布瓦西坦药物中杂质L-2-氨基丁酰胺盐酸盐含量的检测方法与流程

布瓦西坦药物中杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐含量的检测方法
技术领域
1.本发明涉及布瓦西坦杂质的检测方法，具体涉及布瓦西坦药物中杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐含量的检测方法，属于医药技术领域。


背景技术：

2.2016年1月14日和2016年2月18日欧洲医药管理局(ema)和美国食品药品管理局(fda)分别于批准了比利时μcb公司开发的第三代抗癫痫药物—布瓦西坦(brivaracetam，简称brv)，商品名为用于治疗16岁及以上部分发作型的癫痫患者，辅助治疗伴随或不伴随继发全身性发作。2017年fda已经批准了布瓦西坦的补充新药申请，该药物将可以作为16岁以上癫痫患者局部(局灶性)发作的单一疗法。布瓦西坦具有高度亲和力，可选择性地结合突触囊泡蛋白2a(sv2a)，sv2a位于突触前膜，参与调解神经递质的释放和囊泡循环进而维持着突触囊泡的正常功能。aed与sv2a结合可减少兴奋性神经递质的释放，并通过调节脑内兴奋性递质和抑制性递质的平衡达到控制癫痫发作的效果。布瓦西坦的亲和力是左乙拉西坦的15-30倍，使其使用剂量降低约10倍。布瓦西坦结构式如下：
[0003][0004]
l-2-氨基丁酰胺盐酸盐是合成布瓦西坦原料药的关键中间体，在布瓦西坦合成过程中中作为反应原料使用，如其反应不完全，少许l-2-氨基丁酰胺盐酸盐则会作为杂质存在于布瓦西坦原料药中。研究发现，该杂质可导致临床患者服用布瓦西坦制剂后产生不良反应，影响布瓦西坦制剂的治疗效果。因此，在布瓦西坦药物中严格控制l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量是非常重要的。l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的结构式如下：
[0005][0006]
目前尚未见如何在布瓦西坦药物中控制l-2-氨基丁酰胺盐酸盐含量的报道。


技术实现要素：

[0007]
为了有效控制布瓦西坦药物的质量，减少布瓦西坦药物中杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量，本发明提供了一种检测布瓦西坦中杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐含量的方法。
[0008]
本发明提供了一种布瓦西坦中杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，具体步骤如下：
[0009]
(1)供试品溶液的制备：称取待测布瓦西坦，加流动相溶解，即得；
[0010]
(2)对照品溶液的制备：称取l-2-氨基丁酰胺盐酸盐，加流动相溶解，即得；
[0011]
(3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：
[0012]
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
[0013]
流动相：由a相和b相组成，a相为辛烷磺酸钠溶液，b相为乙腈。
[0014]
进一步地，步骤(3)中，所述a相和b相的体积比为(70～90)：(10～30)；
[0015]
和/或，所述辛烷磺酸钠溶液的浓度为0.005～0.02mol/l，ph为2.0～4.0。
[0016]
进一步地，步骤(3)中，所述a相和b相的体积比为80：20；
[0017]
和/或，所述辛烷磺酸钠溶液的浓度为0.02mol/l，ph为3.0。
[0018]
进一步地，步骤(3)中，所述十八烷基硅烷键合硅胶为inertsil ods-3。
[0019]
进一步地，所述步骤(3)的检测波长为205～220nm，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为20～40℃；
[0020]
优选的，所述步骤(3)的检测波长为210nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。
[0021]
进一步地，所述步骤(3)的进样体积为10～30μl，优选为20μl。
[0022]
进一步地，步骤(1)中，所述供试品溶液中，待测布瓦西坦的浓度为0.5～2.0mg/ml，优选为1.0mg/ml。
[0023]
进一步地，步骤(2)中，所述对照品溶液中，l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的浓度为0.083μg/ml以上，优选为0.2～2.0μg/ml，更优选为1.0μg/ml。
[0024]
进一步地，步骤(2)中，所述对照品溶液的制备方法为：称取l-2-氨基丁酰胺盐酸盐，加流动相溶解得到对照品储备液，再向对照品储备液中加流动相稀释，即得；所述对照品储备液中，l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的浓度为50～200μg/ml，优选为100μg/ml。
[0025]
进一步地，所述待测布瓦西坦中杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐含量的计算方法为：根据所得高效液相色谱谱图，利用外标法计算待测布瓦西坦中l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量；计算公式如下：
[0026]
l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量＝(au/as)
×
(cs/cu)
×
(m1/m2)
×
100％，
[0027]
au：供试品溶液所得谱图中l-2-氨基丁酰胺的峰面积，
[0028]
as：对照品溶液所得谱图中l-2-氨基丁酰胺峰面积，
[0029]
cs：对照品溶液中l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的浓度，
[0030]
cu：供试品溶液中待测布瓦西坦的浓度，
[0031]
m1：l-2-氨基丁酰胺的分子量，
[0032]
m2：l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的分子量。
[0033]
inertsil ods-3为一种十八烷基硅烷键合硅胶。
[0034]
利用本发明的检测方法可以准确测定布瓦西坦药物中杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量，并将布瓦西坦药物中的布瓦西坦与杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的色谱峰有效分离，从而有效控制布瓦西坦药物中杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量，提高布瓦西坦药物中活性成分布瓦西坦的纯度，提高布瓦西坦药物的质量。
[0035]
本发明的测定结果稳定可靠，专属性强。方法学验证结果表明，本发明的检测方法符合《中国药典》2015年版对分析方法学的要求。本发明的检测方法具有良好的专属性，精密度，准确度和灵敏度，在提高布瓦西坦药物及药物制剂的质量中具有广阔的应用前景。
[0036]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0037]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0038]
图1为实施例1系统适用性溶液的hplc图谱。
[0039]
图2为实施例1对照品溶液的hplc图谱。
[0040]
图3为实施例1供试品溶液的hplc图谱。
具体实施方式
[0041]
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0042]
(1)主要材料
[0043]
布瓦西坦样品：成都惟邦药业有限公司提供，批号200301，200302。
[0044]
布瓦西坦对照品：成都惟邦药业有限公司提供，批号200301ws。
[0045]
l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品：阿拉丁，批号c1307130。
[0046]
(2)主要仪器
[0047]
高效液相色谱(hplc)仪：岛津lc-20at。
[0048]
色谱柱：以inertsil ods-3为填充剂，规格4.6
×
250mm，5μm。
[0049]
实施例1检测布瓦西坦样品中杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量的方法
[0050]
(1)供试品溶液的制备：精密称取布瓦西坦样品(批号200301)25.30mg，置于25ml容量瓶中，加流动相溶解，定容，配制成1.012mg/ml浓度的布瓦西坦供试品溶液。
[0051]
(2)对照品溶液的制备：精密称取l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品10.40mg，置于100ml容量瓶中，加流动相溶解，制备成浓度104μg/ml的l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品储备液；然后精密量取1ml的l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品储备液，置于100ml容量瓶中，以流动相稀释，制成浓度为1.04μg/ml的对照品溶液。
[0052]
(3)系统适用性溶液的制备：精密称取布瓦西坦对照品10.05mg，置于10ml容量瓶中，再精密加入l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品储备液0.1ml，用流动相溶解，定容，配置成浓度1.005mg/ml布瓦西坦对照品和浓度为1.04μg/ml的l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品混合溶液，作为系统适用性溶液。
[0053]
(4)分别吸取供试品溶液、对照品溶液和系统适用性溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
[0054]
色谱条件如下：
[0055]
色谱柱：以inertsil ods-3为填充剂。
[0056]
流动相：a为0.01mol/l辛烷磺酸钠溶液(ph3.0)，b为乙腈；a：b体积比＝80：20。
[0057]
检测波长：210nm。
[0058]
流速：1.0ml/min。
[0059]
柱温：30℃。
[0060]
(5)计算：分别确定色谱图中对照品溶液和供试品溶液中l-2-氨基丁酰胺峰面积，按外标法计算供试品布瓦西坦中杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量，计算公式为：
[0061]
l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量％＝(au/as)
×
(cs/cu)
×
(m1/m2)
×
100％
[0062]
au：供试品溶液中l-2-氨基丁酰胺峰面积，为7680
[0063]
as：对照品溶液中l-2-氨基丁酰胺峰面积，为17082
[0064]
cs：对照品溶液中l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的浓度，为1.04μg/ml
[0065]
cu：供试品溶液中布瓦西坦的浓度，为1.012mg/ml
[0066]
m1：l-2-氨基丁酰胺的分子量，为102.1
[0067]
m2：l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的分子量，为138.6
[0068]
计算结果：布瓦西坦样品中(批号200301)杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量为0.03％。
[0069]
本实施例系统适用性溶液的hplc分离度情况见下表1。
[0070]
表1系统适用性溶液的hplc分离度数据
[0071][0072]
分离度为33.24，远大于2.0，符合中国药典规定的分析要求。
[0073]
实施例2检测布瓦西坦样品中杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量的方法
[0074]
(1)供试品溶液的制备：精密称取布瓦西坦样品(批号200302)25.40mg，置于25ml容量瓶中，加流动相溶解，定容，配置成1.016mg/ml浓度的布瓦西坦供试品溶液。
[0075]
(2)对照品溶液的制备：精密称取l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品10.10mg，置于100ml容量瓶中，加流动相溶解，制备成浓度101μg/ml的l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品储备液；然后精密量取1ml的l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品储备液，置于100ml容量瓶中，以流动相稀释，制成浓度为1.01μg/ml的对照品溶液。
[0076]
(3)系统适用性溶液的制备：精密称取布瓦西坦对照品10.23mg，置于10ml容量瓶中，再精密加入l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品储备液0.1ml，用流动相溶解，定容，配制成浓度1mg/ml布瓦西坦对照品和浓度为1.01μg/ml的l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品混合溶液，作为系统适用性溶液。
[0077]
(4)分别吸取供试品溶液、对照品溶液和系统适用性溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
[0078]
色谱条件如下：
[0079]
色谱柱：以inertsil ods-3为填充剂；
[0080]
流动相：a为0.02mol/l辛烷磺酸钠溶液(ph3.5)，b为乙腈；a：b体积比＝80：20。
[0081]
检测波长：210nm。
[0082]
流速：1.2ml/min。
[0083]
柱温：35℃。
[0084]
(5)计算：分别确定色谱图中对照品溶液和供试品溶液中l-2-氨基丁酰胺峰面积，按外标法计算供试品布瓦西坦中杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量，计算公式为：
[0085]
l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量％＝(au/as)
×
(cs/cu)
×
(m1/m2)
×
100％
[0086]
au：供试品溶液中l-2-氨基丁酰胺峰面积，为0
[0087]
as：对照品溶液中l-2-氨基丁酰胺峰面积，为17522
[0088]
cs：对照品溶液中l-2-氨基丁酰胺盐酸的浓度，1.01μg/ml
[0089]
cu：供试品溶液中布瓦西坦的浓度1.016mg/ml
[0090]
m1：l-2-氨基丁酰胺的分子量102.1
[0091]
m2：l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的分子量138.6
[0092]
计算结果：布瓦西坦样品中(批号200302)杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量为未检出。
[0093]
本实施例系统适用性溶液的hplc分离度情况见下表2。
[0094]
表2系统适应性溶液的hplc分离度数据
[0095][0096]
分离度为28.46，远大于2.0，符合中国药典规定的分析要求。
[0097]
以下通过实验例的方式进一步说明本发明的有益效果。
[0098]
本发明的以下实验得到了宜宾市科技局“2019年宜宾市引进高层次人才项目”(项目编号：2019yg03)的支持。
[0099]
实验例1系统适用性评价
[0100]
1.溶液配制
[0101]
(1)l-2-氨基丁酰胺盐酸盐储备液：精密称定l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品10.40mg至100ml容量瓶，加流动相溶解并稀释至刻度；
[0102]
(2)系统适用性溶液:：精密称取布瓦西坦对照品10.64mg于10ml量瓶中，精密加入l-2-氨基丁酰胺盐酸盐储备液0.1ml，加流动相稀释至刻度，即得。
[0103]
2.检测：
[0104]
取系统适用性溶液20μl，按照实施例1的色谱条件，注入高效液相色谱仪，进样6针，考察保留时间和峰面积的相对标准偏差(rsd)，结果见表3。
[0105]
色谱条件如下：
[0106]
色谱柱：以inertsil ods-3为填充剂。
[0107]
流动相：a为0.01mol/l辛烷磺酸钠溶液(ph3.0)，b为乙腈；a：b体积比＝80：20。
[0108]
检测波长：210nm。
[0109]
流速：1.0ml/min。
[0110]
柱温：30℃。
[0111]
表3系统适用性溶液测试结果汇总
[0112][0113]
可以看出，系统适用性溶液的hplc分离度为32.86～33.89，远大于2.0，符合中国药典规定的分析要求。
[0114]
实验例2专属性实验
[0115]
(1)实验方法：
[0116]
精密称取布瓦西坦样品(批号200301)10.12mg,10.68mg,10.22mg分别置于三个10ml量瓶中，再分别加入1mol/l盐酸溶液、1mol/l氢氧化钠溶液、3％过氧化氢溶液各1ml，依次得到酸破坏样品、碱破坏样品、氧化样品，室温下放置2h，然后分别将酸破坏样品、碱破坏样品中和。将中和后的酸破坏样品、碱破坏样品，以及氧化样品分别加流动相稀释至刻度，摇匀。按照实验例1的色谱条件，分别进样，记录色谱图。
[0117]
(2)实验结果：
[0118]
各色谱图的主峰与各相邻峰间的分离度大于1.5％；主峰纯度阈值小于纯度相似度，符合要求。
[0119]
实验例3检测限和定量限测试
[0120]
(1)实验方法：
[0121]
精密称取l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品，加流动相稀释制成10.4μg/ml的母液，再逐级稀释成不同梯度浓度的对照品溶液，按照实验例1的色谱条件，进行定量限和检测限测定。检测信噪比s/n≥10确定为定量限，s/n约为3确定为检测限。测试结果见表4。
[0122]
(2)实验结果：
[0123]
表4定量限和检测限
[0124][0125]
l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的定量限浓度为0.208μg/ml，相当于样品浓度的0.02％
(＜0.05％)，检测限为0.083μg/ml,相当于样品浓度的0.008％。
[0126]
实验例4线性和范围分析
[0127]
(1)实验方法：
[0128]
按照实验例1的色谱条件，在定量限浓度至不低于150％指标浓度范围内取6个点进行测试。线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物(即l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品)浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，线性回归系数r2来证实良好的线性关系,要求该线性回归系数r2应不小于0.990。结果见表5。
[0129]
(2)实验结果：
[0130]
表5线性与范围测定结果
[0131][0132][0133]
可以看出，利用本发明的色谱条件检测l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品的线性范围为0.208～2.080μg/ml，线性方程为y＝16984x 406，线性回归系数r2＝0.9989，符合良好线性关系的要求(r2＞0.990)。
[0134]
实验例5精密度测试
[0135]
(1)实验方法：
[0136]
精密称取l-2-氨基丁酰胺盐酸盐对照品(批号c1307130)，加流动相制成1.0μg/ml的对照品溶液，另称取供试品(即布瓦西坦样品(批号200301))，加流动相制成1.0mg/ml的供试品溶液，平行配制6份，按照实验例1的色谱条件，依次进样，重复性测试结果见表6。
[0137]
(2)实验结果：
[0138]
表6重复性
[0139][0140]
可以看出，6份供试品溶液峰面积的rsd为7.44％，符合要求(rsd＜15％)。说明本发明的检测方法精密度高。
[0141]
实验例6准确度测试
[0142]
(1)实验方法：
[0143]
通过在供试品(即布瓦西坦样品(批号200301))溶液中加入三个不同浓度的杂质(即l-2-氨基丁酰胺盐酸盐)溶液(杂质溶液的浓度分别为标准溶液浓度的80％，100％，120％)，得到加标样品，再按照实验例1的色谱条件，测定加标样品中杂质的含量；计算回收率。回收率＝测得的加标样品中杂质的含量/加标样品中杂质的理论含量，以百分率％表示。结果见表7。
[0144]
标准溶液：1.040μg/ml的l-2-氨基丁酰胺盐酸盐。
[0145]
(2)实验结果：
[0146]
表7准确度
[0147][0148]
可以看出，l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的回收率在87.67％～98.82％之间，符合要求(回收率：80.0％～120.0％)。说明本发明的检测方法准确度良好。
[0149]
实验例1～6的研究结果表明，本发明的检测方法具有良好的专属性，精密度，准确度和灵敏度。
[0150]
综上，利用本发明的检测方法可以准确测定布瓦西坦药物中杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量，并将布瓦西坦药物中的布瓦西坦与杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的色谱峰有
效分离，从而有效控制布瓦西坦药物中杂质l-2-氨基丁酰胺盐酸盐的含量，提高布瓦西坦药物中活性成分布瓦西坦的纯度，提高布瓦西坦药物的质量，应用前景广阔。