miR-28a-5p抑制剂在预防或治疗NAFLD方面的应用的制作方法

mir
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28a
‑
5p抑制剂在预防或治疗nafld方面的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种mir
‑
28a
‑
5p抑制剂在制备nafld（非酒精性脂肪肝）预防或治疗药品方面的应用、mir
‑
28a
‑
5p抑制剂在预防或治疗nafld方面的应用。
2.

背景技术：

3.肝细胞中的过度脂沉积，将导致非酒精性脂肪肝（nafld），导致肝功能混乱。流行病学指出，nafld在中国是仅次病毒性肝炎的第二大肝病，在欧洲、北美和澳洲等地区nafld发病率高达40%。已有报道称，nafld与肥胖、高血脂、2型糖尿病、心脏病等疾病密切相关，严重的nafld甚至可以发展为肝纤维化、肝癌。然而，nafld发病的具体分子机制还未研究透彻，也无专门抗nafld的临床药物。所以，寻找防治nafld的手段有重要的现实应用价值。
4.已有报道称，nafld与肥胖、高血脂、2型糖尿病、心脏病等疾病密切相关，严重的nafld甚至可以发展为肝纤维化、肝癌。然而，nafld发病的具体分子机制还未研究透彻，也无专门抗nafld的临床药物。所以，寻找防治nafld的手段有重要的现实应用价值。
5.mirnas是nafld的重要调控分子，但mirnas在防治nafld中的应用方兴未艾，目前mirna抑制剂相关的防治nafld产品还很少，也尚无报道mir
‑
28a
‑
5p在防治nafld形成中的作用。


技术实现要素：

6.发明目的：针对现有技术中存在问题或不足，本发明提供一种mir
‑
28a
‑
5p抑制剂在制备nafld（非酒精性脂肪肝）预防或治疗药品方面的应用、mir
‑
28a
‑
5p抑制剂在预防或治疗nafld方面的应用。
7.为实现上述发明目的，本发明的实施例提供一种mir
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28a
‑
5p抑制剂在制备nafld（非酒精性脂肪肝）预防或治疗药品方面的应用。
8.进一步的，所述mir
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28a
‑
5p抑制剂（anti
‑
mir
‑
28a
‑
5p）序列为：5
’‑
cuc aau aga cug acu cau ccu ucu caa uag acu gac uca ucc uuc uca aua gac uga cuc auc cuu cuc aau aga cug acu cau ccu ucu caa uag acu gac uca ucc uuc uca aua gac uga cuc auc cuu cuc aau aga cug acu cau ccu ucu caa uag acu gac uca ucc uu
‑3’
，将其构建到pcdh
‑
cmv
‑
mcs
‑
ef1
‑
copgfp
‑
t2a
‑
puro慢病毒载体。
9.进一步的，mir
‑
28a
‑
5p抑制剂制备的药物以口服、注射剂或输液剂给药。
10.本发明的实施例还提供一种nafld（非酒精性脂肪肝）预防或治疗药品，其特征在于，包括mir
‑
28a
‑
5p抑制剂，所述药物通过将mir
‑
28a
‑
5p抑制剂构建到pcdh
‑
cmv
‑
mcs
‑
ef1
‑
copgfp
‑
t2a
‑
puro慢病毒载体制备获得。
11.进一步的，所述药物中还可包括一种或多种药学上可接受的载体，所述载体包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂、表面活性剂和增效剂。
12.本发明的实施例还提供一种mir
‑
28a
‑
5p抑制剂在制备肝脏保护制剂、减肥或降脂药物方面的应用。
13.本发明的实施例另外还提供mir
‑
28a
‑
5p抑制剂在预防或治疗nafld方面的应用，其特征在于，包括以下过程：s1、mir
‑
28a
‑
5p抑制剂可减少高脂引起的肝重增加；s2、mir
‑
28a
‑
5p抑制剂可抑制肝中脂类沉积；s3、mir
‑
28a
‑
5p抑制剂可缓解小鼠肝脏的胰岛素抵抗；s4、mir
‑
28a
‑
5p抑制剂可抑制hfd小鼠肝脏的炎症反应和肝损伤。
14.本发明的上述技术方案的有益效果如下：（1）敲低mir
‑
28a
‑
5p可以缓解hfd小鼠的脂类过度沉积、炎症反应和胰岛素抵抗等nafld症状。
15.（2）本发明通过设计mir
‑
28a
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5p抑制剂并在实施例中通过实施例中的实验论证该抑制片段用于制备nafld防治产品的可行性。
16.（3）本发明为转化应用mir
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28a
‑
5p防治nafld提供了坚实的理论基础。本发明为临床应用mir
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28a
‑
5p抑制剂防治nafld提供了坚实的基础，有助于推动mir
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28a
‑
5p抑制剂的临床应用，本发明具有较好的应用前景。
17.附图说明
18.图1为本发明的实施例1中敲低mir
‑
28a
‑
5p降低hfd小鼠的肝重情况图。其中，图1a为称量小鼠的肝重统计图；图1b为计算小鼠肝重与体重的比重统计图。
19.图2为本发明的实施例2中敲低mir
‑
28a
‑
5p抑制肝中脂类沉积情况图。图2a为elisa检测肝重的tg、nefa、tc含量统计图；图2b为h&e染色检测小鼠肝脏的病理结构改变统计图；图2c为油红染色观察小鼠肝脏重的脂类沉积统计图；图2d为rt
‑
qpcr检测小鼠肝脏中脂类代谢基因的表达统计图。#p<0.05与ndad
‑
anti
‑
mir
‑
28a
‑
5p，&p<0.05与hfdad
‑
anti
‑
mir
‑
nc。
20.图3为本发明的实施例3中敲低mir
‑
28a
‑
5p缓解小鼠肝脏的胰岛素抵抗情况图。图3a和图3b为血糖仪检测各组小鼠的葡糖糖耐受情况图；图3c和图3d为血糖仪检测各组小鼠的胰岛素抵抗情况图。#p<0.05与ndad
‑
anti
‑
mir
‑
28a
‑
5p，&p<0.05与hfdad
‑
anti
‑
mir
‑
nc。
21.图4为本发明的实施例4中敲低mir
‑
28a
‑
5p显著抑制hfd小鼠肝脏的炎症反应和肝损伤情况图。图4a为rt
‑
qpcr检测肝脏中炎症反应相关基因的表达统计图；图4b为elisa检测肝中ast、alt和alp的含量统计图。#p<0.05与ndad
‑
anti
‑
mir
‑
28a
‑
5p，&p<0.05与hfdad
‑
anti
‑
mir
‑
nc。
22.具体实施方式
23.为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
24.在本发明的实施例中，建立小鼠模型包括：ndad
‑
anti
‑
mir
‑
nc为正常饮食小鼠腺病毒构建mirna抑制剂的阴性对照组；ndad
‑
anti
‑
mir
‑
28a
‑
5p为正常饮食小鼠腺病毒
构建mir
‑
28a
‑
5p的抑制剂组；hfdad
‑
anti
‑
mir
‑
nc为高脂日粮喂养小鼠腺病毒构建mirna抑制剂的阴性对照组；hfdad
‑
anti
‑
mir
‑
28a
‑
5p为高脂日粮喂养小鼠腺病毒构建mir
‑
28a
‑
5p的抑制剂组。
25.实施例1：敲低mir
‑
28a
‑
5p减少高脂引起的肝重增加。
26.1.1实验方法1.1.1nafld小鼠模型的建立从南京大学模式动物所购买6周龄的c57bl/6小鼠，敲低小鼠肝中mir
‑
28a
‑
5p表达，以高脂日粮（hfd）持续饲养小鼠12周，所有动物的饲养实验在南京大学生命科学学院spf级的动物房中进行。
27.1.1.2检测小鼠肝脏的重量之后，使用分析天平称量小鼠的体重和肝重，并将肝脏组织制备成石蜡切片、冰冻切片，或冻存在
‑
80℃用于提取肝组织的总rna和蛋白进行下一步的分析。
28.1.2实验结果hfd饮食可以增加小鼠的肝重，并提升肝脏在整个身体重量中的比重。然而，敲低mir
‑
28a
‑
5p可以显著地降低hfd饮食引起的小鼠肝重增加（见图1）。图中，nd：normaldiet，正常饮食；hfd：highfatdiet，高脂日粮；ad
‑
：adenovirus，腺病毒；anti
‑
mir
‑
nc：mirna抑制剂的阴性对照组；anti
‑
mir
‑
28a
‑
5p是为mir
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28a
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5p的抑制剂；lw：liverweight，肝脏重量；bw：bodyweight，体重。如图1a所示，称量小鼠的肝重，可见敲低mir
‑
28a
‑
5p能够显著降低hfd饮食引起的小鼠肝重；如图1b所示，可以看出，通过计算小鼠肝重与体重的比重，敲低mir
‑
28a
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5p能够提升hfd饮食小鼠肝脏在整个身体重量中的比重。
29.实施例2：敲低mir
‑
28a
‑
5p抑制肝中脂类沉积2.1实验方法：2.1.1elisa检测肝组织中的脂类含量小鼠及db/db、ob/ob小鼠的肝脏样品，需用生理盐水或者乙醇匀浆，然后再测定。取100μl至微量培养板中，用中国上海碧云天生物科技有限公司的酶试剂盒进行检测甘油三酯（tg）、自由脂肪酸（nefa）和胆固醇（tc）。
30.2.1.2苏木素
‑
伊红染色法（h&e）检测小鼠肝脏的病理结构变化h&e用于观察肝脏结构。步骤如下（1）小鼠的肝组织经过4%多聚甲醛固定24h后，石蜡包埋并切片。（2）二甲苯（i）15min，二甲苯（ii）15min，二甲苯（iii）5min。（3）100%乙醇5min，95%乙醇5min，80%乙醇5min，蒸馏水冲洗1min。（4）苏木素染色15min，流水冲洗1min。（5）盐酸乙醇分化1~5s，自来水冲洗1min。（6）0.2%氨水返蓝10~30s，自来水冲洗1min。（7）伊红染色30~90s。（8）进行脱水和透明，即80%乙醇2~5s，95%乙醇2~5s，100%乙醇（i）3min，100%乙醇（ii）3min。二甲苯10min。最后用中性树脂封片。
31.2.1.3油红染色检测脂肪细胞中的脂滴积累室温pbs冲洗细胞，在4%多聚甲醛中固定10min，室温pbs洗两遍。0.35%油红异丙醇溶液用等体积的水稀释后，加入固定好的细胞中，共同孵育10min。再吸去染色液，60%异丙醇洗涤两遍，蒸馏水轻洗两次，观察并拍照。
32.2.1.4rt
‑
pcr检测小鼠肝组织中的基因表达采用trizol法从肝组织中提取总mrna，经过反转录得到cdna。使用cybrgreen试
剂盒，在荧光定量pcr仪（abi 7500 thermal cycler）上进行定量分析。反应条件为，5 oc
×
3 min；再变性95 oc
×
10 s，退火60 oc
×
5 s，72 oc
×
10 s，共40个循环；β
‑
actin作为内参。实验中所用到的引物如下：基因正向引物（5
’‑3’
）反向引物（5
’‑3’
）fatp
‑
1ggatctgatgcgggctccacagagaggccaaagaggtcfatp
‑
2atgatcggccttcacggatgcccggtcatttggtttctgccd36tcccagaattctcagctgctcacatttcagaaggcagcaacttcsrebp1cggagccatggattgcacattgcttccagagaggaggccagacc1agctgatcctgcgaacctgccaagcggatgtaaactfasatcctggaacgagaacacgatctagagacgtgtcactcctggacttppar
‑
γtgaacgtgaagcccatcgagcttggcgaacagctgagaggppar
‑
αtggtgcatttgggcgtatctcacagagcgctaagctgtgaacox
‑
1cgccgtcgagaaatcgagaagtgcacagagtttttaaaccacacpt
‑
1αaccactggccgcatgtctccatggcgtagtagttgctucp2aaagcagcctccagaactccccaggaacttcacagtggcthmgcrtgcctggatgggaaggagtagcacctccaccaaggcttatcyp7a1acttctgcgaaggcatttggaacacagagcatctccctggβ
‑
actinagaacatcatccatgcatccagcctgcttcaccaccttcttg2.2 实验结果：1）研究表明，elisa检测肝重的tg、nefa、tc含量；hfd饮食显著地升高小鼠肝中的脂类含量（tg、nefa和tc），而敲低mir
‑
28a
‑
5p可以显著降低hfd小鼠肝中的脂类含量，如图2a所示。
33.2）h&e染色检测小鼠肝脏的病理结构改变；h&e染色显示，敲低mir
‑
28a
‑
5p可以减少hfd饮食引起的小鼠肝病理结构改变，如图2b所示。
34.3）与此同时，油红染色观察小鼠肝脏重的脂类沉积；发现敲低mir
‑
28a
‑
5p显著降低了hfd小鼠肝中的脂类沉积，如图2c所示。
35.4）rt
‑
qpcr检测小鼠肝脏中脂类代谢基因的表达，#p< 0.05与nd ad
‑
anti
‑
mir
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28a
‑
5p，&p< 0.05与hfd ad
‑
anti
‑
mir
‑
nc。rt
‑
qpcr检测发现敲低mir
‑
28a
‑
5p可以降低hfd小鼠肝中的脂合成基因的表达（fatp
‑
1、fatp
‑
2、cd36、srebp1c、acc1、fas、pparγ），增强hfd小鼠肝中的脂分解代谢基因的表达（pparα、acox
‑
1、cpt
‑
1α、ucp2、cyp7a1），如图2d所示。
36.实施例3：敲低mir
‑
28a
‑
5p缓解小鼠肝脏的胰岛素抵抗3.1 实验方法：3.1.1 血糖仪检测小鼠的gtt变化以hfd饲喂的小鼠为例。葡萄糖耐量实验（glucose tolerance test, gtt）中，敲低小鼠肝中的mir
‑
28a
‑
5p表达，再hfd饲喂8 w，禁食16 h。腹腔注射2 g/kg体重的葡萄糖溶液，采用尾部取血，血糖仪分别于注射后0、15、30、60和120 min测定血糖浓度。
37.3.1.2 血糖仪检测小鼠的itt变化胰岛素耐量实验（insulin tolerance test, itt）中，敲低小鼠肝中的mir
‑
28a
‑
5p表达，再hfd饲喂8 w，禁食4 h。腹腔注射0.75 u/kg体重的胰岛素溶液，以尾部取血，血糖仪分别于注射后0、15、30、60 和120 min测定血糖浓度。注意事项：db/db和ob/ob小鼠也可以按照此实验步骤测定gtt和itt指标。
38.3.2 实验结果：血糖仪检测血糖仪检测各组小鼠的葡糖糖耐受；在小鼠体内的实验表明，敲低hfd小鼠肝中的mir
‑
28a
‑
5p可以降低hfd小鼠的葡萄糖耐受（图3a、图3b）；同时，血糖仪检测各组小鼠的胰岛素抵抗，发现敲低hfd小鼠肝中的mir
‑
28a
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5p可以降低hfd小鼠的胰岛素抵抗（图3c、图3d）。
39.实施例4：敲低mir
‑
28a
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5p显著抑制hfd小鼠肝脏的炎症反应和肝损伤4.1 实验方法：4.1.1 elisa检测敲低mir
‑
28a
‑
5p对肝中炎症反应基因表达的影响从南京大学模式动物所购买6周龄的c57 bl/6小鼠，敲低小鼠肝中mir
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28a
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5p表达，以高脂日粮（hfd）持续饲养小鼠12周。取小鼠肝组织1 g，加组织裂解液ripa进行研磨，12000 rpm离心15 min，保留上清用于elisa实验检测肝组织中炎症因子和抗炎因子的含量。此处elisa采用上海碧云天生物科技有限公司的试剂盒。
40.4.1.2 elisa检测敲低mir
‑
28a
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5p对肝损伤指标的影响取4.1.1中的上清，根据上海碧云天生物科技有限公司的elisa试剂盒说明书检测肝中ast、alt、alp等肝损伤指标的改变。
41.4.2 实验结果：结果显示，rt
‑
qpcr检测肝脏中炎症反应相关基因的表达；hfd饲养可增强小鼠肝脏的炎症反应，而敲低mir
‑
28a
‑
5p则可以显著抑制hfd小鼠肝中的炎症因子表达（il
‑
1β、il
‑
6、tnf
‑
α、mcp
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1、il
‑
2）并增强抑炎因子il
‑
10的表达（图4a）。另一方面，elisa检测肝中ast、alt和alp的含量，hfd饮食可以造成小鼠的肝脏损伤，而敲低mir
‑
28a
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5p则可以显著减少hfd小鼠的肝损伤（图4b）。
42.综上可知，敲低mir
‑
28a
‑
5p可以显著抑制hfd小鼠肝脏的脂沉积、炎症反应和葡萄糖耐受、胰岛素抵抗，即敲低mir
‑
28a
‑
5p可以显著缓解hfd引起的nafld症状。因此，mir
‑
28a
‑
5p抑制剂有望开发成为防治nafld的制剂。
43.以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。