10的体积比接种于上述4种液体培养基，置于37℃培养箱中静置培养，分别在不同时间取样进行活菌计数。不同方案液体培养基的活菌计数结果表明：方案二培养基中的鸡滑液囊支原体在24 h、36 h以及48 h的活菌计数均不低于10
12 ccu/ml，而方案四培养基中的鸡滑液囊支原体的活菌计数结果均低于10
9 ccu/ml。
38.由于方案一和三中的鸡滑液囊支原体不生长，而方案四液体培养基由于营养物质过低导致培养效果相对较差，因此本发明最终选择方案二液体培养基为最佳的鸡滑液囊支原体液体培养基。
39.综上所述，本发明的鸡滑液囊支原体菌株mycoplasma synoviae ms
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fj01病原特性稳定，能作为制备鸡滑液囊支原体灭活疫苗的优势株。
40.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。