一种动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定方法与流程

1.本发明属于胃蛋白酶消化率测定技术领域，涉及一种动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定方法。


背景技术：

2.目前，动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率测定的国家标准方法是《gb/t17811
‑
2008动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定过滤法》，其检测原理是：已脱过脂的样品，用温热的胃蛋白酶溶液(酶液浓度和用量与酶解样品质量恒定)，在恒温、持续不断地振摇或搅拌下消化16h，过滤分离不溶性残渣，洗涤、干燥，测定残渣的粗蛋白质含量，同时测定脱脂未酶解样品的粗蛋白质含量。
3.上述方法从机理上来说，测定结果可靠有效，但操作过程麻烦，且易受偶然因素影响导致实验失败。主要体现在以下几个方面：
4.1、脱脂过程，国标要求脱脂方法按照粗脂肪抽提方法进行，用乙醚抽提脱脂，首先，乙醚是易制毒化学试剂，对实验人员的健康构成威胁；其次，易制毒化学试剂的流通受国家公安部门管控，采购渠道及一次性采购的量有限；此外，乙醚抽提脱脂过程繁琐且抽提的时间长，严重影响工作效率。
5.2、过滤过程，该操作由快速滤纸和抽提装置配套使用，存在明显的问题是：第一、抽滤速度慢：大多数样品抽滤时间需要30min以上，个别样品抽滤时间在甚至在1.5h以上，不能满足实际生产中的快速测定要求；第二、滤纸湿水后在负压下易被抽破，造成残渣的遗漏，影响了实验结果的准确度，甚至造成实验失败；第三、滤纸连同残渣一起消化，滤纸也会消耗一定量的盐酸标准滴定溶液，但是滤纸品质不稳定，不同滤纸所消耗的盐酸标准滴定溶液的体积不一致，无疑又进一步增加了实验误差。
6.3、洗涤过程，洗涤残渣的洗液为丙酮，该试剂与乙醚同属于易制毒化学试剂，存在类似的问题。
7.4、干燥过程，国标法中残渣过滤洗涤后需在105℃烘箱中烘干后才开始进行粗蛋白质的消化过程。目前凯氏定氮法测定粗蛋白质用的消化装置都是消化炉配套专用消化管，消化管可接受样品中有一部分水分的存在，甚至是液体样品，只需要在消化的过程分阶段升温即可，毋须设置干燥步骤。
8.5、残渣粗蛋白质测定过程，由于残渣中剩余的粗蛋白质含量非常少，含量低就意味着测定时的相对误差大，另外，原国标方法没有设置检验残渣是否清洗干净的步骤，若残渣没有清洗干净，被酶解后的小分子氨基酸被包被在残渣中，会造成残渣中粗蛋白质的含量明显偏高，进而影响实验结果的精确度。


技术实现要素：

9.本发明的目的是为了解决现有测定方法操作步骤复杂繁琐、检测过程耗时长、测定结果误差大、所用试剂安全风险高等问题，而提出一种简便快捷、易于操作、分析结果准
确可靠、可缩短分析时间、减少使用易制毒试剂、降低试剂管控成本和实验室安全风险的动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定方法，本发明可以在相对较短的时间内实现对动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的精确测定。
10.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
11.一种动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定方法，该方法包括以下步骤：
12.1)将粉碎后的饲料样品进行脱脂，得到脱脂未酶解样品；
13.2)取部分脱脂未酶解样品置于容器中，并加入胃蛋白酶溶液，之后进行恒温振荡消化，得到酶解后样品，该酶解后样品为消化液与残渣的混合物；
14.3)将酶解后样品全部转移至容量瓶中定容摇匀，之后过滤出部分滤液并测定该部分滤液中粗蛋白质的含量，结合脱脂未酶解样品中粗蛋白质的含量，计算得到饲料样品胃蛋白酶消化率。
15.进一步地，步骤1)中，将饲料样品粉碎至全部通过0.42mm孔筛。
16.进一步地，步骤1)中，采用石油醚进行脱脂。
17.进一步地，脱脂过程为：将粉碎后的饲料样品置于慢速定量滤纸上，用石油醚进行多次淋洗，之后进行干燥(风干，弃掉石油醚)。
18.进一步地，步骤2)中，所述的胃蛋白酶溶液的浓度为18
‑
22iu/ml，所述的部分脱脂未酶解样品的质量与胃蛋白酶溶液的体积之比为(0.9
‑
1.1)g:(140
‑
160)ml。
19.优选地，将0.9
‑
1.1g脱脂未酶解样品置于容器中。
20.进一步地，步骤2)中，恒温振荡消化过程中，温度为42
‑
46℃，振荡速率为180
‑
220r/min，振荡时间为15
‑
17h。
21.进一步地，步骤3)中，所述的部分滤液的体积与定容体积之比为(10
‑
20):250。
22.进一步地，步骤3)中，饲料样品胃蛋白酶消化率x的计算公式为：
[0023][0024]
上式中，w1为酶解后样品的消化液中粗蛋白质含量，w2为脱脂未酶解样品中粗蛋白质含量。
[0025]
本发明中，由于酶解后样品的残渣体积相对于定容体积可以忽略不计，因此，步骤3)中，移取部分滤液并测定该部分滤液中粗蛋白质的含量，进而可得到定容体积下粗蛋白质的总含量，即为酶解后样品的消化液中粗蛋白质含量，也就是被消化的粗蛋白质含量，而脱脂未酶解样品中粗蛋白质含量为饲料样品的总粗蛋白质含量，因此，将被消化的粗蛋白质含量除以总粗蛋白质含量即为饲料样品胃蛋白酶消化率x。
[0026]
进一步地，w1的计算公式为：
[0027][0028]
w2的计算公式为：
[0029]
[0030]
其中，
[0031]
v为酶解后样品消化液的定容体积，ml；
[0032]
v’为移取滤液的体积，ml；
[0033]
v1为滴定移取滤液所需盐酸标准滴定溶液的体积，ml；
[0034]
v
k
为滴定胃蛋白酶空白溶液所需要的盐酸标准滴定溶液的体积，ml；
[0035]
c为盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/l；
[0036]
m1为用于酶解的脱脂未酶解样品质量，g；
[0037]
v2为滴定脱脂未酶解样品所需要的盐酸标准滴定溶液的体积，ml；
[0038]
v0为滴定粗蛋白质空白所需要的盐酸标准滴定溶液的体积，ml；
[0039]
m2为用于测定粗蛋白质的脱脂未酶解样品质量，g。
[0040]
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
[0041]
1、本发明无易制毒试剂的使用，操作更安全。原国标方法中脱脂及淋洗过程分别使用乙醚及丙酮，这两者属于易制毒化学试剂，对操作者存在人身安全威胁，提高了实验室安全风险，本发明使用实验室常用的石油醚进行脱脂，且不再需要丙酮淋洗过程，因此能有效降低实验室安全风险。
[0042]
2、操作简单，用时短，效率高。原国标方法中脱脂过程为乙醚脱脂，参照gb/t6433中粗脂肪抽提方法，该方法用仪器测定需要6h以上，而本发明只需要1h以内便能将样品中粗脂肪含量降到1％以下，同时可以立即进行称量测定，符合《gb/t17811
‑
2008动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定过滤法》中粗脂肪含量小于1％可不脱脂的要求。另外，在消化液及消化残渣的处理上，本发明直接定容过滤，一个样品只需5min，而原方法抽滤过程每个样品至少需要30min，个别样品抽滤时间在1.5h以上，再加上丙酮淋洗消化残渣、丙酮的挥发以及试样干燥等过程，单个样品至少耗时3h，因此，本发明能够满足实际生产中的高效快速测定要求。
[0043]
3、本发明成本低，节约试剂及用电成本。本发明省去了丙酮淋洗，长时间的抽滤及滤渣烘干干燥过程，能有效降低实验室成本。
[0044]
4、本发明准确度高，精密度高，重复性更好。首先，在操作过程中，原国标方法抽滤过程所用滤纸吸水后在负压下易被抽破，造成未消化残渣的遗失；其次，滤纸品质不稳定，每张滤纸所消耗盐酸标准滴定溶液的体积不一致，而本发明用于测定粗蛋白质含量的样品没有引入除样品以外的其它物体，又减少了一个可能引起误差的因素；最后，在粗蛋白质测定过程中，原国标方法采用测定残渣中剩余的粗蛋白质含量来间接得到被消化掉的粗蛋白质含量数据，由于残渣中的粗蛋白含量非常少，大多为1
‑
2％，且原国标方法没有检验残渣是否清洗干净的步骤，若残渣没有清洗干净，被酶解后的小分子氨基酸被包被在残渣中，会造成残渣中粗蛋白质的含量明显偏高，消化率偏低，进而加大测量误差；而本发明则测定消化液中粗蛋白质含量，直接得到被消化掉的粗蛋白质含量数据，避免了此类情况的发生。此外，消化液中粗蛋白质含量较残渣高，含量越高相对误差就越小，测量准确度就越高。因此本方法大大减小了测量相对误差，提高实验结果的准确度。
具体实施方式
[0045]
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提
进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0046]
本发明提供了一种动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定方法，该方法包括以下步骤：
[0047]
1)将粉碎后的饲料样品进行脱脂，得到脱脂未酶解样品；
[0048]
2)取部分脱脂未酶解样品置于容器中，并加入胃蛋白酶溶液，之后进行恒温振荡消化，得到酶解后样品，该酶解后样品为消化液与残渣的混合物；
[0049]
3)将酶解后样品全部转移至容量瓶中定容摇匀，之后过滤出部分滤液并测定该部分滤液中粗蛋白质的含量，结合脱脂未酶解样品中粗蛋白质的含量，计算得到饲料样品胃蛋白酶消化率。
[0050]
步骤1)中，将饲料样品粉碎至全部通过0.42mm孔筛。采用石油醚进行脱脂，脱脂过程为：将粉碎后的饲料样品置于慢速定量滤纸上，用石油醚进行多次淋洗，之后进行风干，弃掉石油醚。
[0051]
步骤2)中，胃蛋白酶溶液的浓度为18
‑
22iu/ml，部分脱脂未酶解样品的质量与胃蛋白酶溶液的体积之比为(0.9
‑
1.1)g:(140
‑
160)ml，优选为将0.9
‑
1.1g脱脂未酶解样品置于容器中。恒温振荡消化过程中，温度为42
‑
46℃，振荡速率为180
‑
220r/min，振荡时间为15
‑
17h。
[0052]
步骤3)中，所述的部分滤液的体积与定容体积之比为(10
‑
20):250。
[0053]
饲料样品胃蛋白酶消化率x的计算公式为：
[0054][0055]
上式中，w1为酶解后样品的消化液中粗蛋白质含量，w2为脱脂未酶解样品中粗蛋白质含量。
[0056]
w1的计算公式为：
[0057][0058]
w2的计算公式为：
[0059][0060]
其中，
[0061]
v为酶解后样品消化液的定容体积，ml；
[0062]
v’为移取滤液的体积，ml；
[0063]
v1为滴定移取滤液所需盐酸标准滴定溶液的体积，ml；
[0064]
v
k
为滴定胃蛋白酶空白溶液所需要的盐酸标准滴定溶液的体积，ml；
[0065]
c为盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/l；
[0066]
m1为用于酶解的脱脂未酶解样品质量，g；
[0067]
v2为滴定脱脂未酶解样品所需要的盐酸标准滴定溶液的体积，ml；
[0068]
v0为滴定粗蛋白质空白所需要的盐酸标准滴定溶液的体积，ml；
[0069]
m2为用于测定粗蛋白质的脱脂未酶解样品质量，g。
[0070]
本发明中，用于酶解的脱脂未酶解样品称样量最好控制在0.9
‑
1.1g范围内，最优为1.0g；酶解温度最好控制在42
‑
46℃范围内，最优为45℃。
[0071]
实施例：
[0072]
一种动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定方法，包括以下步骤：
[0073]
1试剂的配制
[0074]
实验室用水应符合gb/t 6682中三级用水规格，使用试剂除特殊规定外均为分析纯。
[0075]
1.1胃蛋白酶溶液：20iu/ml(临用前配制)：
①
移取6.1ml浓盐酸至1000ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀(ph≈1
‑
2)；
②
将摇匀后的溶液转移至1000ml烧杯中于45℃水浴锅保温(使溶液保持在42
‑
45℃)；
③
加入2g活性为1:10000生化级胃蛋白酶，也可使用活性1:3000生化级胃蛋白酶，并缓慢搅拌直至溶解。(注意：胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶浓度为20iu/ml；不可使用非生化级胃蛋白酶；勿在加热板上加热胃蛋白酶溶液或配制时过热。)
[0076]
1.2石油醚(30
‑
60℃或60
‑
90℃)
[0077]
1.3凯氏定氮试剂：
[0078]
1.3.1硫酸：含量98％，无氮；
[0079]
1.3.2混合催化剂：0.4g五水硫酸铜、6g硫酸钾或硫酸钠，混合均匀；
[0080]
1.3.3氢氧化钠：40％水溶液(m/v)，称取40g氢氧化钠用水定容至100ml；
[0081]
1.3.4硼酸溶液(2％)：称取2.0g硼酸，加水溶解后稀释至100ml；
[0082]
1.3.5混合指示剂：甲基红0.1％乙醇溶液，溴甲酚绿0.5％乙醇溶液，两溶液等体积混合；
[0083]
1.3.6盐酸标准滴定溶液：c＝0.1mol/l，具体配制及标定详见gb/t 601
‑
2016化学试剂标准滴定溶液的制备；
[0084]
1.3.7蔗糖；
[0085]
1.3.8硫酸铵；
[0086]
1.3.9无水碳酸钠，纯度：基准级；含量：99.95
‑
100.05％
[0087]
2样品的制备
[0088]
按gb/t 14699采样，按gb/t 20195制备样品，粉碎至全部通过0.42mm孔筛(40目)，混匀装于密封袋，保存备用。
[0089]
3样品的测定
[0090]
3.1脱脂
[0091]
将慢速定量滤纸折成漏斗形状，称取约3
‑
5g样品于滤纸漏斗内，用石油醚脱脂(含脂肪小于1％可不脱脂，含脂肪1
‑
10％建议脱脂，含脂肪大于10％则应脱脂)。每次用10
‑
15ml石油醚淋洗，淋洗三次以上，并于通风橱内风干，去掉石油醚(石油醚易挥发，若室温高于30℃，可选用沸点60
‑
90℃的石油醚)。
[0092]
3.2胃蛋白酶消化
[0093]
称取已脱脂风干后的样品0.9
‑
1.1g，准确至0.0001g，置于250ml带塞磨口瓶中，加150ml新配制的并已预热至42
‑
46℃的胃蛋白酶溶液，盖紧瓶盖，将磨口瓶夹于恒温摇床上，
于42
‑
46℃、200r/min振荡16h进行保温酶解消化。同时做样品空白(向空的250ml带塞磨口瓶中加150ml新配制的并已预热至42
‑
46℃的胃蛋白酶溶液，后续操作同样品)。
[0094]
3.3消化液及残渣处理
[0095]
消化结束后，从恒温摇床上取下磨口瓶，将所有消化液及残渣无损的转移到250ml容量瓶中，冷却至室温，定容摇匀，用快速定量滤纸过滤，弃去初始的20
‑
30ml滤液，准确地移取10
‑
20ml滤液于干净的消化管中，参照gb/t 6432饲料中粗蛋白质的测定方法测定此滤液中粗蛋白质的含量，测定滤液中粗蛋白质的含量时，应从滴定体积中扣除酶液的空白值。
[0096]
3.4脱脂未酶解的样品的处理
[0097]
称取0.2
‑
0.3g脱脂未酶解的样品，参照gb/t 6432饲料中粗蛋白质的测定方法测定其粗蛋白质的含量，同时以蔗糖为空白样品，测定脱脂未酶解样品粗蛋白质的含量时，应从滴定体积中扣除蔗糖的空白值。
[0098]
3.5计算
[0099]
样品胃蛋白酶消化率x，以质量分数计，数值以％表示，按下式计算：
[0100][0101]
上式中，w1为酶解后样品的消化液中粗蛋白质含量，w2为脱脂未酶解样品中粗蛋白质含量。
[0102]
w1的计算公式为：
[0103][0104]
w2的计算公式为：
[0105][0106]
其中，
[0107]
v为酶解后样品消化液的定容体积，ml；
[0108]
v’为移取的部分滤液的体积，ml；
[0109]
v1为滴定移取的部分滤液所需盐酸标准滴定溶液的体积，ml；
[0110]
v
k
为滴定胃蛋白酶空白溶液所需要的盐酸标准滴定溶液的体积，ml；
[0111]
c为盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/l；
[0112]
m1为与v’相对应的脱脂未酶解样品的质量，g；
[0113]
v2为滴定脱脂未酶解样品所需要的盐酸标准滴定溶液的体积，ml；
[0114]
v0为滴定粗蛋白质空白溶液所需要的盐酸标准滴定溶液的体积，ml；
[0115]
m2为与v2相对应的脱脂未酶解样品的质量，g；
[0116]
6.25为氮换算成粗蛋白的平均系数；
[0117]
14为氮的摩尔质量，g/mol。
[0118]
1、不同脱脂方式对测定结果的影响：
[0119]
称取5组不同来源的鱼粉样品，分别采用石油醚淋洗三次及国标中无水乙醚抽提
方式进行脱脂，后续操作按照《gb/t 17811
‑
2008动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定过滤法》中步骤进行测定，同时进行平行实验，其测定结果如表1所示。
[0120]
表1不同脱脂方式与测定结果的关系
[0121][0122]
由上表知，两种脱脂方式检测结果相对偏差在
‑
0.31％至0.23％之间，符合国标《gb/t 17811
‑
2008动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定过滤法》中平行试样测定结果的相对偏差≤6％的要求，因此，完全可用石油醚淋洗三次样品的脱脂方式代替国标中无水乙醚抽提的方式来进行实验。
[0123]
2、不同残渣及滤液的处理方式对测定结果的影响：
[0124]
称取5组不同来源的鱼粉样品，分别用本方法测滤液中粗蛋白质含量及国标法测残渣中粗蛋白质含量的方式，脱脂及其他部分操作按照《gb/t 17811
‑
2008动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定过滤法》中步骤进行测定，同时进行平行实验，其测定结果如表2所示。
[0125]
表2不同酶解后样品处理方式与测定结果的关系
[0126][0127][0128]
由上表知，两种酶解后样品处理方式下的检测结果相对偏差在
‑
0.34％至0.31％之间，符合国标《gb/t 17811
‑
2008动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定过滤法》中平
行试样测定结果的相对偏差≤6％的要求，因此，完全可用测定滤液中粗蛋白质含量的方式代替国标中测残渣中粗蛋白质含量的方式来进行实验。
[0129]
3、准确度验证：
[0130]
称取5组不同动物性蛋白质饲料样品，分别用本方法和国标《gb/t 17811
‑
2008动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定过滤法》中全部步骤进行测定，同时进行平行实验，其测定结果如表3所示。
[0131]
表3本方法与国标法检测结果对比
[0132][0133]
由上表知，两种检测结果相对偏差在
‑
0.45％至0.35％之间，符合国标《gb/t17811
‑
2008动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定过滤法》中平行试样测定结果的相对偏差≤6％的要求，因此，完全可用本方法代替国标法进行实验。
[0134]
4、精密度验证：
[0135]
采用本方法及国标法多次测定同一批饲料样品，以鱼粉为例，重复性如表4所示。
[0136]
表4重复性数据
[0137]
[0138][0139]
由上表可以看出，通过6次实验，本方法测定结果的极差及相对平均偏差均小于国标方法。因此，本方法测定动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率重复性好，误差小。
[0140]
综上所述，本发明方法可以代替国标《gb/t 17811
‑
2008动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定过滤法》测定动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率，并且能在相对较短的时间内实现对动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的精确测定，应用前景较好，值得推广。
[0141]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。