检测尿液中癌胚硫酸软骨素的制剂在制备诊断泌尿系统恶性肿瘤的制剂、试剂盒中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种通过检测尿液中一种特异的糖胺聚糖亚型来快速的诊断泌尿系统的恶性肿瘤的方法和应用。


背景技术：

2.硫酸软骨素(cs)是一类糖胺聚糖，其与特定蛋白多糖(cspg)相连在细胞膜上，或分泌到细胞外基质和体液。cs链包括由重复n
‑
乙酰
‑
d
‑
半乳糖胺 (galnac)和葡萄糖醛酸(glca)组成的线性多糖双糖单位，长度变化很大。
3.尿中gag的成分的检测作为检测包括卵巢癌和肾透明细胞癌在内的癌症的生物标志物。目前，有几种方法已被开发用于检测人体内的尿液来诊断膀胱癌包括阳离子染料沉淀、电泳、elisa检测gag，但结果仍然不尽如意。原因包括是缺乏适当的方法来检测特定癌症相关gag亚型。对尿液样本进行癌症特异性 gag分析仍然是一个难题技术挑战。主要存下以下问题：
4.1)、缺乏一个特异性的与癌症相关的gag亚型来精确的诊断泌尿系统的恶性肿瘤包括膀胱癌和肾癌；
5.2)、检测技术复杂象阳离子染料沉淀、电泳等，步骤多，影响结果的变量较多；
6.3)、现有的方法没有办法进行自动化操作；
7.4)、现有的方法不适用于大规模的样本检测，因此，不能用于肿瘤的早筛。


技术实现要素：

8.本发明要解决的技术问题是克服现有技术中对尿液样本进行癌症特异性 gag分析时缺少特异性标记物的缺陷，提供一种检测尿液中特异的糖胺聚糖亚型来快速的诊断泌尿系统的恶性肿瘤。
9.为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
10.检测尿液中癌胚硫酸软骨素的制剂在制备诊断泌尿系统恶性肿瘤的制剂、试剂盒中的应用。可单独检测患者尿中ofcs的含量(微克/毫升)作为指标来诊断膀胱癌；也可以同时检测患者的尿中肌酐，以ofcs/肌酐的比值作为指标来诊断膀胱癌。
11.进一步的，尿液中癌胚硫酸软骨素很小一部分是游离的，大部分都是与特定的蛋白多糖(proteoglycan,pg)结合在一起，组成ofcspg。本发明所述的检测包含对单独的ofcs和对结合物ofcspg的检测。在泌尿系统恶性肿瘤的发生发展过程中，ofcs可能会发生各种自身的修饰化改变。任何技术针对修饰化的检测用在泌尿系统恶性肿瘤的诊断都是本专利的保护范围。
12.进一步的，所述的泌尿系统恶性肿瘤为膀胱癌和肾癌。
13.本发明所达到的有益效果是：本发明可以于肿瘤的早筛，特异性的检测尿液中与泌尿系统恶性肿瘤相关的标记物，检测的特异性比现有的技术都要高，可以采用化学发光
法、酶联免疫吸附法和荧光法等方法进行检测，快速，适合自动化检测，应用于大规模的样本检测。
附图说明
14.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
15.图1是健康对照组和膀胱癌组患者尿液中的ofcs/肌酐值。
具体实施方式
16.以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
17.实施例
18.检测尿液中癌胚硫酸软骨素的制剂在制备诊断泌尿系统恶性肿瘤的制剂、试剂盒中的应用。
19.i、检测方法
20.标准品与标准曲线的构建：decorin作为标准品，构建一个标准品的浓度曲线。decorin，核心蛋白聚糖是由一个36kda的蛋白核心和一个单一的硫酸软骨素或硫酸皮肤素的糖胺聚糖链组成，可以与rvar2【var2csa蛋白】结合。
21.一、化学发光法(chemiluminescence)
22.化学发光法的载体可以是elisa 96孔培养板和膜。膜以硝化纤维膜 (nitrocellulose membrane)和聚偏二氟乙烯膜(pvdf膜)为常见。其它类似材料的膜也可以。膜的化学发光主要是酶促化学发光。
23.1、96
‑
孔培养板包被一定量的尿液上清液，清洗后分别有三种不同处理的步骤：
24.2、加入hrp
‑
链接的rvar2，反应后清洗；加入底物a、b液；化学发光仪读数。
25.3、加入rvar2，反应后清洗；加入hrp
‑
抗var2的抗体，反应后清洗；加入底物a、b液；化学发光仪读数。
26.4、加入生物素(biotin)标记的rvar2，反应后清洗；加入 streptavidin
‑
hrp，反应后清洗；加入底物a、b液；化学发光仪读数。
27.2.膜打印一定量的尿液上清液，清洗后分别有三种不同处理的步骤：
28.1)加入hrp
‑
链接的rvar2，反应后清洗；加入底物a、b液；化学发光扫描仪扫描读数。
29.2)加入rvar2，反应后清洗；加入hrp
‑
抗var2的抗体，反应后清洗；加入底物a、b液；化学发光扫描仪扫描读数。
30.3)加入生物素(biotin)标记的rvar2，反应后清洗；加入 streptavidin
‑
hrp，反应后清洗；加入底物a、b液；化学发光扫描仪扫描读数。
31.说明
32.1.反应的酶系统即可以用hrp(辣根过氧化酶)显色系统也可以用 alp(碱性磷酸酶)显色系统，以及其它的显色系统。
33.2.化学发光还有直接发光和电化学发光方法。每种方法又包含有不同载体内容。
基于这些方法开发的检测试剂均在我们的保护范围。
34.3.根据反应的温度条件(室温、37℃、4℃过夜)来调节反应的时间。
35.二、酶联免疫吸附法(elisa):比色法(colorimetric)
36.酶联免疫吸附法的载体是固定的表面如elisa 96
‑
孔培养板。
37.1、96
‑
孔培养板包被一定量的尿液上清液，清洗后分别有三种不同处理的步骤：
38.1)加入hrp
‑
链接的rvar2，反应后清洗；加入tmb反应底物，再加入终止液；酶标仪读数，记录od450值。
39.2)加入rvar2，反应后清洗；加入hrp
‑
抗var2的抗体，反应后清洗；加入tmb反应底物，再加入终止液；酶标仪读数，记录od450值。
40.3)加入生物素(biotin)标记的rvar2，反应后清洗；加入 streptavidin
‑
hrp，反应后清洗；加入tmb反应底物，再加入终止液；酶标仪读数，记录d450值。
41.说明
42.1.反应的酶系统即可以用hrp(辣根过氧化酶)显色系统也可以用 alp(碱性磷酸酶)显色系统，以及其它的显色系统。
43.2.根据反应的温度条件(室温、37℃、4℃过夜)来调节反应的时间。
44.三、荧光法(fluorescence)
45.荧光法的载体可以是玻片和elisa96
‑
孔培养板。以玻璃等硬性材料为载体的方法，样品的处理过程中需要特别的塑料框，把不同的位点区分开，防止样品之间的交叉感染。
46.1.玻片打印包被一定量的尿液上清液，清洗后分别有三种不同处理的步骤：
47.1)加入cy3
‑
链接的rvar2，反应后清洗；用荧光扫描仪扫描荧光信号并读数。
48.2)加入rvar2，反应后清洗；加入cy3
‑
抗var2的抗体，反应后清洗；用荧光扫描仪扫描荧光信号并读数。
49.3)加入生物素(biotin)标记的rvar2，反应后清洗；加入 streptavidin
‑
cy3，反应后清洗；用荧光扫描仪扫描荧光信号并读数。
50.2.培养板包被一定量的尿液上清液，清洗后分别有三种不同处理的步骤：
51.1)加入cy3
‑
链接的rvar2，反应后清洗；用荧光记录仪读取信号。
52.2)加入rvar2，反应后清洗；加入cy3
‑
抗var2的抗体，反应后清洗；用荧光记录仪读取信号。
53.3)加入生物素(biotin)标记的rvar2，反应后清洗；加入 streptavidin
‑
cy3，反应后清洗；用荧光记录仪读取信号。
54.说明
55.1.生物标记的荧光染料除掉cy3外，cy5,hex,fam,rox、fitc、tritc、 alexa fluor等。
56.2.根据反应的温度条件(室温、37℃、4℃过夜)来调节反应的时间。
57.以上列出是市场上比较常见的检测方法，本专利保护的范围不局限于以上的检测方法。
58.ii、数据处理
59.1.单独检测患者尿中ofcs的含量(微克/毫升)作为指标来诊断膀胱癌；
60.2.同时检测患者的尿中肌酐，以ofcs/肌酐的比值作为指标来诊断膀胱癌。
61.iii、加入举例说明
62.1.用化学发光法检测膀胱癌患者尿中的ofcs的值。
63.1)3000转/分低速离心膀胱癌患者(n＝35)和健康对照组(n＝35)人尿液5分钟，去掉细胞残渣，保留尿上清液；
64.2)取0.5ml的尿液上清液包被96孔的培养板，放入4℃冰箱中过夜； bovine decorin蛋白作为标准品，2倍稀释成7个浓度(20ug/ml,2x)，用作标准曲线的制备；
65.3)取出培养板，室温下平衡，再用1x pbs清洗培养孔。各孔分别加入 500～10000x稀释的hrp
‑
var2，室温下孵育45分钟；
66.4)清洗后，分别加入底物a、b液，化学发光仪读数；通过标准曲线计算出ofcs的值(ug/ml)；
67.5)同时，用化学发光法测定尿液中肌酐的浓度；
68.6)计算出ofcs/肌酐的比值。
69.图1为健康对照组和膀胱癌组患者尿液中的ofcs/肌酐值，其中n为健康对照组；1,2,3对应膀胱癌的不同分级。*:p＜0.05；**:p＜0.01；***:p ＜0.001。
70.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。