2型糖尿病灵长类动物模型的构建方法与流程

1.本发明涉及动物模型构建方法，具体涉及2型糖尿病灵长类动物模型的构建方法。


背景技术：

2.目前2型糖尿病(type ii diabetes mellitus，t2dm)灵长类动物模型主要依赖天然筛选、高能量膳食诱导和药物诱导获得。然而，天然筛选获得的模型动物数量有限，膳食诱导周期长且效率不高，药物诱导的病理机制与临床不同，应用范围窄。
3.目前已报道的灵长类动物(猴)糖尿病模型主要有高糖高脂饮食诱导(cn103478071a)，光照诱导(cn108812525a)，以及结合注射化学药物链脲佐菌素(stz)诱导(cn 112425561a)等方式。
4.单纯高糖高脂膳食诱导周期比较长，需要2
‑
4年时间，成模效率也比较低下(不足5％)。
5.光照诱导的方法未见与2型糖尿病密切相关的肥胖症状，也未检测到2型糖尿病常伴随的糖、脂、胆固醇代谢异常，提示所诱导的模型与临床的致病机理有显著差异，可能不是良好的2型糖尿病模型。
6.化学药物链脲佐菌素联合高糖高脂膳食和夜间光照刺激的模型，其光刺激诱导是在stz给药4个月后才施加，stz是直接损害胰岛细胞的一种化学物，其引起的血糖增高未经过胰岛素抵抗这一2型糖尿病的致病路径，因此其模型与1型糖尿病更为贴近，与临床的2型糖尿病致病机理有显著差异。其模型也未出现肥胖和糖、脂、胆固醇代谢异常等与2型糖尿病密切相关的指征，也说明其模型不是一类良好的2型糖尿病模型。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于改进2型糖尿病灵长类动物模型的造模方法，通过对夜间熄灯时间的轮替调整，结合喂食高糖高脂饲料，实现了造模时间短、效率高的特点，所得动物模型具有与2型糖尿病致病机理密切相关的指征。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：
9.2型糖尿病灵长类动物模型的构建方法，包括以下步骤：
10.取中年实验猴，喂食高糖高脂饲料，笼舍的熄灯时间为2:00
‑
12:00，两周后调整为正常的熄灯时间20:00至次日6:00，再两周后调整为2:00
‑
12:00，如此轮流交替变化；至少6个月后，完成造模；
11.所述的中年实验猴，年龄为14
‑
18周岁；
12.所述的实验猴，先剔除空腹血糖值过高的个体；具体地，剔除fpg≥4.5的实验猴个体；
13.所述的实验猴，优选食蟹猴(cynomolgus,macaca fascicularis)；
14.所述的喂食，每天投喂两次高糖高脂饲料，每次保障动物按最大进食意愿进食，具体投喂量可为200
±
50克/头动物；此外每天投喂一次时令果蔬，平均每头动物100克，饮用
水可以随时随意获取；
15.若笼舍的熄灯时间为2:00
‑
12:00，则投喂时间为14:30和21:30；若笼舍的熄灯时间20:00至次日6:00，则投喂时间为9:30和16:00；
16.所述高糖高脂饲料的配方为：玉米粉16％、豆粕粉4％、麸皮4％、钙粉0.3％、磷酸氢钙0.4％、膨化大豆粉3.5％、蛋氨酸0.1％、赖氨酸0.1％、维生素c 0.3％、面粉18％、猪油15％、白砂糖30％、胆固醇0.3％、鱼粉8％。
17.2型糖尿病本质上属于代谢紊乱性疾病，灵长类动物的代谢变化与昼夜交替密切相关，而感受昼夜变化的主要因素是光照刺激。进食不规律也会干扰代谢功能的稳定性。本发明的主要原理是通过改变灵长类动物接受光照和进食时间扰乱其生物钟规律，诱导节律紊乱状态，进而提高2型糖尿病的发生率。
18.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
19.本发明首次使用干扰动物昼夜节律和进食时间的方法迫使非人灵长类实验动物改变作息时间，同时结合高糖高脂膳食造模。简单易操作，效果明显。此方法可显著提高t2dm在中年猴中造模效率(3个月70％，6个月80％)，造模周期比之前报道的方法少了50％以上。并且该方法与自然发病机制相近(动物模型多数会出现肥胖及糖脂、胆固醇代谢异常)，而之前利用光照刺激和联合药物诱导的方法均未有肥胖和糖脂代谢异常。在停止诱导半年后仍维持糖尿病症状，说明该模型可作为一种稳定的t2dm模型。可为科学研究和药物测试提供优质动物模型。
具体实施方式
20.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
21.实施例
22.2型糖尿病灵长类动物模型的构建方法，包括以下步骤：
23.随机选取一批14
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18周岁的实验猴(食蟹猴cynomolgus,macaca fascicularis,购自广西桂东灵长类开发实验有限公司)，通过测量空腹血糖值剔除部分可能属于自发糖尿病的个体(fpg≥4.5)。留下90头空腹血糖值正常的动物，随机分为3组，第一组为正常对照组，熄灯时间20:00至次日6:00；第二组给与高糖高脂饲料，熄灯时间20:00至次日6:00；第三组(实验组)给予高糖高脂饲料并改变其饲养房间的熄灯时间，具体做法是笼舍的熄灯时间为2:00
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12:00，两周后调整为正常的熄灯时间20:00至次日6:00，再两周后调整为2:00
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12:00，如此轮流交替变化；
24.所述高糖高脂饲料的配方为：玉米粉16％、豆粕粉4％、麸皮4％、钙粉0.3％、磷酸氢钙0.4％、膨化大豆粉3.5％、蛋氨酸0.1％、赖氨酸0.1％、维生素c 0.3％、面粉18％、猪油15％、白砂糖30％、胆固醇0.3％、鱼粉8％。
25.正常对照组饲料为北京科澳协力饲料有限公司的猴维持饲料，主要原料组成为玉米，豆粕，鱼粉，面粉，酵母粉，植物油，食盐，多种维生素和矿物元素等。
26.造模过程中，每天两餐，每次投喂量为200克/头动物的量，投喂时若发现某一动物上一餐全部吃完，给其增加50克投喂量，保障动物可按最大进食意愿进食。此外每天投喂一次时令果蔬，平均每头动物100克，饮用水动物可以随时随意获取。
27.若笼舍的熄灯时间为2:00
‑
12:00，则投喂时间为14:30和21:30；若笼舍的熄灯时
间20:00至次日6:00，则投喂时间为9:30和16:00。
28.造模开始3个月和6个月后，实验猴的各项生理指标如表1
‑
表6所示：
29.表1：造模前后实验猴的体重
[0030][0031]
表2：造模前后实验猴的空腹血糖水平
[0032][0033]
表3：造模前后实验猴的空腹胰岛素水平
[0034][0035]
由表1
‑
表3可以看出，实验开始3个月后，正常对照组动物的体重、fpg和空腹胰岛素水平无明显变化。高热高脂饲料组(第二组)动物体重显著增加，空腹血糖和胰岛素水平略微增加。高热高脂饲料 作息时间干扰组(实验组)动物体重、空腹血糖和胰岛素水平显著增加。
[0036]
6个月后，正常对照组动物的体重、fpg和空腹胰岛素水平仍无明显变。高热高脂饲料组(第二组)组动物体重比3个月前无显著增加，空腹血糖和胰岛素水平无明显变化。高热高脂饲料 作息时间干扰组动物体重、空腹血糖和胰岛素水平进一步增加，达到糖尿病诊断标准，提示造模成功。
[0037]
2型糖尿病多数是由于肥胖症导致的代谢紊乱造成的，核心分子机制是外周组织器官的胰岛素抵抗。2型糖尿病常伴随有脂质、胆固醇的代谢异常。本发明造模方式贴近临床病人的致病因素，贴伴随有肥胖和脂质、胆固醇的代谢异常。表4的统计结果显示，高糖高脂组和实验组在诱导3个月后均可造成甘油三酯、低密度脂蛋、胆固醇白水平显著升高，诱导6个月后会进一步增加，实验组比高热高糖组导致的脂质、胆固醇指标更高更快。
[0038]
由表5可见，实验组在6个月内可诱导80％的动物成为2型糖尿病模型，非常高效，而高糖高脂组未见有动物出现糖尿病指征，说明改变昼夜节律是非常有效的方法。而且，实验组可导致更多的动物出现肥胖，脂质、胆固醇代谢水平异常程度更高。
[0039]
由表6可见，本发明所得动物模型在停止诱导半年后仍维持糖尿病症状，说明该模型可作为一种稳定的t2dm模型。
[0040]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的
限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0041]