测定马应龙麝香痔疮膏中黄凡士林含量的方法与流程

1.本发明涉及一种中药成份的含量测定，具体的说是一种测定马应龙麝香痔疮膏中黄凡士林含量的方法。


背景技术：

2.由马应龙药业集团股份有限公司独家生产的软膏剂马应龙麝香痔疮膏是由人工麝香、人工牛黄、珍珠、煅炉甘石粉、硼砂、冰片、琥珀精制而成的纯中药制剂，为国家中药保护品种。除以上主要成分之外，其还含有辅料黄凡士林、羊毛脂等，为了保证产品功效，对成品软膏剂制备全过程从原辅料采购、验收入库、生产全过程到中间产品控制、成品检验测定等各环节必须进行严格的质量控制。目前对于马应龙麝香痔疮膏中的辅料黄凡士林仅对其原料进行检测，对于制剂中的黄凡士林没有进行含量控制。因此，为了更好的控制产品质量，根据《中国药典》2020版药品质量标准《分析方法验证指导原则》要求，对收载于中国药典一部的“马应龙麝香痔疮膏”的药品标准进行了提高研究。新的质量标准中增加了黄凡士林含量的测定，采用重量法建立制剂中黄凡士林含量的测定方法，并拟定含量限度。
3.因黄凡士林在处方中为辅料，无现成可借鉴的方法测定其含量。通过专利查询，发现104502291b专利公开了一种民用双基火药中凡士林含量的测定方法，依次包括以下步骤：将样品处理成片状；通过循环蒸发、冷凝提取剂充分润洗样品对样品进行提取；提取后的提取液直接蒸干提取剂得到提取物；加入过量四氢呋喃溶解提取物中凡士林并转移至容量瓶中并用四氢呋喃定容；准确移取溶液于另一容量瓶中，加入乙腈水溶液使凡士林析出并定容摇匀，测定该悬浊液的吸光度；测定的吸光度和标准曲线计算出凡士林的含量。该方案通过测定的吸光度和标准曲线计算出凡士林的含量。由于火药组分相对比较单纯，其中的黄凡士林比较容易分离出来，用紫外标准曲线法可以测出其中黄凡士林的含量。而马应龙麝香痔疮膏组分复杂，且辅料中与黄凡士林性质相似的辅料也一并存在，无法借鉴上述记载的方法来测定其中黄凡士林含量。
4.另一方面，黄凡士林系从石油中得到的多种烃的半固体混合物，因其成分复杂，每次生产所得的黄凡士林中的各组分含量均不一致。因此，用于马应龙麝香痔疮膏中黄凡士林含量的测定时，不能简单的通过配制对照品用于含量检测，常规的气相色谱法、液相色谱法均不能检测其含量。而对于复杂中药成分的马应龙麝香痔疮膏，采用其它提取方法也存在其他辅料干扰的情况。为此，必须利用产品中各组分的不同物理性质，将黄凡士林有效提取出来，用以含量测定。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种方法极为简单、精度和准确性高、可靠性好、干扰少的测定马应龙麝香痔疮膏中黄凡士林含量的方法。
6.本发明一种测定马应龙麝香痔疮膏中黄凡士林含量的方法，包括以下步骤：
7.(1)取马应龙麝香痔疮膏样品，加入乙醇水浴加热搅拌溶解，降温后过滤弃去滤
液，得残渣；
8.(2)用三氯甲烷多次洗涤所述残渣，合并残渣及洗液进行超声处理，使其中的黄凡士林溶解，冷却至室温用三氯甲烷定容后过滤，得过滤液；
9.(3)将过滤液水浴蒸干后置于烘箱中干燥、再冷却后称重即为测得的黄凡士林的重量，结合所述马应龙麝香痔疮膏样品的重量，可以换算得到马应龙麝香痔疮膏中黄凡士林的含量。
10.所述步骤1)中，水浴加热温度为98
～
100℃，搅拌时间为5分钟；降温温度为
‑
5℃冰箱中冷冻30分钟。所述马应龙麝香痔疮膏样品的取样量为4
‑
6g。
11.所述步骤2)中，超声处理的条件为：功率200w，频率53khz；超声10分钟。
12.所述步骤2)中，过滤方法为滤纸过滤。
13.所述步骤3)中，水浴蒸干的温度为98
‑
100℃，烘干温度为105℃，干燥时间为2.5小时，冷却时间为30min。
14.针对背景技术中存在的问题，考虑采用提取黄凡士林后称重的方法计算马应龙麝香痔疮膏中黄凡士林的含量，该方法看似简单，但由于马应龙麝香痔疮膏为中药组合物，存在成分复杂，有些成分与黄凡林具有类似性质，如羊毛脂等。在提取过程中，为了保证精度和准确性，既要尽可能的把黄凡士林提取出来，还要保证黄凡士林纯度高，无杂质干扰，这样才能满足称重法测定含量的准确性要求。对此，发明人对马应龙麝香痔疮膏的组分进行了深入分析，利用马应龙麝香痔疮膏中黄凡士林和其他组分在不同溶剂中溶解度不同的性质，先用乙醇与马应龙麝香痔疮膏混合后加热溶解，此时马应龙麝香痔疮膏中羊毛脂、二甲基亚砜、冰片、人工麝香会随之溶解进入乙醇溶液中，而黄凡士林不溶于热乙醇，在冷却后会存在残渣中。利用降温过滤的方式，会使得羊毛脂、二甲基亚砜、冰片、人工麝香这些组分被分离出来；进一步的，发明人利用黄凡士林溶于三氯甲烷，而其它组分如硼砂、煅炉甘石粉等不溶的特性，选用于三氯甲烷来多次洗涤物理滤渣，并且为了提高提取率，在多次洗涤后还合并了残渣及洗液进行超声处理，优选超声功率200w，频率53khz；超声时间10分钟，超声时间过短会使黄凡士林溶解不完全。在黄凡士林溶解后人产过滤掉残渣，取续滤液蒸干后，在105℃烘箱中干燥，可以去除残留溶剂及可能残存的冰片和二甲基亚砜等挥发性物质。
15.本发明测定方法极为简单，仅需要一次提取就能得到纯度高的黄凡士林，提取率高、杂质干扰少，具有准确性好、精度高、成本低、可靠性好的优点，可以满足对黄凡士林进行定量检测，使马应龙麝香痔疮膏的质量得到有效保障。
附图说明
16.图1为空白溶剂气相色谱图。
17.图2为黄凡士林对照品溶液气相色谱图。
18.图3为马应龙麝香痔疮膏样品溶液气相色谱图。
19.图4为不同取样量与黄凡士林含量线性图。
20.图5为马应龙麝香痔疮膏提取物溶液气相色谱图。
21.图6为阴性对照样品溶液气相色谱图。
具体实施方式
22.1、含量测定方法的确定
23.1.1气相色谱法测定马应龙麝香痔疮膏中黄凡士林含量
24.1.1.1提取及分析方法的初步建立
25.由于黄凡士林系从石油中得到的多种烃的半固体混合物，我们将黄凡士林对照品用环己烷稀释成约5mg/ml的溶液，将马应龙麝香痔疮膏样品用环己烷稀释成约6mg/ml的溶液。采取气相色谱法对黄凡士林对照品溶液和马应龙麝香痔疮膏样品溶液进行分析，色谱条件如下：
26.以5％苯基
‑
95％甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱(柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为1.0μm)；起始温度为35℃，以每分钟15℃的速率升温至320℃，维持40分钟；进样口温度为360℃；检测器温度为360℃的色谱条件，载气为氮气，进样体积1μl。
27.结果：参见图1
‑
图3，黄凡士林在15分钟至28分钟有s4～s18等15个特征吸收峰。初步确定以s4～s18等15个峰为主成分峰，以主成分峰面积之和来通过外标法计算马应龙麝香痔疮膏中黄凡士林含量。
28.1.1.2样品含量的检测
29.照气相色谱法测定。
30.色谱条件：以5％苯基
‑
95％甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱(柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为1.0μm)；起始温度为35℃，以每分钟15℃的速率升温至320℃，维持40分钟；进样口温度为360℃；检测器温度为360℃的色谱条件，载气为氮气。
31.校正因子测定：取黄凡士林对照品适量，精密称定，用环己烷稀释成5mg/ml的溶液。吸取1ul注入气相色谱仪，计算校正因子。
32.测定法：取马应龙麝香痔疮膏0.3g，精密称定，置烧杯中，用30ml环己烷超声溶解后倒入100ml容量瓶中，用环己烷洗涤3次，每次20ml，合并洗液至容量瓶中，冷至室温后定容至刻度，摇匀。吸取1ul注入气相色谱仪，测定，即得。
33.供试品批号：20110011、20110012、20120011
34.按照上述方法测定三批样品中黄凡士林含量结果如表1：
35.表1
36.批号201100112011001220120011含量95.5％85.3％107.5％
37.结果：测定结果与理论值(约77.99％)差别较大，该方法不能准确测定马应龙麝香痔疮膏中黄凡士林含量。
38.分析原因：第一，黄凡士林中的各组分的响应值和浓度并不呈正比关系，简单的通过面积相加计算含量的测定方法准确性不能满足检验要求；第二，所使用的对照品购自中国药品检定研究院的黄凡士林对照品，其仅供鉴别用，其各成分及具体含量未知。(备注：中国药品检定研究院尚无含量测定用黄凡士林对照品。)
39.1.2重量法测定黄凡士林含量
40.本发明实施例1：精密称取本品5.0g,加50ml乙醇，水浴加热温度为98～100℃，搅拌5分钟，置
‑
5℃冰箱中冷冻30min，滤纸过滤，弃去滤液。残渣用三氯甲烷洗涤，反复多次用三氯甲烷清洗滤纸上的残渣，合并残渣及洗液至50ml容量瓶中，超声(功率200w，频率
53khz)10分钟，使其中的黄凡士林完全溶解，冷至室温后用三氯甲烷定容至刻度。过滤，取续滤液25ml至已在105℃恒重的蒸发皿中，水浴(98～100℃)蒸干后，置105℃烘箱中干燥2.5小时，取出至干燥器中，冷却30分钟后迅速称重，计算得供试品中含有黄凡士林的含量。计算公式为：称重重量
×
2/样品重量
×
100％。
41.1.2.1提取次数对比例1：
42.热乙醇提取两次：分别取马应龙麝香痔疮膏2g(样1、样2)和4g(样3、样4),精密称定，加50ml乙醇，水浴加热搅拌5分钟，置
‑
5℃冰箱中冷冻30min,滤纸过滤，弃去滤液，残渣再加50ml乙醇，重复以上步骤，其它同实施例1。
43.含量百分比见表2：(理论上样品中黄凡士林的占比77.99％)
44.表2
45.样品号样1样2样3样4含量(％)64.4％51.8％72.0％56.3％
46.结果：从含量结果来看，提取一次比提取两次结果更好，并且取样量较大结果更接近理论值。
47.1.2.2取样量和干燥时间对比例1：
48.分别取马应龙麝香痔疮膏4g、5g、6g、7g,精密称定，加50ml乙醇，操作同例1，水浴蒸干后置105℃烘箱中分别干燥0.5小时、2.5小时、3.5小时，取出至干燥器中，冷却30分钟后迅速称重。
49.含量百分比见表3：(理论上样品中黄凡士林的占比77.99％)
50.表3
[0051][0052]
结果：从含量结果来看，干燥时间在2.5h和干燥时间在3.5h时，固形物含量几乎不变，从经济性角度考虑，采用干燥时间为2.5h。取样量为5g和6g，固形物结果相近，而且都接近理论值(理论上样品中黄凡士林的占比77.99％)。
[0053]
结论：取样量4
‑
6g，干燥时间2.5h以上。可较好的检测出黄凡士林的含量。
[0054]
1.2.3提取试剂对比例1：
[0055]
分别称取四份样品各5.0g，精密称定，选取三氯甲烷和环己烷对比作为提取试剂(每组两份样品)，加50ml乙醇，水浴加热搅拌5分钟，置
‑
5℃冰箱中冷冻30min，滤纸过滤，弃去滤液，三氯甲烷组残渣加三氯甲烷30ml超声溶解，环己烷组残渣加环己烷30ml超声溶解，超声条件及后续处理同例1。
[0056]
含量百分比见表4：(理论上样品中黄凡士林的占比77.99％)
[0057]
表4
[0058][0059]
结果：从含量结果来看，三氯甲烷组重复性及固形物含量值较环己烷组好。
[0060]
1.2.4过滤方式对比例1：
[0061]
分别称取四份样品各5.0g，精密称定，处理方法同实施例1。加三氯甲烷定容至刻度，每组两份样品分别采取(1)离心10min(3000转/分钟)，取上清液25ml；(2)用滤纸过滤；取续滤液25ml。两种不同过滤方式所得的溶液置于105℃恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后置105℃烘箱中干燥2.5小时，取出至干燥器中，冷却30分钟后迅速称重。
[0062]
含量百分比见表5：(理论上样品中黄凡士林的占比77.99％)
[0063]
表5
[0064][0065]
结果：从含量结果来看，滤纸过滤的含量值较离心组好。
[0066]
2、含量测定方法的验证
[0067]
2.1专属性试验
[0068]
供试品批号：190401
[0069]
阴性对照样品：羊毛脂阴性样、冰片阴性样、黄凡士林阴性样按照本发明实施例1的方法操作提取得到黄凡士林含量结果如表6：
[0070]
表6
[0071]
批号190401羊毛脂阴性样冰片阴性样黄凡士林阴性样含量78.4％80.8％81.8％0.8％
[0072]
结果：专属性试验中，羊毛脂阴性样品和冰片阴性样品检测结果与理论值基本一致，黄凡士林阴性样品中微有残留，但在线性范围内，可接受。
[0073]
2.2准确度试验(回收率试验)
[0074]
采用加样回收试验，精密称取已知含量的马应龙麝香痔疮膏(出口美国mhi)(批号：190401)6份，分别精密加入对照原料，按照本发明实施例1的方法操作提取到黄凡士林样品，计算样品中黄凡士林的回收率，结果见表7。
[0075]
表7
[0076][0077]
结果：6份100％浓度水平加标供试品溶液的回收率在95
‑
102％之间，回收率平均值为97.93％；rsd值为1.06％，小于1.5％，表明该方法准确。
[0078]
2.3精密度试验
[0079]
取同一批样品(批号190401)，按照本发明实施例1的方法操作，测定6份平行样品含量。计算6份平行样品中黄凡士林含量的rsd值，结果见表8。
[0080]
表8
[0081][0082]
结果：样品含量重复性的rsd为0.63％，本法重复性良好。
[0083]
2.4线性与范围
[0084]
2.4.1线性
[0085]
精密称取对照原料1g、2g、3g、4g、5g、6g，按照本发明实施例1的方法操作，最后置6个恒重蒸发皿中105℃干燥2.5h，即得6个不同含量的线性试验用对照原料。
[0086]
以测得黄凡士林含量与取样量进行线性回归方程，结果见表9：
[0087]
表9线性范围试验结果
[0088][0089]
结果：参见图4，黄凡士林的取样量与黄凡士林的质量的线性回归方程：y＝1.0333x
‑
0.2327，相关系数r2＝0.9999，n＝6。表明黄凡士林取样量在1.0148g～6.0131g范围内，线性关系良好。
[0090]
2.4.2范围
[0091]
取马应龙麝香痔疮膏(出口美国)10批，按照本发明实施例1的方法操作，分别测定黄凡士林含量，结果见表10：
[0092]
表10
[0093][0094]
《中国药典》2020版一部中，根据制法推算，产品中黄凡士林含量为77.99％，经由不同人员对10批产品分别按此方法检测马应龙麝香痔疮膏中黄凡士林的含量，均在74.6％
‑
79.5％之间，再考虑不同实验室之间的操作误差，特拟定马应龙麝香痔疮膏中黄凡士林的含量范围为70.2％
‑
85.8％。
[0095]
2.5采用气相色谱法对该方法的再次验证
[0096]
供试品批号：20120011
[0097]
阴性对照样品：马应龙麝香痔疮膏阴性样品(无黄凡士林)
[0098]
马应龙麝香痔疮膏提取物溶液：取供试品按照本发明实施例1的方法进行提取，取提取物0.25g，精密称定，置烧杯中，用30ml环己烷超声溶解后倒入100ml容量瓶中，用环己
烷洗涤3次，每次20ml，合并洗液至容量瓶中，冷至室温后定容至刻度，摇匀。
[0099]
阴性对照样品溶液：取马应龙麝香痔疮膏阴性样品(无黄凡士林)0.1g，精密称定，置烧杯中，用30ml环己烷超声溶解后倒入100ml容量瓶中，用环己烷洗涤3次，每次20ml，合并洗液至容量瓶中，冷至室温后定容至刻度，摇匀。
[0100]
对照品溶液：取黄凡士林对照品适量，精密称定，用环己烷稀释成5mg/ml的溶液。
[0101]
以5％苯基
‑
95％甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱(柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚度为1.0μm)；起始温度为35℃，以每分钟15℃的速率升温至320℃，维持40分钟；进样口温度为360℃；检测器温度为360℃的色谱条件，载气为氮气。
[0102]
分别吸取马应龙麝香痔疮膏提取物溶液、黄凡士林阴性样品溶液、对照品溶液各1μl，注入气相色谱仪检测。
[0103]
结果：马应龙麝香痔疮膏提取物溶液色谱图(图5)中色谱峰s4～s18等15个特征吸收峰与黄凡士林对照品溶液色谱图(图2)一致；马应龙麝香痔疮膏样品溶液色谱图(图3)与阴性对照样品溶液色谱图(图6)中均存在杂质峰s1～s3，马应龙麝香痔疮膏提取物溶液色谱图(图5)与黄凡士林对照品溶液色谱图(图2)无杂质峰s1～s3。说明该校正模板提取出的黄凡士林纯度高，无杂质干扰。