一种同时测定大青叶中靛蓝与靛玉红含量的方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，涉及一种同时测定大青叶中靛蓝与靛玉红含量的方法。


背景技术：

2.大青叶是我国的传统中药，为十字花科植物菘蓝isatisindigotica fort.的干燥叶，具有清热解毒、凉血消斑的功效，含有靛蓝、靛玉红等活性成分。大青叶现行质量标准收载于《中国药典》2020年版一部，有靛玉红的含量测定项，采用三氯甲烷提取、高效液相色谱法测定的方法。其他研究文献也多为测定靛玉红含量的方法，提取方法也多采用三氯甲烷提取、醇提等，普遍存在耗时长、操作繁琐等问题。靛蓝是一种蓝色粉末，能溶于热苯胺，几乎不溶于乙醇，不溶于水、酸、碱，有机溶剂中可溶，如乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯等，而靛蓝在这些溶剂中存在一定对光和热的不稳定性，测定时普遍存在难提取、重现性差等问题。现有技术中未见有用高效液相色谱法同时测定大青叶中靛蓝与靛玉红含量的文献报道，该方法的建立需要解决引起靛蓝难提取的一系列问题。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种同时测定大青叶中靛蓝与靛玉红含量的方法，该方法能够解决靛蓝难提取的问题，准确方便的同时进行大青叶中靛蓝和靛玉红含量的检测。
4.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
5.一种同时测定大青叶中靛蓝与靛玉红含量的方法，所述大青叶进行预处理并用有机溶剂进行提取，然后采用高效液相色谱进行检验。
6.一种同时测定大青叶中靛蓝和靛玉红含量的方法，包括以下步骤：
7.s1：对照品溶液的制备：精密称取靛蓝、靛玉红对照品适量，加入含磷酸的n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液制成对照品溶液；
8.s2：供试品溶液的制备：取大青叶适量，研细，过三号筛，精密称取适量粉末，置具塞锥形瓶中，加入适量含磷酸的n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液后称定重量，振摇，再称定重量，用含磷酸的n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；
9.s3：高效液相色谱法进行测定，色谱条件：c18色谱柱，以甲醇
‑
水(70：30)为流动相；检测波长为289nm；
10.s4：测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定。
11.本发明技术方案的进一步改进在于：所述含磷酸的n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液中磷酸的浓度范围：4％～6％。
12.本发明技术方案的进一步改进在于：步骤s2中振摇时间30～50分钟。
13.本发明技术方案的进一步改进在于：步骤s3色谱条件中柱温25～35℃，流速为0.9～1.1ml/min。
14.由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术效果如下：
15.本技术解决了靛蓝难提取的问题，多次检测结果显示方法准确可靠、灵敏、专属性强，各项指标均符合质量控制的要求，该含量测定方法可以适用于大青叶的质量控制，并且可以同时检测出大青叶中靛蓝与靛玉红的含量。
具体实施方式
16.一种同时测定大青叶中靛蓝与靛玉红含量的方法：
17.色谱条件与系统适用性试验：采用c18柱，以甲醇
‑
水(70：30)为流动相；检测波长为289nm。理论板数按靛蓝峰计算应不低于8000。
18.对照品溶液的制备：精密称取靛蓝、靛玉红对照品适量，加5％磷酸的n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液制成每1ml各含30μg的溶液，即得。
19.供试品溶液的制备：取大青叶适量，研细，过三号筛，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入5％磷酸的n,n
‑
二甲基亚酰胺溶液25ml，密塞，称定重量，振摇，再称定重量，用5％磷酸的n,n
‑
二甲基亚酰胺溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
20.一、提取条件的验证
21.1、n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液中磷酸浓度的影响
22.取同一批样品适量，分别用4％磷酸的n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液、5％磷酸的n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液、6％磷酸的n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液为提取溶剂，按本技术液相方法试验。结果见表1，结果表明n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液中4％～6％浓度的磷酸对结果无影响。
23.表1不同磷酸浓度的n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液作为提取溶剂的含量测定结果
[0024][0025]
2、提取方式的影响
[0026]
在考察提取方式的过程中，因靛蓝性质不稳定，而选择的提取溶剂沸点高，当用加热回流的方式进行提取时，靛蓝已检测不到；当用100℃热浸时，靛蓝含量也有不同程度的减少；当用超声提取时，靛蓝亦有分解。使用振摇的提取方式，结果表明大青叶中靛蓝、靛玉红二种成分提取率高且稳定性好。
[0027]
取同一批样品适量，分别振摇提取不同时间，按本技术方法测定。结果见表2。
[0028]
表2不同提取时间三种成分的含量测定结果
[0029][0030][0031]
二、对本技术方法进行方法学验证
[0032]
1线性关系考察
[0033]
精密量取靛蓝和靛玉红的混合对照品溶液(靛蓝浓度1.1781μg/ml、靛玉红浓度1.1823μg/ml)5μl、10μl，靛蓝和靛玉红的混合对照品溶液(靛蓝浓度5.8904μg/ml、靛玉红浓度5.9113μg/ml)5μl、10μl，靛蓝和靛玉红的混合对照品溶液(靛蓝浓度11.7808μg/ml、靛玉红浓度11.8225μg/ml)10μl、20μl，分别注入液相色谱仪，按本技术的色谱条件测定，以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，靛蓝在5.8904～235.6166μg之间呈良好的线性关系，回归方程为y＝6780.5x
‑
4682.5(r＝1)，靛玉红在5.9113～236.4504μg之间呈良好的线性关系，回归方程为y＝6609.3x
‑
2698.2(r＝1)，实验结果见表3。
[0034]
表3大青叶二成分线性关系考察结果
[0035][0036]
2重复性试验
[0037]
取同一批样品，研细，取0.25g、0.5g、0.75g各三份，精密称定，按供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按本技术液相方法测定。结果表明，本方法重复性良好(结果见表4)。
[0038]
表4大青叶二成分重复性试验结果
[0039][0040]
3回收率试验
[0041]
取已知含量的样品(含量见重复性结果)粉末9份，每份约0.25g，精密称定，每三份为一组，分别加入用5％磷酸的n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液配制的低、中、高三个浓度的混合对照品溶液25ml，按供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液。按本技术液相方法测定，计算回收率。结果见表5、表6。表明本方法回收率较好。
[0042]
表5靛蓝回收率试验结果
[0043][0044]
表6靛玉红回收率试验结果
[0045][0046]
4稳定性试验
[0047]
取一份供试品溶液，于0小时开始测定，以后间隔一段时间测定一次，记录峰面积。结果表明，供试品溶液至少在24小时内稳定(结果见表7)。
[0048]
表7供试品溶液稳定性试验结果
[0049][0050]
5耐用性试验
[0051]
对本技术方法进行了不同品牌的色谱柱及柱温、流速、流动相的耐用性考察，并计算含量。结果表明，各项条件的微小变化下色谱峰均分离较好，测定结果基本一致，耐用性较好。(见表8)
[0052]
表8耐用性考察
[0053][0054]
注：色谱柱ⅰ：shiseido mgⅱ,4.6
×
250mm,5μm,
[0055]ⅱ：waters symmetry c
18
，4.6
×
250mm,5μm,
[0056]ⅲ：shimadzu vp
‑
ods，4.6
×
250mm,5μm
[0057]
实施例
[0058]
色谱条件与系统适用性试验采用c18柱，以甲醇
‑
水(70：30)为流动相；检测波长为289nm。理论板数按靛蓝峰计算应不低于8000。
[0059]
对照品溶液的制备取靛蓝、靛玉红对照品适量，精密称定，加5％磷酸的n,n
‑
二甲基甲酰胺溶液制成每1ml各含30μg的溶液，即得。
[0060]
供试品溶液的制备取大青叶适量，研细，过三号筛，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入5％磷酸的n,n
‑
二甲基亚酰胺溶液25ml，密塞，称定重量，振摇40分钟，再称定重量，用5％磷酸的n,n
‑
二甲基亚酰胺溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
[0061]
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0062]
取药材15批和饮片20批分别按照本技术方法和药典方法进行检测。
[0063]
表9采用本技术方法和其他方法进行的检测结果
[0064]
[0065]