一种细胞因子诱导的杀伤细胞的分离和扩增方法与流程

技术特征：
1.一种细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，包括从血样中分离单个核细胞和单个核细胞的扩增培养；分离单个核细胞依次包括以下步骤：s1
‑
1，收集血样，使用低速离心的方法去除血浆；s1
‑
2，淋巴细胞分离液ficoll
‑
hypaque上加入s1
‑
1获得的产物，以1800
‑
2200rpm的速度离心15
‑
25min；s1
‑
3，吸取单个核细胞层液体，洗涤，去除血小板和分离介质，得到外周血单个核细胞（pbmc）；单个核细胞的扩增培养包括以下步骤：s2
‑
1，至少提前1天用cd3抗体和/或cd28抗体预先包被细胞培养容器，置于4℃过夜，pbs清洗；s2
‑
2，在s2
‑
1步骤处理的细胞培养容器中，用cik初始培养基重悬s1
‑
3步骤获得的外周血单个核细胞，细胞培养箱中培养；s2
‑
3，次日加入il
‑
2，放回培养箱继续培养，维持细胞浓度在（0.5~1）
×
106细胞/ml。2.根据权利要求1所述的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于, 所述的淋巴细胞分离液ficoll
‑
hypaque上加入s1
‑
1获得的产物，是将离心管倾斜30
°
~60
°
，在ficoll液面以上至少1cm处缓慢加入去除血浆的血样，不打乱液面界面。3.根据权利要求1所述的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于,步骤s1
‑
2中，离心的条件为：加速度为最低，减速过程设定为无闸减速，速度2000 rpm /min；或者离心后液体的分层，从上到下依次为：血清、单核细胞、分离液、粒细胞、红细胞。4.根据权利要求1所述的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，步骤s2
‑
1中，cd3抗体和/或cd28抗体吸附在磁性纳米微球上；或者所述的细胞培养容器是容积为细胞培养板、细胞培养皿或者25
‑
1000ml的细胞培养瓶。5.根据权利要求1所述的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，步骤s2
‑
2中，用cik初始培养基重悬s1
‑
3步骤获得的外周血单个核细胞时，细胞初始浓度为（1
‑
3）
×
106细胞/ml；或者，所述加入il
‑
2为1000u。6.根据权利要求1所述的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，整个制备方法都在无菌条件下完成；分离单个核细胞依次包括：s1
‑
a，将采集的血样转入50ml离心管，离心1500rpm，10min；s1
‑
b，吸取上层血浆转入另一根50ml离心管，离心3000rpm，10min，吸取上层澄清的血浆分装冻存于
‑
80℃冰箱；s1
‑
c，吸取生理盐水将s1
‑
b中除去血浆后的血样标本还原至原始体积，混匀；s1
‑
d，预先将密度为1.077的淋巴细胞分离液ficoll
‑
hypaque加入50ml无菌离心管，15ml/管，分离单个核细胞；s1
‑
e，将30ml稀释血缓慢加在15ml 的ficoll
‑
hypaque上，将离心管倾斜45
°
，在ficoll液面以上1cm处缓慢加入稀释血，不打乱液面界面，ficoll
‑
hypaque：稀释血=1:2；将离心机温度设置为室温，加速度为最低，减速过程设定为brake off后，离心2000 rpm /min，离心
20min；s1
‑
f，用平口巴氏滴管轻轻插入到单个核细胞层，沿着管壁小心地准确吸取该层细胞转移到另一支50ml离心管中；每管加生理盐水至50ml，轻轻吹匀细胞，离心洗涤2次：第1次，室温1300 rpm /min，7min；第2次，室温1200 rpm，10min；除去血小板和分离介质，最后一次离心之前计数；或者，单个核细胞的细胞培养包括以下步骤：s2
‑
a，包被：t175提前1天用5μg/ml终浓度的磁性纳米微球吸附后的cd3抗体和cd28抗体预先包被，置于4℃过夜；第0天用pbs清洗2
‑
3遍，备用；s2
‑
b，用cik初始培养基以2
×
106细胞/ml的浓度重悬pbmc，并铺入t175，置于37℃，5%co2培养箱中；s2
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c，次日补加1000u il
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2；放回培养箱继续培养；s2
‑
d，每2
‑
3天取样计数，用cik扩瓶培养基补液或传代，以维持细胞浓度在0.5~1
×
106细胞/ml；s2
‑
e，第28天收集细胞并计数；取样进行无菌检测，所述的无菌检测包括但不限于：细菌、真菌、支原体或者内毒素的检测。7.根据权利要求1
‑
6任意一项所述的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括检测cik细胞；检测的内容包括但不限于：活死细胞检测，细菌、真菌检测，支原体检测，内毒素检测，细胞表面cd3、cd4、cd8或者cd56分子的表达检测；细胞因子tnf
‑
a、ifn
‑
r和/或il
‑
6的检测。8.一种细胞因子诱导的杀伤细胞，其特征在于，所述细胞因子诱导的杀伤细胞通过权利要求1
‑
6任意一项制备方法获得。9.权利要求1
‑
6中任意一项制备方法的应用，其特征在于，使用所述制备方法获得大量细胞因子诱导的杀伤细胞。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所获得的cik细胞在制备肿瘤特异性杀伤试剂、肿瘤免疫抑制药物或者免疫治疗药物中的应用。

技术总结
本发明属于生物制药领域，涉及一种细胞因子诱导的杀伤细胞的分离和扩增方法。该方法包括：收集血样，使用低速离心的方法去除血浆；加入淋巴细胞分离液Ficoll


技术研发人员：崔大祥 梁辉 沈琦 张文桦 田静 彭家伟 李雪玲 王茜茜
受保护的技术使用者：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
技术研发日：2021.08.24
技术公布日：2021/11/28