植物活化剂的用途的制作方法

植物活化剂的用途
1.本技术是分案申请，其原申请的中国国家申请号为201880018032.0，申请日为2018年3月13日，发明名称为“植物活化剂”。
技术领域
2.本发明涉及植物活化剂。


背景技术：

3.自古以来，为了促进植物的生长，已经进行了优化温度条件、日照条件或进行施肥等对策。但是，这些对策有局限性。例如，即使增加施肥中使用的肥料的量，也无法期待一定以上的生长促进效果，不仅如此，若肥料施用过多，则反而会成为植物生长的障碍，进而还可能会污染土壤。
4.因此，除了上述对策以外，还有报告提出了使用具有生长促进、休眠抑制、胁迫抑制等植物生长调节作用的植物活化剂使植物活化的方法。例如，专利文献1中记载了一种以α
‑
酮醇不饱和脂肪酸作为有效成分的花芽形成诱导剂。专利文献2中记载了一种以碳原子数为4～24的酮醇脂肪酸作为有效成分的植物活化剂。专利文献3中记载了一种以α
‑
酮醇脂肪酸衍生物作为有效成分的植物生长调整剂。
5.另一方面，植物病虫害的防除在很大程度上依赖于化学合成农药，但从土壤污染和对人的健康危害的方面出发，期望削减农药用量。另外，过量散布农药导致的耐药细菌的产生也成为问题。因此，已知使用不显示直接的抗菌活性而诱导植物抗病性的抗性诱导剂。例如，噻菌灵、异噻菌胺、阿拉酸式苯
‑
s
‑
甲基(asm)、3
’‑
氯
‑
4,4
’‑
二甲基
‑
1,2,3
‑
噻二唑
‑5‑
甲酰苯胺(噻酰菌胺)等作为抗病诱导剂被商品化。这些抗性诱导剂为水杨酸类似物，其活化以病原菌或病毒为激发子(elicitor)的基于水杨酸类似物的系统获得抗性的诱导中的植物体内的水杨酸途径。另外，多效霉素是通过抑制海藻糖分解酶的活性来消耗病原菌的能源而抑制细菌繁殖的防除剂，据报道其对青枯病菌显示出系统获得抗性的诱导。
6.现有技术文献
7.专利文献
8.专利文献1：日本特开平9
‑
295908公报
9.专利文献2：日本特开2001
‑
131006号公报
10.专利文献3：国际公开第2011/034027号


技术实现要素：

11.发明所要解决的课题
12.基于专利文献1～3中记载的使用酮醇脂肪酸的植物活化剂的效果并不充分。另外，现有的抗性诱导剂为化学合成品，具有毒性极高的问题。此外，多效霉素针对茄科植物的青枯病被认为是有效的，但存在对番茄产生药害而无法使用的问题。其他合成抗性诱导剂也具有容易引起药害的倾向，进而抗性基因的表达、抗性的赋予也不充分。要求一种环境
负担低、包含抗性诱导表达的活化作用优异的植物活化剂。
13.已知以过氧化脂质为代表的脂肪酸氧化物显示出抗菌作用。另外，据报道：番茄来源的氧代脂肪酸13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸具有强烈的激动剂活性，其将控制与脂质代谢有关的各种基因的表达的转录因子pparα(过氧化物酶体增殖物激活受体α亚型)活化，有可能改善高甘油三酯血症等脂质代谢异常或脂肪肝。但是，尚未知道氧代脂肪酸具有作为植物活化剂的效果。
14.本发明的目的在于提供一种土壤污染和毒性低、抗性诱导效果优异的植物活化剂。
15.用于解决课题的手段
16.本发明涉及一种植物活化剂，其特征在于，其包含具有下述式：
17.hooc
‑
(r1)
‑
c＝c
‑
c(＝o)
‑
r2(i)
18.(式中，
19.r1：为直链或支链的碳原子数为6～12的烷基、并且可以包含1个或2个以上的双键；
20.r2：为碳原子数为2～8的烷基、并且可以包含1个或2个以上的支链和/或双键)的结构式的氧代脂肪酸衍生物或其盐或者酯作为有效成分。
21.优选下述植物活化剂，其中，上述氧代脂肪酸衍生物是上述氧代脂肪酸衍生物的r1的烷基的碳原子数为8～10、r2的烷基的碳原子数为4～6的氧代脂肪酸衍生物。
22.优选下述植物活化剂，其中，上述氧代脂肪酸衍生物是上述氧代脂肪酸衍生物的r1包含与式(i)中的羰基的α和β碳之间的双键形成共轭双键的双键的氧代脂肪酸衍生物。
23.优选下述植物活化剂，其中，上述氧代脂肪酸衍生物是上述氧代脂肪酸衍生物的r1是碳原子数为9的烷基、r2是碳原子数为5的烷基的氧代脂肪酸衍生物。
24.优选下述植物活化剂，其中，上述氧代脂肪酸衍生物是(9z,11e)
‑
13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸或其盐。
25.优选下述植物活化剂，其中，上述氧代脂肪酸衍生物是(9z,11e)
‑
13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸。
26.上述植物活化剂优选为进一步包含12
‑
氧代
‑
植物二烯酸或其盐的植物活化剂。
27.上述植物活化剂优选为进一步包含表面活性剂和/或稀释剂或者载体的植物活化剂。
28.优选下述植物活化剂，其中，上述氧代脂肪酸衍生物或其盐或者酯的浓度为0.012～0.12g/l(升)。
29.优选下述植物活化剂，其中，上述12
‑
氧代
‑
植物二烯酸或其盐的浓度为0.012～0.12g/l。
30.上述植物活化剂优选为被用作与植物的叶茎或根接触的喷雾剂或者浸渍用药剂、或者土壤灌注用药剂的植物活化剂。
31.上述植物活化剂优选为对十字花科植物使用的植物活化剂。
32.发明的效果
33.本发明的植物活化剂容易在环境中分解，因此土壤污染和毒性低，并且具有优异的抗性诱导效果。
附图说明
34.图1是示出抗性基因的表达量的图。
具体实施方式
35.植物活化剂
36.本发明的植物活化剂为氧代脂肪酸衍生物，其特征在于，其包含具有下述式：
37.hooc
‑
(r1)
‑
c＝c
‑
c(＝o)
‑
r2(i)
38.(式中，
39.r1：为直链或支链的碳原子数为6～12的烷基、并且可以包含1个或2个以上的双键；
40.r2：为碳原子数为2～8的烷基、并且可以包含1个或2个以上的支链和/或双键)的结构式的氧代脂肪酸衍生物或其盐或者酯作为有效成分。另外，本发明涉及一种植物活化剂，其包含：包括所有几何异构体和立体异构体的式(i)的化合物或其盐或者酯作为有效成分。
41.本发明中的“植物活化”是指调整成以某种形式活化或维持植物的生长活动，是包括生长促进(为包括叶茎的扩大、块茎块根的生长促进等的概念)、休眠抑制、针对植物胁迫的抗性的诱导和赋予、抗老化等植物生长调节作用的概念。例如，使本发明的植物活化剂与植物的叶茎或根的一部分接触，由此能够对植物诱导抗性。通过接种本发明的植物活化剂，在植物体内确认到抗性基因pr1和pr2的表达量的增加，因此认为本发明的植物活化剂通过水杨酸系统途径诱导了系统抗性。通过使用本发明的植物活化剂，在植物中可促进与对病害虫的抗性有关的器官的发达及物质生成。本发明的植物活化剂的抗性诱导效果非常高，其结果，能够带来优异的植物病害抑制效果。
42.氧代脂肪酸是已知作为不饱和脂肪酸代谢的中间体生成的稀有脂肪酸。本发明中作为氧代脂肪酸衍生物的一例使用的13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸是通过亚油酸的氧化代谢获得的代谢物之一。亚油酸通过作为亚油酸代谢酶之一的脂氧合酶以酶促方式转换为过氧化脂质(氢过氧化十八碳二烯酸(hpode))，或者通过由氧化胁迫产生的自由基引起的氧化以非酶促方式转换为过氧化脂质(氢过氧化十八碳二烯酸(hpode))，该过氧化脂质hpode通过过氧化物酶等转换为羟基十八碳二烯酸(hode)。通过羟基脂肪酸脱氢酶等，由羟基十八碳二烯酸(hode)生成氧代十八碳二烯酸。另外，氧代十八碳二烯酸也通过向过氧化脂质hpode作用丙二烯氧化物合酶、接着脂肪酸氢过氧化物裂解酶，经环氧十八碳二烯酸而生成。
43.另一方面，亚油酸通过脂肪酸去饱和酶转换为亚麻酸。亚麻酸通过脂氧合酶转换为过氧化脂质(氢过氧化十八碳三烯酸(hpote))，该过氧化脂质hpote通过丙二烯氧化物合酶、接着丙二烯氧化物环化酶的作用，经作为丙二烯氧化物的环氧十八碳三烯酸而转换为作为茉莉酮酸前体的12/10
‑
氧代
‑
植物二烯酸(12/10
‑
opda)。由环氧十八碳三烯酸，通过脂氧合酶还生成酮醇脂肪酸。另外，过氧化脂质hpote还通过还原酶转换为作为共轭氧化脂质的羟基十八碳三烯酸(hote)。
44.如后所述，本发明的植物活化剂所具有的抗性诱导表达高的效果在代替氧代脂肪酸而使用上述的过氧化脂质(hpode、hpote)或共轭氧化脂质(hote)时无法获得。特别是，作
为13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸的前体物质的过氧化脂质(13
‑
hpode)未发现本发明的植物活化剂那样的抗性诱导效果，因而认为本发明的植物活化剂所产生的优异的抗性诱导效果是氧代脂肪酸特异的效果
45.此外，如上所述，以往作为诱导茉莉酮酸途径的抗性基因表达的化合物而已知的茉莉酮酸前体12/10
‑
opda、作为诱导与系统抗性有关的水杨酸途径的抗性基因表达的化合物而被报道的共轭氧化脂质hote、以及酮醇脂肪酸全部是由从亚油酸生成的亚麻酸合成的脂肪酸类似物质。另一方面，本发明中使用的13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸是不经亚麻酸而由亚油酸直接生成的。即，本发明中的13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸带来的抗性诱导效果是为了诱导更优异的抗性而以亚油酸的新代谢途径为目标从而首次获得的。
46.本发明中使用的13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸是通过亚油酸的代谢获得的、天然存在的代谢物。即，认为使用天然存在的代谢物的本发明的植物活化剂是沿着植物的代谢途径的物质，功能表达容易。另外，认为在施用于植物后在环境中的分解也容易，因而土壤污染的可能性及毒性低。
47.本发明的植物活化剂通过水杨酸途径对植物诱导系统抗性，抑制植物病害。另外，本发明的植物活化剂也可以与其他抗性诱导剂合用。例如，本发明的植物活化剂可以在与诱导茉莉酮酸途径的抗性基因表达的茉莉酮酸前体12/10
‑
opda的共存下，对植物进行施用。水杨酸途径和茉莉酮酸途径两者互补地被活化，可对植物诱导更高的抗性。茉莉酮酸前体等其他抗性诱导剂例如能够以与本发明的氧代脂肪酸衍生物或其盐或者酯的浓度相同程度的浓度与本发明的氧代脂肪酸衍生物或其盐或者酯合用使用。
48.根据需要，本发明的植物活化剂中可以含有适合用于植物活化剂的相容性的表面活性剂和/或稀释剂或者载体。例如，通过稀释剂，例如13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸或其盐或者酯的分散性有时提高。另外，为了提高本发明中使用的氧代脂肪酸衍生物在稀释剂中的溶解性或分散性，例如可以含有分散助剂或润湿剂等表面活性剂等。作为这些添加成分，只要是农业上可允许的药剂就没有特别限定。另外，也可以进一步含有表面活性剂、稀释剂、载体以外的通常用于农药制剂等的成分。
49.本发明中，氧代脂肪酸衍生物或其盐或者酯能够以0.12g/l以下的浓度使用。氧代脂肪酸衍生物或其盐或者酯的优选浓度取决于所施用的植物种类及其状态，在浓度超过0.12g/l的情况下，有可能产生对于植物的药害。氧代脂肪酸衍生物或其盐或者酯的浓度的下限没有特别限定，优选为0.012g/l以上。本发明中，优选氧代脂肪酸衍生物或其盐或者酯的浓度为0.012～0.12g/l。
50.本发明的植物活化剂中只要包含氧代脂肪酸衍生物或其盐或者酯即可，对其来源等没有特别限定。本发明的13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸等的氧代脂肪酸衍生物或其盐或者酯可以通过例如化学合成获得，另外也可以使用例如微生物来制造，或者使微生物来源的酶作用于脂肪酸等底物而获得等。特别是，13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸由于脂溶性强，因此实用上添加盐使其为碱性而赋予水溶性在操作上是容易的。作为所使用的盐，通常为铵盐、金属盐，作为金属盐，优选生成一价金属离子的金属盐，其中特别优选锂盐、钠盐、钾盐。本发明的植物活化剂只要包含所期望的浓度的氧代脂肪酸衍生物即可，例如作为氧代脂肪酸衍生物，使用利用微生物制造的13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸的情况下，含有13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸的混合物可以用于植物活化剂。在混合物中包含由微生物分泌的生
物表面活性剂的情况下，即使不含有上述的添加成分，也有可能提高本发明的植物活化剂的分散性。氧代脂肪酸衍生物自身为不溶性的情况下，有时可以利用生物表面活性剂进行乳化而使其分散于水中。
51.本发明的植物活化剂能够利用任意的方法施用于植物。例如，能够用作与植物的叶茎或根接触的喷雾剂或者浸渍用药剂、或者土壤灌注用药剂。在所施用的植物中，本发明的植物活化剂通过水杨酸途径对植物诱导系统抗性，抑制植物病害。此外，例如13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸等由于为天然存在的脂肪酸氧化物，因此本发明的植物活化剂的环境负担低，并且对所施用的植物基本上没有药害，从这方面出发，本发明的植物活化剂也是优异的。
52.能够施用本发明的植物活化剂的植物没有特别限定，能够对植物普遍良好地使用，例如可以举出十字花科的植物。
53.实施例
54.基于实施例对本发明进行说明，但本发明不仅限定于实施例。
55.实施例1抗性基因表达的评价
56.作为实施例1，制备了包含0.012％的13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸的0.15％碳酸氢二钾水溶液。需要说明的是，作为13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸，使用(9z,11e)
‑
13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸(13
‑
oxooda、cayman chemical公司制造)。作为比较例，分别制备了分别包含0.012％的作为脂肪酸类似物质的13
‑
hpode((9z,11e)
‑
13
‑
氢过氧化
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸、cayman chemical公司制造)、9
‑
hpode((10z,12e)
‑9‑
氢过氧化
‑
10,12
‑
十八碳二烯酸、cayman chemical公司制造)、9
‑
hpote((10e,12z,15z)
‑9‑
氢过氧化
‑
10,12,15
‑
十八碳三烯酸、cayman chemical公司制造)、9
‑
hote((10e,12z,15z)
‑9‑
羟基
‑
10,12,15
‑
十八碳三烯酸、cayman chemical公司制造)、13
‑
hpote((9z,11e,15z)
‑
13
‑
氢过氧化
‑
9,11,15
‑
十八碳三烯酸、cayman chemical公司制造)、13
‑
hote((9z,11e,15z)
‑
13
‑
羟基
‑
9,11,15
‑
十八碳三烯酸、cayman chemical公司制造)和12
‑
opda(12
‑
氧代
‑
植物二烯酸、cayman chemical公司制造)、以及0.012％的α
‑
酮醇脂肪酸的0.15％碳酸氢二钾水溶液。需要说明的是，α
‑
酮醇脂肪酸水溶液利用下述合成手段合成。
57.将大豆来源的脂肪氧化酶(sigma
‑
aldrich公司制造)10mg加入到由亚油酸1g、磷酸二氢钾0.15g和蒸馏水100ml构成的亚油酸悬浮液中，搅拌1昼夜，生成过氧化脂质1。需要说明的是，过氧化脂质的生成通过基于tlc(展开溶剂氯仿：乙醇＝20：1、硫酸显色)的与标准物质的比较以及od234nm的提高来确认。另外，通过nmr确认到过氧化脂质1的主要成分为13hpode((9z,11e)
‑
13
‑
(氢过氧化)
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸)。
58.在所得到的过氧化物质1中加入丙二烯氧化物合酶(sigma
‑
aldrich公司制造)0.1mg，搅拌1昼夜，由此得到碳原子数为18的α
‑
酮醇脂肪酸。之后，在冰冷却下添加稀盐酸，使反应液的ph为3.0，由此使酶反应停止。之后将ph调整为6.5，制成α
‑
酮醇脂肪酸水溶液。
59.将实施例1中得到的水溶液仅对土耕栽培的拟南芥的根(地下部)进行灌注处理。在处理后24小时后，从利用水溶液进行了处理的拟南芥和作为对照的无处理的拟南芥提取rna，由rna制备cdna，利用实时pcr研究抗性基因pr1、pr2和pdf1.2的表达量。需要说明的是，基因表达量利用管家基因的表达量进行了标准化。结果示于图1(实施例1)中。
60.由图1可知，13
‑
oxooda与其他物质相比能够显著地表达掌管对于病原菌的抗性的
基因pr1和pr2(水杨酸代谢系统)。另一方面，12
‑
opda与其他物质相比表达了掌管对于害虫的抗性的基因pdf1.2(茉莉酮酸代谢系统)。
61.实施例3抗性基因表达中的合用效果
62.制备了0.15％碳酸氢二钾水溶液，其分别包含0.012％的(9z,11e)
‑
13
‑
氧代
‑
9,11
‑
十八碳二烯酸(13
‑
oxooda、cayman chemical公司制造)和作为脂肪酸类似物质的12
‑
opda(12
‑
氧代
‑
植物二烯酸、cayman chemical公司制造)。
63.使用所制备的水溶液，与实施例1同样地对拟南芥进行处理，提取rna，由rna制备cdna。与实施例1同样地调查抗性基因pr1、pr2和pdf1.2的表达量。结果示于图1(实施例3)中。
64.混合了13
‑
oxooda和12
‑
opda两者的组合物能够同时表达pr1和pdf1.2。推测混合了两者的组合物能够互补地活化水杨酸代谢系统和茉莉酮酸代谢系统。需要说明的是，在实施例1、3中评价的一系列水溶液中，为了增加13
‑
oxooda与12
‑
opda的水溶性而添加钾盐进行了试验，由此可知一部分组成作为它们的钾盐存在。
65.由上述结果可知，本发明的植物活化剂是土壤污染和毒性低、抗性诱导效果优异的植物活化剂。