一种细胞因子诱导的杀伤细胞的分离和扩增方法与流程

1.本发明属于生物制药领域， 涉及一种细胞因子诱导的杀伤（cik）的分离和扩增方法。


背景技术：

2.细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer，cik）是一种非mhc限制性的高效杀伤活性的细胞毒性t细胞。
3.lanier于1986年首次发现这种细胞（cd
3 cd
56 细胞），其在外周血淋巴细胞中的比例为1%～5%，经大量扩增具有杀伤肿瘤和抗病毒活性，是目前最新、最好的免疫治疗方法，它比以往的til细胞、nk细胞、lak细胞等回输手段具有明显的治疗优势。cik能够显著刺激初始型t细胞增殖，在机体的细胞免疫和体液免疫中起重要的调控作用。由于cik细胞具有非mhc限制性, 高增殖活性, 高细胞毒力, 细胞来源丰富等优点, 目前已经广泛用于治疗恶性肿瘤。
4.dc
‑
cik，我们称之为靶向性cik技术，是在体外将单核细胞用ifn
‑
α、il
‑
2等细胞因子诱导和扩增为cik后，再与用gm
‑
csf、il
‑
4等细胞因子诱导的具有极强抗原呈递功能的树突状细胞（dendritic cell dc）共培养，并加入肿瘤特异性抗原，之后回输体内达到特异性杀伤肿瘤的方法。dc通过识别和捕获肿瘤特异性抗原，不仅可以刺激t细胞的增殖，还会将肿瘤的抗原信息以mhc
‑
抗原的形式传递给t细胞，使t细胞激活成为具有靶向性的杀伤细胞ctl，同时可以分泌大量细胞因子。这些细胞因子中，其中il
‑
2、il
‑
12、ifn
‑
γ等可以诱导cik成熟，并具有抗肿瘤的作用；il
‑
2、il
‑
6、tnf
‑
α及gm
‑
csf等细胞因子，可增强细胞毒作用。
5.鉴于细胞因子诱导的杀伤细胞的优异性能，不论在科研或者实践应用中，cik的大规模扩增都是重要的基础保障。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种细胞因子诱导的杀伤细胞的分离和扩增方法，通过大规模的高效扩增细胞因子诱导的杀伤细胞，为细胞免疫治疗提供基础和可能性。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，包括从血样中分离单个核细胞和进行扩增培养。
8.其中，分离单个核细胞依次包括以下步骤：s1
‑
1，收集血样，使用低速离心的方法去除血浆；s1
‑
2，淋巴细胞分离液ficoll
‑
hypaque上加入s1
‑
1获得的产物，1800
‑
2200rpm /min，离心15
‑
25min；s1
‑
3，吸取单个核细胞层液体，洗涤，去除血小板和分离介质，得到外周血单个核细胞（pbmc）。
9.单个核细胞的细胞培养包括以下步骤：
s2
‑
1，至少提前1天用cd3抗体和/或cd28抗体预先包被细胞培养容器，置于4℃过夜，pbs清洗；s2
‑
2，在s2
‑
1步骤处理的细胞培养容器中，用cik初始培养基重悬s1
‑
3步骤获得的外周血单个核细胞，细胞培养箱中培养；s2
‑
3次日加入il
‑
2，放回培养箱继续培养，维持细胞浓度在0.5~1
×
106细胞/ml。
10.较好的, s1
‑
1步骤中所述的低速离心的速度为1200
‑
1600 rpm，在本发明的一个优选实施例中使用1500 rpm。较好的，离心时间为5
‑
10min。
11.所述的ficoh
‑
hypaque是分层液。蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为ficoll），分子量为40kd，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，使用60g/l的低浓度ficoll溶液，添加泛影葡胺（urografin）（如商品isopaque或hypaque，故又称ficoll
‑
hypaque分层液），可配制成密度合适分层液。
12.较好的, 所述的淋巴细胞分离液ficoll
‑
hypaque上加入s1
‑
1获得的产物，是将离心管倾斜，在ficoll液面以上至少1cm处缓慢加入去除血浆的血样，不打乱液面界面。
13.较好的，将盛装反应液ficoll
‑
hypaque和/或血液样品的离心管倾斜，例如倾斜30
‑
60
°
，在ficoll液面以上缓慢加入稀释血，缓慢并且柔和，以不打乱液面界面但又不影响反应液活性和无菌性为准，例如采用滴加方式，每10秒钟滴加3、5、8、10、15或者20滴。ficoll
‑
hypaque可以通过市售获得，例如，其密度为1.077。
14.较好的，ficoll
‑
hypaque：稀释血=1:（1
‑
3），例如，采用ficoll
‑
hypaque：稀释血=1:2。稀释血是指去除血浆后的血液，可以加入生理盐水或者缓冲液进行稀释，稀释的比例可以是在去除血浆后的血液中加入0.5
‑
3倍体积的生理盐水或者缓冲液，混匀，也可以使用生理盐水或者缓冲液填补去除血浆而减少的体积。
15.较好的，步骤s1
‑
2中的离心的条件为：加速度为最低，减速过程设定为无闸减速，速度2000 rpm /min。其中，无闸减速为brake off。
16.较好的，离心后液体的分层，从上到下依次为：血清、单核细胞、分离液、粒细胞、红细胞。
17.较好的，步骤s2
‑
1中，cd3抗体和/或cd28抗体吸附在磁性纳米微球上。这也为后续分离、纯化提供了方便。
18.较好的，所述的细胞培养容器是容积为细胞培养板或者25
‑
1000ml的细胞培养瓶。可以是各种常规的或者市售的细胞培养容器，例如细胞培养瓶、细胞培养皿、细胞培养瓶、细胞培养滚瓶，等。例如，采用的t175。
19.较好的，步骤s2
‑
2中，用cik初始培养基重悬s1
‑
3步骤获得的外周血单个核细胞时，细胞初始浓度为1
‑3×
106细胞/ml。
20.cik的培养可以采用市售或者按照常规方法配制的rpmi1640，也可以采用完全培养液中加入atp和辅酶a；所述完全培养液包括基础培养液rpmi
‑
1640、白蛋白、l
‑
谷氨酰胺、葡萄糖、碳酸氢钠和hepes。
21.pbs可以使用常规方法配制，也可以采用如下配方：磷酸二氢钾(kh2po4)：0.27g，磷酸氢二钠(na2hpo4)：1.42g，氯化钠（nacl）：8g，氯化钾（kcl）0.2g，加去离子水约800ml充分搅拌溶解,然后加入浓盐酸调ph至7.4，最后，定容到1l。
22.较好的，步骤s2
‑
3中，所述加入il
‑
2为1000u。
23.通常，本发明的整个制备方法都在无菌条件下完成，细胞培养采用37℃，5%co2培养箱。
24.具体的，分离单个核细胞依次包括：s1
‑
a，将采集的血样转入50ml离心管，离心1500rpm，10min；s1
‑
b，吸取上层血浆转入另一根50ml离心管，离心3000rpm，10min，吸取上层澄清的血浆分装冻存于
‑
80℃冰箱；s1
‑
c，吸取生理盐水将s1
‑
b中除去血浆后的血样标本还原至原始体积，混匀；s1
‑
d，预先将淋巴细胞分离液ficoll
‑
hypaque（密度1.077），加入50ml无菌离心管，15ml/管（分离单个核细胞）；s1
‑
e，将30ml稀释血缓慢加在15ml 的ficoll
‑
hypaque上，将离心管倾斜45
°
，在ficoll液面以上1cm处缓慢加入稀释血，不打乱液面界面，ficoll
‑
hypaque：稀释血=1:2；将离心机温度设置为室温，加速度为最低，减速过程设定为brake off后，离心2000 rpm /min，离心20min；将离心管中含有外周血的上层和含有淋巴分离液的下层液体进行分离，获得进一步分层得结果，从上到下依次为：血清、单核细胞、分离液、粒细胞、红细胞；s1
‑
f，用平口巴氏滴管轻轻插入到单个核细胞层，沿着管壁小心地准确吸取该层细胞转移到另一支50ml离心管中。每管加生理盐水至50ml，轻轻吹匀细胞，离心洗涤2次：第1次，室温1300 rpm，7min；第2次，室温1200 rpm，10min；除去血小板和分离介质，最后一次离心之前计数。
25.具体的，单个核细胞的细胞培养包括以下步骤：s2
‑
a，包被：t175提前1天用5μg/ml终浓度的磁性纳米微球吸附后的cd3抗体和cd28抗体预先包被，置于4℃过夜。第0天用pbs清洗2
‑
3遍，备用；s2
‑
b，用cik初始培养基以2
×
106细胞/ml的浓度重悬pbmc，并铺入t175，置于37
°
c，5%co2培养箱中；s2
‑
c，次日补加1000u il
‑
2；放回培养箱继续培养；s2
‑
d，每2
‑
3天取样计数，用cik扩瓶培养基补液或传代，以维持细胞浓度在0.5~1
×
106细胞/ml；s2
‑
e，第28天收集细胞并计数；取样进行无菌检测，所述的无菌检测包括但不限于：细菌、真菌、支原体或者内毒素的检测。
26.其中，外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, pbmc)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。
27.较好的，所述的制备方法包括检测cik细胞；检测的内容包括但不限于：活死细胞检测，细菌、真菌检测，支原体检测，内毒素检测，细胞表面cd3、cd4、cd8、cd56等分子的表达检测；细胞因子tnf
‑
a、ifn
‑
r和/或il
‑
6的检测。
28.上述的检测可以使用本领域的常规方法，也可以按照本发明一个优选实施中使用的方法：a)活细胞检测：台盼蓝染色法，活细胞应在80%以上；b)细菌、真菌检测：血平板法 为阴性；
c)支原体检测：易色法 为阴性；d)内毒素检测：鲎试剂检测方法 为阴性；e)流式细胞仪检测细胞表面cd3、cd4、cd8、cd56等分子的表达：cd3 cd56 细胞的比例应在20%以上；f)细胞因子检测：参照tnf
‑
a,ifn
‑
r,il
‑
6检测试剂盒说明书的方法，收集cik细胞培养上清，检测cik细胞产生的tnf
‑
a,ifn
‑
r,il
‑
6的细胞因子的分泌情况。
29.相应的，本发明还提供了一种细胞因子诱导的杀伤细胞，所述细胞因子诱导的杀伤细胞可以通过上述制备方法获得。
30.本发明还提供了上述细胞因子诱导的杀伤细胞或者其制备方法的应用，使用所述制备方法能够高效、快速的获得大量细胞因子诱导的杀伤细胞。
31.本发明获得的cik细胞具有肿瘤特异性杀伤活性，可以克服免疫抑制的肿瘤微环境。本发明获得的cik细胞可以用于制备免疫治疗药物、尤其是抗肿瘤的免疫治疗药物。
32.本发明开发了一种细胞因子诱导的杀伤细胞的分离和扩增的方法，可以用于恶性肿瘤的治疗。采用固定化的纳米细胞因子的方法对从人外周血分离的单核细胞进行高效扩增，获得大量的细胞因子诱导的杀伤细胞（cik），解决了目前单核细胞大规模扩增的问题，获得的cik细胞具有肿瘤特异性杀伤活性，为将免疫细胞用于免疫治疗提供了可能，同时获得的免疫细胞可以克服免疫抑制的肿瘤微环境，更有有利于免疫细胞发挥活性。
附图说明
33.图1是单核细胞分离示意图；图2是cik细胞扩增图，其中，图2a为第0天、第7天和第14天细胞成团的显微镜图，图2b为细胞的数量统计；图3是 cik细胞产生的tnf
‑
a、ifn
‑
r、il
‑
6的细胞因子的分泌情况。
具体实施方式
34.以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。如果没有特别指出，本发明中细胞培养的方法和试剂可以采用 atcc 官方的《动物细胞培养指南》。
35.分离单个核细胞，如图1所示，单核细胞分离按照如下步骤进行：a)将采集的血样转入50ml离心管，离心1500rpm，10min；b)吸取上层血浆转入另一根50ml离心管，离心3000rpm，10min，吸取上层澄清的血浆分装冻存于
‑
80℃冰箱；c)吸取生理盐水将b中除去血浆后的血样标本还原至原始体积，混匀。
36.d)预先将淋巴细胞分离液ficoll
‑
hypaque（密度1.077），加入50ml无菌离心管，15ml/管（分离单个核细胞）；e)将30ml稀释血缓慢加在15ml 的ficoll
‑
hypaque上（方法：将离心管倾斜45
°
，在ficoll液面以上1cm处缓慢加入稀释血，注意不要打乱液面界面（ficoll
‑
hypaque：稀释血=1:2），将离心机温度设置为室温，加速度为最低，减速过程设定为brake off（无闸减速）后，离心2000 rpm /min，离心20min；
f)用平口巴氏滴管轻轻插入到单个核细胞层，沿着管壁小心地准确吸取该层细胞转移到另一支50ml离心管中。每管加生理盐水至50ml，轻轻吹匀细胞，离心洗涤2次，第1次，室温1300 rpm /min，7min；第2次，室温1200 rpm /min，10min，除去血小板和分离介质，最后一次离心之前计数。
37.如图1所示，将离心管中含有外周血的上层和含有淋巴分离液的下层液体进行分离，获得进一步分层的结果，从上到下依次为：血清、单核细胞、分离液、粒细胞、红细胞。
38.cik细胞培养：a)包被：t175提前1天用5μg/ml终浓度的磁性纳米微球吸附后的cd3抗体和cd28抗体预先包被，置于4℃过夜。第0天用pbs清洗2
‑
3遍，备用；b)用cik初始培养基以2
×
106细胞/ml的浓度重悬pbmc，并铺入t175，置于37℃，5%co2培养箱中；c)次日补加1000u il
‑
2；放回培养箱继续培养；d)每2
‑
3天取样计数，用cik扩瓶培养基补液或传代，以维持细胞浓度在0.5~1
×
106细胞/ml；e)第28天收集细胞并计数；取样进行无菌检测（细菌、真菌、支原体、内毒素）。
39.cik细胞扩增结果如图2所示，图2a为第0天、第7天和第14天细胞成团的显微镜图，图2b为细胞的数量统计，经过14天的培养，细胞大量增殖，达到约3.2*107细胞/ml。
40.cik细胞的检测：g)台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；h)细菌、真菌检测：血平板法 为阴性；i)支原体检测：易色法 为阴性；j)内毒素检测：鲎试剂检测方法 为阴性；k)流式细胞仪检测细胞表面cd3、cd4、cd8、cd56等分子的表达：cd3 cd56 细胞的比例应在20%以上；l)细胞因子检测：参照tnf
‑
a,ifn
‑
r,il
‑
6检测试剂盒说明书的方法，收集cik细胞培养上清，检测在0天，7天和14天时，cik细胞产生的tnf
‑
a,ifn
‑
r,il
‑
6的细胞因子的分泌情况。
41.cik细胞产生的tnf
‑
a,ifn
‑
r,il
‑
6的细胞因子的分泌情况如图3所示，tnf
‑
a,ifn
‑
r,il
‑
6的数量随着培养时间的增加而增加。培养的第7天，tnf
‑
a、ifn
‑
r、il
‑
6分别达到约50、60、55pg/106细胞，培养的第14天，tnf
‑
a、ifn
‑
r分别达到约100、80pg/106细胞。
42.本技术领域的技术人员应理解，本发明可以以许多其他具体形式实现而不脱离其本身的精神或范围。上述已描述的实施案例应理解为本发明的优选实例，本技术领域的技术人员可如所附权利要求书界定的本发明的精神和范围之内做出变化和修改，不应受到上述实施案例的限制。