一种高效复合微生物菌剂的制备方法与流程

1.本发明属于农业领域，涉及一种农业微生物制剂，具体来说是一种高效复合微生物菌剂的制备方法。


背景技术：

2.随着农业技术的发展，连作障碍性问题越来越严重，比如黄瓜、草莓、三七等作物的连作障碍性问题就非常严重。解决连作障碍的生物防治方法，根本机制在于改善连作土壤理化性质，微生物菌群结构，抑制病原菌，增加细菌和放线菌种类，促进植物的生长。但仅靠一两个拮抗菌或促生菌改善菌群结构显然不可行。将不同的拮抗菌和促生菌制成复合菌剂，不仅具有拮抗促生的作用，而且可以适应不同的环境条件，具有较大的应用前景。
3.蚯蚓是以有机质废弃物为食的腐生性无脊椎软体动物，被生物学家达尔文称之为地球上最有价值的动物。蚯蚓粪是一种黑色、均一、有自然泥土味的细碎类物质，具有很好的孔性、通气性、排水性和高的持水量，有很大的比表面积，使得许多有益微生物得以生存并具有良好的吸收和保持营养物质的能力。蚯蚓粪中富含细菌、放线菌和真菌，约含细菌1.8*108细胞\克干重，放线菌2.8*106细胞\克干重，真菌2.0*105细胞\克干重。多项研究表明，蚯蚓粪具有防治作物连作障碍的作用，其主要通过两个方面：一个方面是利用蚯蚓粪本身的理化性质，改善土壤的理化性质；另一个方面也是更加重要的方面，是利用蚯蚓粪中丰富的功能性微生物，抑制土传植物病原菌，调节土壤群落组成，促进植物生长。
4.蚯蚓粪中含有丰富的拮抗菌和促生菌，因此，本发明旨在从蚯蚓粪中分离有益菌株，制成复合菌剂，配合不同肥料的施用，为解决作物连作障碍提供一种生物防治的解决方法。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种高效复合微生物菌剂的制备方法，所述的这种高效复合微生物菌剂的制备方法要解决现有技术中的农业用土壤不适合农作物连作的技术问题。
6.本发明提供了一种高效复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
7.(1)一个分离与筛选拮抗菌的步骤：将培养好的植物病原真菌黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、白菜根腐病菌和黄瓜立枯病菌用打孔器打取直径为5mm的菌块，然后将其倒置放在平板中央，培养备用；取新鲜蚯蚓粪用无菌水稀释涂布到上述培养基上，28℃培养2
‑
4天，待长出单菌落后，用灭菌牙签挑取单菌落点在已制备好植物病原菌平板上，呈“十”字点在病原菌菌落周围，28℃培养5天后测量抑菌直径，从采集的蚯蚓粪样中分离到对上述四株病原真菌抑菌效果都较强的5株细菌；
8.(2)一个培养的步骤：将分离的五株细菌按照1:1:1:1:1的物料比进行混合后培养，在28℃，160r/min下培养2天，培养基配方为:牛肉膏1.5g/l，蛋白胨5.0g/l，大豆粉5g/l，玉米粉1.5g/l，氯化钠5.0g/l；
9.(3)一个发酵的步骤，发酵参数为：起始ph为7.0，接种量为2.0％，温度为35℃，转速240r/min，培养时间为36h；待发酵培养后菌数能达到2.86*10
10
cfu/ml时即为高效复合微生物菌剂。
10.本发明从蚯蚓粪中分离有益菌株，制成复合菌剂，配合不同肥料的施用，为解决作物连作障碍提供一种生物防治的解决方法。
11.本发明取新鲜蚯蚓粪，利用平板对峙法从新鲜蚯蚓粪中筛选了对特定几种土传病害病原真菌(黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、白菜根腐病菌和黄瓜立枯病菌)具有拮抗作用的多个细菌菌株，根据形态学特征和16srrna序列分析对比确定其菌属；然后对筛选出的多种拮抗菌株进行相容性测定，观察是否有拮抗现象；选取相容性较好的菌株进行混合培养试验，筛选优化出混合培养基配方，并确定混合菌剂的最佳发酵培养温度、ph值、转速和培养时间等培养参数，培养结束即制作完成复合微生物菌剂。此复合微生物菌剂不仅能抑制多种土传病害病原真菌，还能分泌促进植物生长的物质，具有巨大推广价值和前景！
12.本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。
13.(1)5株菌株的复合，功能互补，效果稳定，环境适应性强。菌种的复合，种类越多就越难。本发明是5株菌株的复合，各菌株之间各有优势，功能互补，是植物根际促生菌群。其效果稳定，环境适应性强，具有非常强大的功能。
14.(2)天然复合菌，相容性非常好。有别于大多复合菌剂是将多种特定的已知菌种进行人为复合，本发明的复合菌株是从同一新鲜蚯蚓粪中分离筛选获得的未知菌，他们在原有介质蚯蚓粪中就能很好的共存，后面的鉴定和相容性试验，也证明其具有非常好的相容性。因此本发明的菌剂为天然的复合菌剂，能充分发挥各菌株的功能。
15.(3)既能抗病又能促生。本发明的复合微生物菌剂既能抑制植物病原菌，降低植物病害的发生；又能帮助植物从环境中摄入养分，直接促进生长。
16.(4)经济效益显著。本发明生产的复合微生物菌剂，能明显改善土壤的连作障碍，促进作物生长，增加作物产量，提高农产品的品质和口感风味，能增加农户经济效益。
具体实施方式
17.实施例1
18.(1)拮抗菌的分离与筛选：将培养好的植物病原真菌(黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、白菜根腐病菌和黄瓜立枯病菌)用打孔器打取直径为5mm的菌块，然后将其倒置放在平板中央，28℃培养2天备用。取新鲜蚯蚓粪用无菌水稀释涂布到相应培养基上，28℃培养2
‑
4天，待长出单菌落后，用灭菌牙签挑取单菌落点在已制备好植物病原菌平板上，呈“十”字点在病原菌菌落周围，28℃培养5天后测量抑菌直径。从采集的蚯蚓粪样中分离到18株对一种或多种病原真菌具有明显拮抗作用的细菌和放线菌。对四株病原真菌抑菌效果都较强的菌株有8株，其中5株为细菌，3株为放线菌。我们选取5株细菌为研究对象。对选取的单菌落纯化3次，然后记录菌落形态，显微镜观察。各菌株对植物病原真菌平均抑制直径如下表所示。
[0019][0020]
(2)体外促生试验：对5株拮抗菌分别进行产铁载体试验、产纤维素酶试验、产蛋白酶试验和产iaa(吲哚乙酸)试验。结果表明这些菌能够产铁载体、纤维素酶、蛋白酶和植物激素，具有体外促生能力。
[0021]
(3)拮抗菌株鉴定：对选取的单菌落纯化3次，然后记录菌落形态，显微镜观察。细菌纯菌株dna提取采用冻融法，
‑
20℃保存。以提取的细菌dna为模板，采用细菌通用引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag
‑3’
)和1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt
‑3’
)进行16srdna的pcr扩增。扩增产物4℃保存。所得产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。所得序列与genbank数据库中序列进行blast分析。用dnaman软件对所得序列与相似性较高的菌株进行同源性分析，用mega软件采用邻接法构建系统发育树，
[0022]
自展系数为1000次重复。其形态学特征及16srrna序列比对结果如下。
[0023][0024]
(4)拮抗菌相容性测定：将5株拮抗促生细菌在nb固体培养基上3株*2株平行交叉划线，28℃培养3d后观察划线交叉处是否有拮抗现象。结果发现5株细菌两两划线交叉点之间没有形成拮抗带，说明5株细菌具有良好的相容性，可以混合培养生长。
[0025]
(5)培养基配方优化：根据前人研究和预备试验，利用廉价的碳氮源材料按比例取代实验室级试剂，优化培养基配方。取不同菌株以无菌操作挑取1环菌苔，接入nb培养液中，
摇培18h作为种子液。测量上述种子液的od值，用无菌nb培养液稀释使其od值一致，各取1ml共计5ml种子液放入145ml不同配方培养液中，在28℃，160r/min下培养2d后，检测各个配方培养液中菌的数量，对黄瓜枯萎病菌的抑制作用及iaa含量。每处理重复3次。结果显示一个最优的培养基体外拮抗促生效果最好，细菌菌落数量排在第二3.8*109cfu/ml，平均抑菌圈直径最大为12mm，平均iaa含量最高为18.56ug/ml。上述最优化培养基配方为:牛肉膏1.5g/l，蛋白胨5.0g/l，大豆粉5g/l，玉米粉1.5g/l，氯化钠5.0g/l。
[0026]
(6)发酵参数优化：以优化培养基配方为基础，通过正交试验研究不同温度、转速、接种量和ph值条件对复合菌剂发酵的影响，以期达到复合菌剂最佳的发酵条件，充分发挥复合菌剂的功能。每处理重复3次。最终确定混合菌液最佳发酵参数为：起始ph为7.0，接种量为2.0％，最佳温度为35℃，转速240r/min，培养时间为36h。
[0027]
(7)总结：本发明是一种复合微生物菌剂，其是从新鲜蚯蚓粪中分离筛选的对特定四种病原真菌(黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、白菜根腐病菌和黄瓜立枯病菌)均具有拮抗特性的5株细菌各20％复合而成。经过鉴定两个枯草芽孢杆菌、两个解淀粉芽孢杆菌、一个地衣芽孢杆菌，相容性非常好，其优化培养基配方为：牛肉膏1.5g/l，蛋白胨5.0g/l，大豆粉5g/l，玉米粉1.5g/l，氯化钠5.0g/l；最佳发酵参数为：起始ph为7.0，接种量为2.0％，最佳温度为35℃，转速240r/min，培养时间为36h；经优化发酵培养后菌数能达到2.86*10
10
cfu/ml，具有强大的拮抗促生效果。
[0028]
实施例2设施黄瓜连作障碍复合微生物制剂修复试验
[0029]
按照本发明的方法进行复合微生物菌剂的生产，在上海北港园艺场开展微生物菌剂修复黄瓜连作障碍试验，现将试验总结如下：
[0030]
一、试验材料与方法：
[0031]
1、供试材料：
[0032]ⅰ菌剂：5株细菌复合菌剂由实施例1制备。复合菌剂在生产车间内发酵生产，使用时稀释一百倍(确保最终稀释液细菌浓度大于108cfu/ml)
[0033]ⅱ复合肥：市售(15
‑
15
‑
15)
[0034]ⅲ有机肥：市售发酵牛粪有机肥(有机质大于45％，氮磷钾总量大于5％)
[0035]
2、试验作物：黄瓜，品种为春秋王
[0036]
3、试验地点：上海北港园艺场
[0037]
4、试验设计
[0038]
试验的三连栋温室面积为30*18＝540m2，分5个处理1个对照，4次重复，共24个小区，每小区面积20m2。于3月22日播种，4月8日定植，定植密度为78株/20m2。试验过程中设专人负责，在试验期间按要求进行考察和记录。
[0039]
复合肥和有机肥作为基肥在种植前随整理田地时均勾施用到表层土壤中，菌剂在黄瓜定植后十天，每株用稀释液灌根，每十天灌一次，直至黄瓜基本采收完(共六次)，连续处理两季黄瓜。
[0040]
表1不同处理方式及编号
[0041]
编号处理ck不施肥 无菌剂处理1不施肥 复合菌剂
处理2复合肥50kg 无菌剂处理3复合肥50kg 复合菌剂处理4复合肥40kg 有机肥200kg 无菌剂处理5复合肥50kg 有机肥200kg 复合菌剂
[0042]
二、试验结果与分析：
[0043]
1、复合菌剂对连作黄瓜根际土壤微生物的数量的影响
[0044]
表2不同处理土壤样品中微生物菌落计数
[0045][0046]
由表可知：(1)不施肥条件下：复合菌剂的使用明显提高了土壤中细菌的数量为29.38*106cfu/g；真菌和放线菌数量无明显差异。(2)在使用复合肥的情况下：使用复合菌剂的处理与不使用的相比细菌数量增加明显，真菌数量和放线菌数量大幅度显著减少。(3)在使用复合肥和有机肥的情况下：使用复合菌剂的处理与不使用的相比细菌数量显著增加，真菌数量显著减少，放线菌数量略有减少。
[0047]
上述结果表明，菌剂处理可以显著的的提高黄瓜根际土壤中的细菌数量，还能不同程度的降低黄瓜根际土壤中的真菌数量和放线菌数量；对抑制土壤中的病原真菌数量具有重要作用。
[0048]
2、病害情况
[0049]
试验黄瓜发生枯萎病，经调查发现，用处理5的植株枯萎病发病率最低，特别是在生长后期，枯萎病进入高发期时，处理5的植株发病速度较慢，发病植株明显少于其他处理。其次是处理3，其发病率与其他处理相比也相对较低(详见表3)。这可能由于复合菌剂的加入显著提高了土壤中有益细菌数量，降低了土壤中病原真菌数量；并且复合肥和有机肥的施入，也改善了土壤理化结构及增加了营养提供，增加了植株抗病能力。
[0050]
表3枯萎病发病植株统计表
[0051][0052]
3、产量及产值
[0053]
由表4可以看出各处理的产量均高于对照，其中处理5的产量最高，较对照增产12.7％，其次为处理3，较对照增产12％，再次为处理4，增产率9.7％。增产最少的为处理1，仅增产3.3％。
[0054]
表4黄瓜产量分析调查表 单位：平方米、kg
[0055][0056]
三、小结
[0057]
1、从土壤根际微生物数量来看，本发明菌剂处理可以显著的提高黄瓜根际土壤中的细菌数量，还能不同程度的降低黄瓜根际土壤中的真菌数量和放线菌数量；对抑制土壤中的病原真菌数量具有重要作用
[0058]
2、从发病情况来看，在抑制土传病害枯萎病方面，复合微生物菌剂具有明显效果，特别是在植株生长后期，枯萎病发病缓慢，整个生长过程中植株死亡率较低。
[0059]
3、从本次试验来看，各处理的产量较对照均有所增加，其中处理5产量增加最大，与对照相比增产12.7％，效果最为明显，其次为处理3，增产12.0％，再次为处理4，增产9.7％。表明使用复合微生物菌剂后能明显促进作物生长，提高作物产量。
[0060]
4、综合本次试验结果，本发明生产的复合微生物菌剂能明显改善作物连作障碍性问题，在促进植物生长，抑制病原真菌，降低病害发生，提高作物产量等方面效果显著。