一种基于量值溯源的TSH多系统赋值方法与流程

一种基于量值溯源的tsh多系统赋值方法
技术领域
1.本发明涉及一种基于量值溯源的tsh多系统赋值方法，属于标准物质赋值领域。


背景技术：

2.促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,tsh)是腺垂体嗜碱性细胞分泌的一种糖蛋白类激素，由211个氨基酸组成，其分子结构由非共价的α、β亚基异二聚体组成，其中该激素发挥生物和免疫功能特异性的是β亚基，α亚基与黄体生成素(lh)、促卵泡激素(fsh)及人绒毛膜促性腺激素(hcg)的α亚基基本相同。tsh能促进t3(三碘甲腺原氨酸)及t4(甲状腺素)的分泌，同时又受t3及t4的负反馈，是判断甲状腺功能最敏感的指标，在甲状腺疾病治疗过程中，应密切监测该指标的水平。
3.tsh的免疫分析先后出现了放射免疫分析法(radioimmunoassay,ria)、免疫放射分析法(immunoradiometric assay,irma)、酶联吸附免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay,elisa)、化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay,clia)、电化学发光免疫分析法(electrochemiluminescence immunoassay,eclia)、时间分辨荧光免疫分析法(time
‑
resolved fluoroimmunoassay,trfia)和化学发光酶免疫分析法(chemiluminescence enzyme immunoassay,cleia)等的变化。tsh各厂商检测结果差异较大，有些低浓度的tsh检测值，贝克曼access 2高于西门子immulite 2000约20倍。最近的研究表明，tsh在正常浓度时，方法间差异较小，而在异常浓度时差异较大。国内马东红等人对6种tsh检测方法对比研究发现方法间存在不同程度的差异，并且发现放免法和免疫放射法与自动化检测系统的相关性差(r为0.38
‑
0.41)。
4.标准化的目的是使各实验室/厂商的检测结果准确并且达到一致。标准化工作的主要内容是通过高阶一级参考物质和/或参考测量程序(reference measurement procedure，rmp)溯源到国际单位制(si)，核心是量值溯源，即建立一个可靠的参考系统，通过这个系统将准确性转移到临床常规分析中去，从而使常规结果溯源到参考系统提供的准确性。tsh属于蛋白类检验项目，这类项目的检测原理多是免疫方法，没有公认rmp，若要使结果可比，只能采取一致化的方案。由于tsh检测项目有国际通用的标准物质，方便厂商和研究者使用。但只有互通性的参考物质才能充分发挥其作用。最近国际上关于erm 470的研究也证明了其中铜蓝蛋白缺乏互通性，并认为这是导致系统间检测结果不一致的原因之一，对tsh的研究也有相似的猜测。国内童清等人采用互通性的人血清酶学参考物质对北京市二级和三级医院的检测仪器进行校准，发现校准后实验室间检测结果的差异明显减小了。
5.鉴于世界卫生组织英国国家生物制品检定所tsh国际标准物质(whonibsc 81/565)是高浓度tsh冻干粉沫，各厂商在利用该标准物质进行溯源时必须进行一系列的多点稀释。早在2008年，blirup
‑
jensen等人就提出了稀释法对蛋白类检验项目赋值的研究方案。他们利用crm 470，将其值准确的转移到生产厂商的一级校准物和工作校准物或质控物，并以实例做了演示。对于血清基质之间的直接靶值转移，其方案是基于参考物质和目
标物质6点稀释的多个测量进行校准曲线拟合对参考物质赋值。转移方案需要每天做重复测量，持续几天。复融和稀释都通过称重来控制，以减少赋值(靶值转移)中的不确定度。在开放系统中，可以使用参考物质作为校准物，目标物质作为样品。两种物质(无论有无基质效应)的浓度比值通过单一回归图直接估计。如果没有基质效应，回归线将通过零点，其斜率等于两种物质浓度的比值。在封闭系统中，必须使用专用的商品化的校准物，参考物质和目标物质作为样品来分析。
6.目前没有人血清基质的tsh标准物质，由于国际标准物质价格昂贵，缺乏互换性，运输周期长，货源无法充足供应等原因，既不能用于室间质量评价机构的正确度验证，同时也不能满足我国日益增多的民族企业对tsh高阶标准物质的需要。所以研制人血清基质的tsh标准物质并进行科学的多系统赋值及其重要。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种基于量值溯源的tsh多系统赋值方法，采用tsh国际标准物质进行量值传递的方式对候选tsh标准物质进行赋值。
8.本发明中的“系统”包括用于定量检测tsh的仪器和所使用的试剂，如临床实验室tsh检测系统。
9.本发明所提供的基于量值溯源的tsh多系统赋值方法，包括采用tsh国际标准物质进行量值传递的方式对候选tsh标准物质进行赋值的步骤。
10.具体地，所述赋值方法包括如下步骤：
11.(a1)根据n个国内主流的tsh检测系统所需的样本3次检测量(毫升，ml)分别收集和分装不同tsh浓度的离体个体人血清，形成血清盘，n＝5～10；
12.所述离体个体人血清为外观澄清透明，除外黄疸、溶血、脂血及乳糜等异常性状的单个人血清；
13.(a2)采用不同的备选稀释液(又称基质)将tsh国际标准物质稀释成高中低的2～3个浓度系列，随机插入步骤(a1)中的血清盘，进行互换性研究；
14.所述tsh国际标准物质为who nibsc 81/565；
15.(a3)将在不同所述备选稀释液中的所述tsh国际标准物质进行互换性评价，筛选得到在所述tsh检测系统间均具有互换性的所述备选稀释液作为基质，然后进行下述步骤：
16.(a4)采用筛选得到的所述基质稀释所述tsh国际标准物质，得到系列不同浓度的所述tsh国际标准物质的标准系列溶液，并计算获得各个所述tsh国际标准物质的标准系列溶液中所述tsh国际标准物质的认证浓度；
17.(a5)采用所述tsh检测系统分别测定步骤(a4)中获得的各个所述稀释溶液中tsh国际标准物质的浓度；
18.(a6)对步骤(a4)和步骤(a5)得到的所述tsh国际标准物质的浓度进行线性拟合，得到tsh赋值标准曲线，即实现了对所述具有互换性的tsh候选标准物质的赋值。
19.上述的赋值方法中，步骤(a1)中，所述tsh检测系统包括西门子advia centaurxp、西门子immulite 2000、雅培architect i2000sr、贝克曼dxi 800、索灵liaison xl、利德曼ci 1000、罗氏cobas 601和安图autolumo a2000plus；
20.所述离体血清采用西门子advia centaurxp检测tsh初始浓度范围为0.09μiu/ml
～84.03μiu/ml。
21.上述的赋值方法中，步骤(a2)中，所述备选稀释液包括tsh 0μiu/ml混合人血清(hsp0)、含牛血清白蛋白(bsa)的hanks’平衡盐溶液(简称hanks液)、含bsa的杜氏磷酸盐缓冲液(简称dpbs)或含bsa的生理盐水。
[0022]“高中低”分别指高于参考区间上限，参考区间内和参考区间下限，浓度水平约为10倍关系，如高值为40μiu/ml，中值为4μiu/ml，低值为0.4μiu/ml；
[0023]
所述“互换性”，又称互通性(commutability)是参考物质的一个重要属性，指的是在不同的测量程序间，参考物质和一系列有代表性的样本检测值间有等同的数字关系。
[0024]
上述的赋值方法中，步骤(a3)中，所述互换性评价的判断标准为参考物质(包括不同所述标准系列溶液中tsh国际标准物质和tsh候选标准物质)在以两个所述tsh检测系统得到的个体血清tsh检测值绘制的deming回归线上下两条95％可信线范围内；
[0025]
筛选得到的所述稀释液为tsh 0μiu/ml混合人血清和含bsa的hanks’平衡盐溶液(简称hanks液)。
[0026]
上述的赋值方法中，步骤(a4)中，采用下述步骤获得所述稀释溶液中所述tsh国际标准物质的认证浓度：
[0027]
(a)测定tsh国际标准物质原液或较高浓度标准系列溶液和tsh国际标准物质的标准系列溶液的密度，分别记为ρ1和ρ2；
[0028]
(b)按照式(1)得到tsh国际标准物质的标准系列溶液tsh的认证浓度，记为c；
[0029][0030]
其中，c1表示tsh国际标准物质原液或较高浓度标准系列溶液tsh的浓度；m1表示所述tsh国际标准物质或较高浓度标准系列溶液的质量；ρ1表示所述tsh国际标准物质原液或较高浓度标准系列溶液密度；m2表示所述tsh国际标准物质的标准系列溶液中备选稀释液的质量；ρ2表示所述tsh国际标准物质的标准系列溶液的密度。
[0031]
其中，步骤(a)和(b)中，按照下述步骤测定所述tsh国际标准物质的标准系列溶液和所述tsh国际标准物质原液或较高浓度标准系列溶液的密度：
[0032]
(b1)称量容器和加样枪枪头的总质量，记为m1；
[0033]
(b2)采用所述加样枪枪头吸取体积为v的待测样本，然后置于所述容器中，并整体称重，记为m2；
[0034]
(b3)按照公式(2)计算所述待测样本的密度；
[0035]
ρ
待测
＝(m2‑
m1)/v
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)。
[0036]
由本发明赋值方法所研制得到的人血清来源的tsh候选标准物质，原料来源丰富。该候选标准物质经过多个检测系统联合赋值，采用国际标准物质who nibsc 81/565进行量值传递，有望用于临床实验室常规检测方法的校准或校准验证，以及为试剂厂家常规校准品的赋值，还可在常规检测系统的室间质量评价和正确度验证计划中发挥作用，提高和监测不同实验室、不同检测系统的tsh检测结果的准确性及一致性。
附图说明
[0037]
图1为多种基质稀释的tsh国际标准物质在多系统间的互换性(左侧为表2中的4种基质，右侧为其中赋值采用的2种基质)，其中具有互换性的判断标准为在以个体血清tsh检测值绘制的deming回归线上下两条95％可信线(虚线)范围内。
[0038]
图2为采用西门子advia centaurxp和两种基质稀释的tsh国际标准物质为不同浓度的tsh候选标准物质(l1
‑
l11)赋值曲线(左侧基质为tsh浓度为0μiu/ml的混合人血清，右侧基质为含牛血清白蛋白的hanks’平衡盐溶液(简称hanks液))。
[0039]
图3为采用利德曼ci 1000和两种基质稀释的tsh国际标准物质为不同浓度的tsh候选标准物质(l1
‑
l11)赋值曲线(左侧基质为tsh浓度为0μiu/ml的混合人血清，右侧基质为含牛血清白蛋白的hanks’平衡盐溶液(简称hanks液))。
[0040]
图4为采用罗氏cobas 601和两种基质稀释的tsh国际标准物质为不同浓度的tsh候选标准物质(l1
‑
l11)赋值曲线(左侧基质为tsh浓度为0μiu/ml的混合人血清，右侧基质为含牛血清白蛋白的hanks’平衡盐溶液(简称hanks液))。
[0041]
图5为采用迈克is 1200和两种基质稀释的tsh国际标准物质为不同浓度的tsh候选标准物质(l1
‑
l11)赋值曲线(左侧基质为tsh浓度为0μiu/ml的混合人血清，右侧基质为含牛血清白蛋白的hanks’平衡盐溶液(简称hanks液))。
[0042]
图6为采用新产业maglumi 2000plus和两种基质稀释的tsh国际标准物质为不同浓度的tsh候选标准物质(l1
‑
l11)赋值曲线(左侧基质为tsh浓度为0μiu/ml的混合人血清，右侧基质为含牛血清白蛋白的hanks’平衡盐溶液(简称hanks液))。
[0043]
图7为两种基质稀释的tsh国际标准物质在迈克is 1200和新产业maglumi 2000plus两系统间的互换性(采用混合人血清代替个体血清盘)。
具体实施方式
[0044]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046]
本发明所提供的基于量值溯源的tsh多系统赋值方法，采用tsh国际标准物质进行量值传递的方式对候选tsh标准物质进行赋值，具体包括如下步骤：
[0047]
(a1)从首都医科大学附属北京朝阳医院收集不同tsh浓度的29例患者检验完成后剩余血清(伦理批准件2018
‑2‑
26
‑
1)。每例样本的血清根据各厂家需求量被分成了8份，分别在8个不同系统(见表1)检测3次。样本外观无溶血、脂血和黄疸，采用西门子advia centaurxp免疫分析仪检测tsh的初始浓度范围从0.09μiu/ml到84.03μiu/ml。
[0048]
表1 tsh检测系统基本信息
[0049][0050]
amr,分析测量范围；rr,参考范围；ecl,电化学发光；cl,化学发光；cmia,化学发光微粒子免疫检测法.
[0051]
(a2)将所述tsh国际标准物质选择4种稀释液进行稀释成tsh浓度高中低的2
‑
3个浓度系列，随机插入(a1)中的血清盘，进行互换性研究。
[0052]
所谓的互换性，又称互通性(commutability)是参考物质(这里指被4种稀释液稀释成不同浓度的tsh国际标准物质，以下简称国际标准物质标准系列溶液，另外指tsh候选标准物质)的一个重要属性，指的是在不同的测量程序间，参考物质和一系列有代表性的样本间有等同的数字关系。具有互换性的判断标准为参考物质在以个体血清tsh检测值绘制的deming回归线上下两条95％可信线范围内，同时可以采用互换性相关的偏倚来度量，偏倚的绝对值越小，说明互换性越好。4种稀释液的配方见
[0053]
表2，互换性相关偏倚见表3，其计算公式如下。
[0054][0055]
其中，c
均值，其他
是指其他检测系统(评估方法)检测国际标准物质标准系列溶液得到的tsh浓度均值，c
均值，cen
是指西门子advia centaurxp(比较方法)检测国际标准物质标准系列溶液得到的tsh浓度均值，β和α分别指deming回归的斜率和截距。
[0056]
表2国际标准物质稀释液的基本信息
[0057][0058]
hsp0,tsh的浓度为0μiu/ml的混合人血清；bsa，牛血清白蛋白(sigma,b2064)其浓度为46g/l。
[0059]
(a3)将在不同稀释液中的国际标准物质进行互换性评价；选出两种(hsp0和含bsa的hanks’平衡盐溶液(简称hanks液))在多数系统间都具有互换性的基质进行下面的赋值实验(图1和表3)，采用advia centaurxp的赋值曲线见图2，左列和右列的赋值曲线斜率相差都较小。
[0060]
表3以advia centaurxp为对照系统国际标准物质在不同稀释液中的互换性相关
偏倚(％)
[0061][0062]
hsp0，tsh的浓度为0μiu/ml混合人血清；is，tsh国际标准物质；bsa，牛血清白蛋白；hanks’，hanks’平衡盐溶液(简称hanks液)；dpbs，杜氏磷酸盐缓冲液(简称dpbs)；n.s，生理盐水。
[0063]
(a4)将tsh国际标准物质采用hsp0和含bsa的hanks’平衡盐溶液(简称hanks液)进行稀释，得到tsh国际标准物质的标准系列溶液，计算获得各稀释溶液中tsh的认证浓度(表4和表6)，密度见表5和表7。
[0064]
获得系列不同浓度的tsh国际标准物质的稀释溶液中tsh的认证浓度，按照如下公式计算tsh国际标准物质的标准系列溶液中tsh的认证浓度：
[0065][0066]
其中，c1表示tsh国际标准物质原液或较高浓度标准系列溶液tsh的浓度；m1表示所述tsh国际标准物质或较高浓度标准系列溶液的质量；ρ1表示所述tsh国际标准物质原液或较高浓度标准系列溶液密度；m2表示tsh国际标准物质的标准系列溶液中备选稀释液的质量；ρ2表示tsh国际标准物质的标准系列溶液的密度。
[0067]
将tsh国际标准物质进行稀释采用的稀释液为混合人血清(hsp0)或含bsa的hanks’平衡盐溶液(简称hanks液)，所述血清和hanks液tsh浓度为0μiu/ml；hsp0的外观澄清透明，除外黄疸、溶血、脂血及乳糜等异常性状。
[0068]
tsh国际标准物质原液中tsh的浓度的获得方法为采用含牛血清白蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲液(pbs)溶液称重法稀释的tsh国际标准物质(who nibsc 81/565)，其浓度为1181.356μiu/ml。
[0069]
表4 tsh国际标准物质标准系列溶液浓度配制(所用稀释液为hsp0)
[0070][0071]
*表示加入的为较高浓度标准系列溶液13号标准系列，即为预期浓度为68μiu/ml的样本。
[0072]
表5 tsh国际标准物质标准系列溶液密度测定(所用稀释液为hsp0)
[0073][0074]
表6 tsh国际标准物质标准系列溶液浓度配制(所用稀释液为hank液)
[0075][0076]
*表示加入的为较高浓度标准系列溶液26号标准系列，即为预期浓度为68μiu/ml的样本。
[0077]
表7 tsh国际标准物质标准系列溶液密度测定(所用稀释液为hanks液)
[0078][0079]
(a5)采用8个tsh定量检测系统分别测定步骤(a4)中获得的各稀释溶液中tsh的浓度。
[0080]
(a6)针对8个tsh定量检测系统中的每个tsh定量检测系统，均采用步骤(a4)获得的各稀释溶液中tsh的认证浓度和步骤(a5)中获得的各稀释溶液中tsh的测定浓度进行线性拟合，得到tsh赋值标准曲线，从而为11个tsh候选标准物质进行赋值。
[0081]
为了说明国际标准物质互换性对于tsh候选标准物质赋值一致性的重要意义。采用表4中稀释系列(hsp0)的7个检测系统为advia centaurxp，immulite 2000，architect i2000sr，dxi800，liaison xl，ci 1000和cobas 601，采用表6中稀释系列(hanks液)5个检测系统包括advia centaurxp，dxi800，cobas 601，autolumo a2000和ci 1000)。从表8可以看出当ci 1000使用互换性差的hanks液(平均偏倚28.29％，又见图1中
ⅴ‑
2)稀释国际标准物质或当cobas 601使用互换性差的hsp0(平均偏倚
‑
19.51％，又见图1中
ⅵ‑
2)稀释时，两者差异较大。同时，使用互换性差的基质(即ci 1000使用hanks液，cobas 601使用hsp0)赋值时与互换性好的基质(即ci 1000使用hsp0，cobas 601使用hanks液)赋值的差异较大(见表8和表9)，另外，从图3和图4可见左列和右列的赋值曲线斜率相差都较大。最终采用了8个系统的10种检测方法进行了赋值，分别取其均值，作为靶值或称暂定值(见表9)。需要说明
的是，11个不同浓度的tsh候选标准物质(l1～l11)均具有互换性(图1左列)，这是候选标准物质的一个重要属性。另外，由于tsh候选标准物质浓度水平相差较大，所以l1～l2，l3～l4，l5～l7，l8～l10和l11分别采用不同的赋值曲线(见图2
‑
图4)，每个图的左右两侧从上到下的5个图分别对应l1～l2，l3～l4，l5～l7，l8～l10和l11。
[0082]
表8同一检测系统采用不同基质的赋值偏倚
[0083][0084]
l1～l2，l3～l4，l5～l7，l8～l10和l11分别采用不同的赋值曲线(见图3
‑
4)，每个图的左右两侧从上到下的5个图分别对应l1～l2，l3～l4，l5～l7，l8～l10和l11。
[0085]
表9 8个检测系统10种方法为tsh候选标准物质赋值(靶值)
[0086][0087]
(a7)为了验证hsp0和hanks液对tsh国际标准物质赋值的适用性以及扩大多系统赋值的范围，本发明又选择了迈克和新产业的两个检测系统(is 1200，maglumi2000plus，如表1)对tsh国际标准物质进行稀释以及对11个具有互换性的不同浓度水平的tsh候选标准物质赋值。以tsh国际标准物质的标准系列溶液，计算获得各稀释溶液中tsh的认证浓度(表10和表12)，计算方法同(a4)，密度见表11和表13。赋值方法同(a5)～(a6)。
[0088]
表10 tsh国际标准物质标准系列溶液浓度配制(hsp0)
[0089][0090]
*表示加入的为较高浓度标准系列溶液13号标准系列，即为预期浓度为60μiu/ml的样本。
[0091]
表11 tsh国际标准物质标准系列溶液密度测定(hsp0)
[0092][0093]
表12 tsh国际标准物质标准系列溶液浓度配制(hanks液)
[0094][0095]
*表示加入的为较高浓度标准系列26号标准系列，即为预期浓度为60μiu/ml的样本。
[0096]
表13 tsh国际标准物质标准系列溶液密度测定(hanks液)
[0097][0098]
(a8)两系统(maglumi 2000plus和is 1200)在两种基质(hsp0和hanks液)中为11水平候选标准物质的赋值结果及与表8中的靶值偏倚见表14虽然is 1200在使用hanks液稀释国际标准物质赋值平均偏倚为
‑
12.4％(
‑
14.5％～
‑
10.2％)，略大于11.73％，但赋值结果均未超出了3倍标准差(3sd)之外，赋值曲线斜率相差都较小(图5左列和右列)。所以，该方法纳入最后的赋值系统之中。maglumi 2000plus在使用hanks液稀释国际标准物质赋值时赋值曲线斜率相差都较大(图6左列和右列)，赋值偏倚较大，平均偏倚为
‑
38.3％(
‑
44.7％～
‑
31.8％)，大于基于生物学变异度导出的最低允许偏倚11.73％，且赋值结果均超出了3sd之外，主要原因是hanks液稀释国际标准物质在两系统间的互换性差(见图7)、基质效应大(表15)。
[0099][0100]
表15以is 1200为对照系统国际标准物质在hsp0和hanks液中的互换性相关偏倚(％)
[0101][0102]
hsp0，tsh浓度为0μiu/ml混合人血清；hanks液，hanks’平衡盐溶液。
[0103]
(a9)最终采用了10个检测系统的13种赋值方法为11水平的tsh候选标准物质赋值结果见表16，以3倍标准差(3sd)为离群值判断标准，没有剔除离群值。
[0104]
(a10)赋值过程中拟合的不确定度(u
ver
)计算公式如下：
[0105][0106][0107]
其中，s
r
为赋值曲线的标准差；a
j
为tsh检测浓度值；b0为赋值曲线截距；b1为赋值曲线斜率；ρ为认证的浓度；p为tsh候选标准物质测定次数，n为tsh国际标准物质总测量次数。
[0108]
(a11)候选标准物质扩展不确定度计算公式如下：
[0109]
(其中，k＝2，为扩展因子；u
ver
为标准曲线拟合过程及国际标准物质的不确定度；u
imp
为多系统赋值的标准差)
[0110]
(a12)最终的赋值结果为0.191μiu/ml～44.985μiu/ml扩展不确定度范围为0.039μiu/ml～3.523μiu/ml，见表17。
[0111][0112]
表17 tsh候选标准物质最终赋值
[0113][0114]
本发明采用tsh浓度为0μiu/ml的混合人血清和hanks液稀释国际有证标准物质who nibsc 81/565制作赋值曲线，采用10个检测系统13种方法为tsh候选标准物质赋值，赋值结果准确一致，为tsh的标准化和一致化工作提供新思路。
[0115]
由本发明研制的人血清来源的tsh候选标准物质，原料来源丰富。该候选标准物质经过多个检测系统联合赋值，采用tsh国际标准物质who nibsc 81/565进行量值传递，具有良好的互换性，有望用于临床实验室常规检测方法的校准或校准验证，以及为试剂厂家常规校准品赋值，还可在常规检测系统的室间质量评价和正确度验证计划中发挥作用，提高和监测不同实验室、不同检测系统的tsh检测结果的准确性及一致性。
[0116]
本发明可为推进北京地区乃至全国范围内tsh的临床检验质量、提高防病治病工作的有效性、节约和有效利用卫生资源提供必要的数据支持，将来可能产生一定的经济效益和社会效益。