一种疫苗免疫佐剂及其在制备疫苗中的应用的制作方法

1.本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种疫苗免疫佐剂及其在制备疫苗中的应用。


背景技术：

2.甘草酸苷(glycyrrhizin，gl)全称为甘草酸单铵盐水合物，分子式c
42
h
61
o
16
nh4，为甘草中的主要成分，具有良好的免疫刺激和抗病毒作用，且人体吸收良好。目前已知甘草酸苷具有降低谷丙转氨酶、恢复肝细胞功能、防止脂肪性变、促进胆色素代谢及退黄、解毒、减少胶原纤维增生，防止肝硬化等作用。在作为食品添加剂方面，甘草酸苷具有低热能、安全无毒和较强的医疗保健功效，是高血压、肥胖症、糖尿病、心脏病患者使用的最理想甜味剂，有浓郁的甘草特殊香味，具有保健、解毒、护肝、消炎、增香等功效，是非常理想的纯天然甜味剂原料。
3.接种疫苗(vaccine)是公认的能够有效的阻断病毒流行的方式。疫苗一般分为两类：预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗主要用于疾病的预防，接受者为健康个体或新生儿；治疗性疫苗主要用于患病的个体，接受者为患者。根据传统和习惯，疫苗又可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、抗毒素、亚单位疫苗(含多肽疫苗)、载体疫苗、核酸疫苗等。
4.对于新型冠状病毒疫苗而言，正常人按标准方案接种疫苗并完成一个免疫程序后，仍有5％～10％的接种者的抗体滴度无法达到保护性阈值(即无应答或弱应答)，接种疫苗后仍然无法得到免疫保护，导致这部分人可能成为新冠易感者。目前，新冠疫苗无应答、弱应答的发生受多种因素的影响，其发生机制尚不明确。
5.cn107648603a公开了一种疫苗佐剂，所述疫苗佐剂包含6
‑
o
‑
硫酸化壳寡糖和2
‑
n,6
‑
o
‑
硫酸化壳寡糖；所述硫酸化壳聚糖的聚合度为2
‑
10的壳寡糖，分子量范围为400～10000da，其含硫量大于29％。所述硫酸化壳寡糖能够增强免疫应答，具有良好的佐剂作用，可以用作疫苗的佐剂，其主要针对的疫苗为猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗。
6.cn111729081a提供了一种疫苗佐剂及其制备方法和应用以及制得的疫苗。所述疫苗佐剂主要由注射用油、二缩甘露醇油酸酯、吐温
‑
85和稳定剂按特定比例复配制得。由上述疫苗佐剂与水性溶液混匀后制得的疫苗，在0～25℃时为水包油型疫苗乳液，在29℃～37℃时可转相为油包水型疫苗乳液。因此，其注射到动物体内在发生转相前会在很短的时间内出现一个很高抗原量暴露这一突释现象，然后疫苗在体温作用下迅速发生转相为油包水型疫苗乳液，从而实现既能满足免疫阈值对大量的抗原需要，又能迅速减少抗原的暴露量，进而实现了保证持续刺激机体免疫。然而，该疫苗佐剂成分较为复杂，生物安全性有待考证。
7.因此，在制备疫苗或使用疫苗的过程中，能够选择合适的佐剂，帮助诱发更强健和持久免疫反应，对于新型冠状病毒的预防具有重要的意义。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种疫苗免疫佐剂及其在制备疫苗中的应用。本发明中提供分析甘草酸苷对新冠疫苗无应答者pbmc细胞因子共刺激分子表达、同种异体淋巴细胞增殖反应以及细胞毒t淋细胞(ctl)杀伤活性，确定甘草酸苷可作为一种免疫疫苗佐剂，提升新冠疫苗的免疫应答率。
9.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
10.第一方面，本发明提供一种疫苗免疫佐剂，所述疫苗免疫佐剂包括甘草酸苷类化合物。
11.所述甘草酸苷类化合物包括甘草酸苷(glycyrrhizin，gl)、甘草酸单铵(又名甘草甜素、甘草皂甙或强力宁)或甘草酸单铵盐中的任意一种或至少两种的组合。
12.本发明中，结合具体的实验研究了甘草酸苷类化合物对疫苗，尤其是新冠疫苗无应答者免疫功能的影响。通过研究甘草酸苷和新冠rbd蛋白联合应用对新冠疫苗无应答者外周血单个核细胞(pbmc)、细胞因子(包括ifn
‑
y、il
‑
4和il
‑
10等)和共刺激分子b7(包括cd80、cd86等)mrna表达水平，并观察其刺激诱导的树突状细胞(dc)可否促进同种异体淋巴细胞增殖和提高细胞毒性t淋巴细胞的杀伤活性，探讨gl对新冠疫苗无应答者免疫功能的调节作用。
13.通过实验结果可知，甘草酸苷可促进新冠疫苗无免疫应答者的免疫功能，从而更好的推动新冠疫苗的研发和更新换代。
14.作为本发明优选的技术方案，所述免疫疫苗佐剂与配套使用的疫苗同时施用。
15.优选地，所述免疫疫苗佐剂作为所述疫苗制剂的组成成分，与所述疫苗同时施用。
16.优选地，所述免疫疫苗佐剂与配套使用的疫苗间隔施用。
17.优选地，所述免疫疫苗佐剂在施用所述疫苗之后单独施用。
18.优选地，所述免疫疫苗佐剂与所述疫苗的施用时间间隔为0.5～30天。
19.本发明中，所述甘草酸苷类化合物能够与疫苗同时使用，或者分开使用。在同时使用的过程中，甘草酸苷类化合物能够作为疫苗的组成成分(以配方中的组分或者与疫苗的有效成分结合)发挥作用；在分开使用的过程中，甘草酸苷能够在疫苗使用前后使用，优选为在注射疫苗后进行使用，其使用方式包括注射、口服等。所述甘草酸苷能够提高疫苗的免疫效果，尤其是对于疫苗无应答或者弱应答的接种人员来说，可促进此类人员得到较好的免疫效果。
20.第二方面，本发明提供一种疫苗制剂，所述疫苗制剂包含如第一方面所述的疫苗免疫佐剂。
21.优选地，所述疫苗制剂包括新型冠状病毒疫苗、流感病毒疫苗、腺病毒疫苗或人乳头状瘤病毒疫苗中的任意一种。
22.本发明中，为了证实甘草酸苷对于新型冠状病毒疫苗免疫效果的促进作用，设计了如下验证实验，具体步骤包括：
23.(1)收集新冠疫苗志愿者不同观察点血清和pbmc样本
24.招募接受新冠灭活疫苗志愿者，按照规定接种2剂疫苗，两针疫苗间隔28天，于第二针接种后一个月用真病毒中和实验，假病毒中和实验和中和抗体竞争法等多种方法检测中和抗体滴度；
25.多种方法的检测结果均为阴性，则确定为疫苗无应答者；均检测出抗体者，则为疫苗应答者，根据实验结果分为疫苗无应答组和疫苗应答组。
26.其中，真病毒中和试验检测方法参考如下步骤：特异性抗病毒抗体(中和抗体)与相应的病毒作用后，可阻止病毒对敏感细胞的吸附和穿入，从而抑制了病毒的繁殖，使病毒失去感染性；目前，中和抗体检测方法普遍接受的是活病毒中和实验(live
‑
cpe、live
‑
prnt和live
‑
mn)。
27.假病毒中和试验及交叉中和抗体的检测方法参考如下步骤：采用假病毒中和实验(pv
‑
hiv或pv
‑
vsv)来评价中和抗体。实验中，通过本领域常用的技术手段构建流行的新冠假病毒突变毒株并感染细胞，用酶标仪测定报告基因化学发光值以确定假病毒滴度。将疫苗接种者血清稀释一系列浓度梯度，同时，以covid
‑
19确诊血清或纯化的单克隆中和抗体为阳性对照，以健康人血清为阴性对照，分别加等体积包含100tcid
50 sars
‑
cov
‑
2的假病毒溶液混匀，孵育后加入96孔板单层细胞中，3天后检测各孔化学发光值。
28.ace2
‑
rbd/s1竞争法检测中和抗体水平的方法参考如下步骤：采用竞争法检测疫苗接种者血清中抗体水平，用重组人ace2受体蛋白(hace2)包被载体，用不同酶标记rbd/s1抗原蛋白酶标抗原，在第一步反应中，将样本与标记抗原进行预孵育，之后转入hace2包被板内，未结合中和抗体的酶标抗原就会与hace2结合，经洗涤后加入底物液，底物在酶的作用下生成有色产物，终止反应后在读取吸光值、发光值或荧光值，计算中抗rbd/s1中和抗体的有效活力。
29.(2)分析gl对新冠疫苗无应答者pbmc细胞因子共刺激分子表达；
30.疫苗无(弱)应答机制主要与机体免疫功能不完善有关无(弱)应答者体内th1/th2细胞因子分泌水平变化而导致的机体免疫状态失衡是保护性抗体不能产生的重要因素，应用实时pcr分析细胞因子(ifn
‑
γ、il
‑
4和il
‑
10)和共刺激分子b7(cd80和cd86)的表达。
31.ifn
‑
γ是典型的th1细胞因子，对被称为t细胞分化因子的il
‑
2具有促进作用其缺乏意味着机体对抗原特异性的无能。
32.il
‑
10最初认为是一种th2细胞因子，然而新近研究发现，th1细胞在il
‑
12的辅助下亦可分泌il
‑
10，其增加在维持th1/th2细胞因子平衡中发挥了重要的作用，提高机体的体液免疫水平，还可以抑制il
‑
4产生，对于机体产生达到保护作用的抗体具有积极的促进作用。
33.il
‑
4主要由th2细胞产生，抑制th1细胞增殖及其应答。
34.对ifn
‑
γ，il
‑
4，il
‑
10检测，可反映gl通过调节细胞因子影响机体的免疫应答过程。
35.共刺激分子b7(cd80、cd86)及其配体cd28结合是特异性免疫应答发生的重要因素，在防止形成免疫耐受方面起关健作用，其表达不足会直接影响疫苗诱导抗体形成。故检测共刺激分子mrna，可反映gl对于机体是否产生足够强度的免疫应答具有积极地促进作用。
36.(3)分析gl对新冠疫苗无应答者同种异体淋巴细胞增殖反应
37.树突状细胞(dc)是唯一能够刺激初始t细胞活化的细胞，具有丰富共刺激信号，同时还能分泌多种细胞因子，有利于激活其他免疫细胞，诱导出高效的免疫效应。对于同种异体淋巴细胞增殖反应的分析，有助于分析gl在促进dc成熟从而增强新冠疫苗无应答者免疫
功能方面的效果。
38.(4)分析gl对新冠疫苗无应答者细胞毒t淋细胞杀伤活性
39.对细胞毒t淋细胞(ctl)的细胞杀伤活性进行分析，ctl活性增强，其分泌的ifn
‑
γ可激活巨噬细胞及诱导病毒感染细胞表达mhc分子等能力都大大增强，使得低通量病毒感染引起的对新冠疫苗免疫耐受有望改善，此实验可反映gl作为佐剂作用是否具有潜在的治疗价值。
40.本发明中，甘草酸苷具有上调新冠疫苗的免疫应答、提高新冠疫苗无免疫应答者的免疫水平的效果。
41.优选地，所述疫苗制剂包括减毒疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或蛋白质疫苗中的任意一种。
42.作为本发明优选的技术方案，所述疫苗制剂包括：口服疫苗、静脉注射疫苗、动脉注射疫苗、粘膜给药疫苗、肌肉注射疫苗、皮下注射疫苗、器官注射疫苗或胸腹腔内注射疫苗中的任意一种或至少两种的组合。
43.作为本发明优选的技术方案，所述疫苗制剂包括人用疫苗制剂。
44.第三方面，本发明还提供一种疫苗复合物，所述疫苗复合物包含第一方面所述的疫苗免疫佐剂与疫苗中的有效成分结合形成的复合物。
45.作为本发明优选的技术方案，所述疫苗中的有效成分包括病毒抗原、病毒dna、病毒亚单位中的任意一种或至少两种的组合。
46.本发明中，所述甘草酸苷类化合物不仅可以作为单独的组分与疫苗中的有效成分组合，得到疫苗制剂；也可以将甘草酸苷类化合物作为修饰基团，
47.第四方面，本发明提供一种甘草酸苷类化合物在制备疫苗免疫佐剂、疫苗、疫苗复合物或疫苗辅助药物中的应用。
48.其中，所述疫苗辅助药物是指所述甘草酸苷类化合物作为辅助用药与疫苗联合使用来提升疫苗的作用。
49.本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
50.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
51.本发明中通过研究甘草酸苷对疫苗提高免疫应答功能的影响，将甘草酸苷和新冠rbd蛋白联合应用，分析其对新冠疫苗接种者者外周血单个核细胞(pbmc)、细胞因子(ifn
‑
y、il
‑
4和il
‑
10)和共刺激分子b7(cd80、cd86)mrna表达水平的影响，并观察其刺激诱导的树突状细胞(dc)可否促进同种异体淋巴细胞增殖和提高细胞毒性t淋巴细胞的杀伤活性，探讨甘草酸苷对新冠疫苗免疫应答功能的调节作用，实验结果可知，甘草酸苷可促进新冠疫苗免疫应答的免疫功能，合理利用甘草酸苷能够更好地推动疫苗，尤其是新冠疫苗的研发和更新换代。
附图说明
52.图1为本发明中用于验证甘草酸苷对于新型冠状病毒疫苗免疫效果的作用的实验流程示意图。
具体实施方式
53.下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
54.以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
55.本发明中验证甘草酸苷提升免疫效果的总体技术方案如图1所示：
56.(1)收集新冠灭活疫苗接种志愿者的血清和pbmc样本；所述血清样本经过多重实验验证，进而对新冠灭活疫苗接种志愿者中的应答者和无应答者进行区分；
57.(2)在所述新冠灭活疫苗接种志愿者中的应答者和无应答者的疫苗接种完毕一个月后，采样提取pbmc；
58.分析甘草酸苷对新冠疫苗有、无应答者pbmc细胞因子和共刺激分子表达情况的影响；
59.分析甘草酸苷对新冠疫苗有、无应答者的同种异体淋巴细胞增殖反应；
60.分析gl对新冠疫苗有、无应答者中细胞毒t淋细胞(ctl)杀伤活性；
61.(3)结合实验结果，提供一种提升新冠疫苗应答率的有效办法。
62.实施例1
63.本实施例中用于收集新冠灭活疫苗接种志愿者中应答者和无应答者的pbmc细胞样本。
64.(1)招募研究接种者：
65.入选标准：18～50岁年龄、性别不限，样本量足够；
66.剔除标准：家族和个人有惊厥史，有癫痫史，过敏体质者，是否注射免疫球蛋白至少间隔一个月。全部入组志愿者均排除新冠病毒感染及心脑、肾和其他器官疾病。
67.(2)收集样本
68.采集样本的时间：招募接受新冠灭活疫苗志愿者，按照规定接种2剂疫苗，两针疫苗间隔28天，收集免疫前、一免28天和二免一个月的血清和细胞。
69.入组对象：于第二针接种后一个月，用真病毒中和实验、假病毒中和实验和中和抗体竞争法3种方法检测样本中的新冠中和抗体；
70.三种方法检测均为阳性确定为疫苗应答者50例，三种方法检测均为阴性确定为疫苗无应答者50例，分为疫苗无应答组和疫苗应答组。
71.(3)pbmc的提取
72.用肝素抗凝采血管，取疫苗无应答组和疫苗应答组中研究对象的外周血，与等量的rpmi 1640混匀，ficoll密度梯度离心法分离pbmc细胞；
73.台盼蓝染色，证实活细胞达95％以上；用pbs洗去血小板，然后再用含10％人ab血清的rpmi 1640悬浮pbmc细胞。
74.实施例2
75.本实施例中通过实时pcr的方法分析pbmc细胞因子共刺激分子表达情况。
76.(1)实验分组：
77.a组：应答组，疫苗应答者pbmc 新冠s蛋白或rbd蛋白；
78.b组：gl s/rbd 无应答组，疫苗无应答者pbmc 新冠s或rbd蛋白 gl；
79.c组：s/rbd 无应答组，疫苗无应答者pbmc 新冠s或rbd蛋白；
80.d组：gl 无应答组，疫苗无应答者pbmc gl。
81.具体分组情况如下表1所示：
82.表1
[0083][0084]
(2)real
‑
time rcr分析pbmc细胞因子共刺激分子方法
[0085]
以上四组，a、b和c组三组均给予5μg/ml终浓度的s或rbd刺激，gl s/rbd刺激组同时给予终浓度10μg/ml的gl刺激，d组只给予终浓度10μg/ml的gl刺激；
[0086]
于37℃，5％co2培养箱内培养48小时后收集细胞至1.5ml的ep管中。
[0087]
每管分别加入1ml trizol，氯仿/异丙醇法提取总rna，紫外分光光度计测定提取的rna浓度和纯度，1％琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性。
[0088]
rt
‑
pcr逆转录试剂盒进行逆转录，并对逆转录的cdna在abi7500实时荧光定量基因扩增仪上进行实时荧光定量pcr反应。
[0089]
反应总体系25μl；
[0090]
real
‑
timepcr扩增条件为：95℃30秒预变性，95℃变性5秒，60℃退火和延伸34秒，40个循环。
[0091]
每个样品3个重复，同时设无模板对照，将ifn
‑
γ、il
‑
4、il
‑
10、cd80和cd86的mrna与gap
‑
dh的(ct值)换算为基因的相对表达量2
‑
δδct
，将正常对照组归一化处理，比较各组间的表达差异。
[0092]
实施例3
[0093]
本实施例用于分析gl对新冠疫苗无应答者同种异体淋巴细胞增殖反应和ctl杀伤活性。
[0094]
(1)dc的诱导
[0095]
取研究对象的pbmc(浓度为2
×
106ml
‑1)，加入6孔板(2ml/孔)，37℃、5％co2培养箱中温育2小时后分别收集贴壁细胞和悬浮细胞。
[0096]
实验组分为新冠疫苗应答组和无应答组。
[0097]
应答组：加入rhgm
‑
csf 100μg/l和rhil
‑
4 100μg/l刺激，于第5天加入s/rbd(5μg/ml)；
[0098]
无应答组分为2组，组1为常规诱导组：加入rhgm
‑
csf 100μg/l和rhil
‑
4 100μg/l培养8天；组2再分a、b、c三组：每组均加入rhgm
‑
csf100μg/l和rhil
‑
4 100μg/l，培养第5天再按分组加入不同刺激物，
[0099]
a组：s/rbd(5μg/ml)；
[0100]
b组：s/rbd(5μg/ml) gl(10μg/ml)；
[0101]
c组：gl(10μg/ml)。
[0102]
隔天半量换液并补充细胞因子，倒置显微镜观察细胞生长数量及形态变化，第8天可见细胞呈悬浮状态，体积增大，伪足样、树枝状突起增多、变长。
[0103]
(2)检测同种异体混合淋巴细胞反应
[0104]
取新冠疫苗应答者的pbmc，37℃、5％co2培养箱中温育2小时后，收集非贴壁细胞，调整浓度为1
×
106ml
‑1作效应细胞。
[0105]
取以上诱导的dc，加入25μg/ml丝裂霉素c去除增殖作用并调整密度为l
×
105ml
‑1作刺激细胞，依据预实验确定1:20为dc与异体淋巴细胞最适比例，对照孔不加dc，置于37℃、5％co2培养箱孵育72小时，加入cck
‑
8溶液10μl/孔，继续培养4小时后，测od
450nm
值，结果以3孔均值表示。
[0106]
刺激指数(si)＝实验孔od
450nm
/对照组od
450nm
[0107]
(3)细胞杀伤活性测定
[0108]
取以上诱导的各组dc分别加自体淋巴细胞混合培养7天诱导出ctl作为效应细胞，同时设对照组为单纯自体淋巴细胞。
[0109]
取传代后24小时的k562细胞作为靶细胞，调整浓度为5
×
104ml
‑1。
[0110]
效应细胞浓度分别调整为2.5
×
105、5
×
105、l
×
106ml
‑1，效靶比依次为5:1、10:1、20:1。置37℃、5％co2培养箱中孵育48小时，加入cck
‑
8溶液10μl/孔，继续培养4小时后，测od
450nm
值，结果以3孔均值表示。
[0111]
细胞杀伤率(％)＝(单纯效应细胞孔的od
450nm
单纯靶细胞孔的od
450nm
‑
细胞毒实验孔的od
450nm
)/单纯靶细胞孔的od
450nm
×
l00％
[0112]
实施结果：
[0113]
1.gl s/rbd联合刺激组pbmc的ifn
‑
γ、il
‑
10、cd80和cd86 mrna表达水平高于s/rbd单独刺激组，差异均有统计学意义(p<0.05)，且cd86mrna表达水平高于应答组(p<0.05)。反映了甘草酸苷通过调节细胞因子影响机体的免疫应答过程，且对于机体是否产生足够强度的免疫应答具有积极地促进作用。
[0114]
2.与s/rbd单独刺激组比较，gl s/rbd联合刺激组dc刺激同种异体淋巴细胞增殖的作用明显增强(p<0.05)，且高于应答组(p<0.05)，说明甘草酸苷促进dc成熟从而增强新冠疫苗免疫应答功能。
[0115]
3.gl s/rbd联合刺激组激活的ctl对k562细胞杀伤作用亦显著提高(p<0.05)，其细胞杀伤作用接近应答组水平(p>0.05)。ctl活性增强，其分泌的ifn
‑
γ可激活巨噬细胞及诱导病毒感染细胞表达mhc分子等能力都大大增强，使得低通量病毒感染引起的对新冠疫苗免疫耐受有望改善，此结果可反映甘草酸苷作为佐剂作用是否具有潜在的抗病毒治疗价值。
[0116]
综上所述，甘草酸苷对新冠疫苗免疫答者功能具有调节作用，联合新冠表面s蛋白或rbd蛋白可诱导机体创造更有利于新冠病毒保护性抗体产生的环境，为其临床应用提供实验依据。
[0117]
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。