用GTP类似物测量对G蛋白偶联受体激活的调控的方法与流程

sciences,1999,96(1),151)。这两种技术采用了能够供给能量的分子(称为供体)或能够接受能量的分子(称为接受体)的概念(physicalchemistrychemicalphysics,2007,9,5847)。可以提及例如使用融合至gpcr的供体和融合至g蛋白的接受体(wo2006/086883和wo2003/008435)或融合至g蛋白的α亚基的接受体和融合至g蛋白的β和/或γ亚基的供体(bunemann等，proc.natl.acad.sci.,2003,26,16077‑16082)来检测gpcr和g蛋白之间的相互作用的能量转移技术。然而，因为这些技术需要制备融合蛋白并且它们无法进行细胞内源表达的gpcr和g蛋白(即未修饰和未过表达)的研究，这些技术具有限制性。此外，为了区分可被受体激活的αg蛋白的不同亚型，这些技术需要制备多种膜样品(针对每种αg蛋白亚型的特定制剂)。11.能量转移技术也已用于开发旨在将g蛋白的(活性)gtp形式或g蛋白的(非活性)gdp形式的调控可视化的测定法。可以首先提及例如对如下格式(format)的使用：g蛋白融合至生物素标记从而结合至供体，该供体本身偶联至链霉亲和素蛋白；接受体结合至不可水解或可缓慢水解的gtp类似物(wo2006/035208)。此外，另一种格式使用生物素化肽(karobio)，其将gtp形式与gdp形式区分开来，并通过偶联至供体的链霉亲和素蛋白而结合至供体。利用抗6his抗体，接受体结合至融合有6his标签的gpcr(wo2004/035614)。因为这些技术也需要制备融合蛋白并且它们无法进行细胞内源表达的gpcr和g蛋白的研究，这些技术也具有限制性。类似地，为了区分可被受体激活的αg蛋白的不同亚型，这些技术需要制备多种膜样品。12.因此，存在对灵敏且可靠的方法的真正需求，所述方法允许容易地确定gpcr激活的调控，例如用于容易地确定分子调控gpcr激活的能力和/或用于确定g蛋白的何种亚型被gpcr激活。技术实现要素：13.本发明旨在提出用于体外筛选能够调控gpcr的分子的新方法。这种新方法特别是基于区分以下方面的能力：(i)结合至标记有ret伴侣对的成员的不可水解或可缓慢水解的gtp的全形式αg蛋白和空形式g蛋白；或者(ii)结合至标记有ret伴侣对的成员的不可水解或可缓慢水解的gtp的全形式αg蛋白和结合至gdp的全形式αg蛋白。14.特别地，本发明的优点在于：1)它使用基于荧光的检测方法，因此不具有放射性；2)它不需要洗涤步骤，因此简化了其应用，特别是对于化合物的高通量筛选的活性；3)它使得能够特别是在未修饰的g蛋白和gpcr上起作用；4)它允许在包含这些不同亚型的同一膜制剂中区分被gpcr激活的αg蛋白的不同亚型(通过使用区分αg蛋白亚型的检测配体来提供区分)。15.根据第一方面，本发明涉及用于确定分子调控g蛋白偶联受体(gpcr)激活的能力的方法，所述方法包括以下步骤：16.a)在第一容器中引入以下物质：17.‑携带一种或多种gpcr和一种或多种αg蛋白的膜制剂，18.‑标记有ret伴侣对的第一成员的不可水解或可缓慢水解的gtp源，19.‑标记有ret伴侣对的第二成员的g蛋白的α亚基(αg蛋白)的配体，所述配体能够结合至全αg蛋白，所述全αg蛋白结合至标记有ret伴侣对的第一成员的不可水解或可缓慢水解的gtp，20.‑任选的gpcr激动剂；21.b)测量第一容器中发出的ret信号；22.c)(i)在第二容器中引入与步骤a)中相同的试剂和待测分子，或(ii)在第一容器中引入待测分子；23.d)测量在步骤c)中获得的第一容器中或第二容器中发出的ret信号；24.e)比较在步骤b)和步骤d)中获得的信号，在步骤d)中获得的信号相对于在步骤b)中获得的信号存在调控表明待测分子能够调控gpcr激活。附图说明25.图1示出了g蛋白和gpcr的激活作用机制。26.图2a至图2d说明了根据本发明的4种测定格式。27.图3a和图3b说明了根据格式1a使用检测对gtpgn‑辛基‑c2 dsv36s‑d2对δ阿片gpcr进行的激活测试。28.图4a和图4b说明了根据格式1a使用检测对gtpgn‑辛基‑c11 dsv36s‑d2对δ阿片gpcr进行的激活测试。29.图5a和图5b说明了根据格式1a使用检测对gtpgo‑己基‑c2 dsv36s‑d2对δ阿片gpcr进行的激活测试。30.图6a和图6b说明了根据格式1a使用检测对gtpgn‑c2 dsv36s‑d2对δ阿片gpcr进行的激活测试。31.图7a和图7b说明了根据格式1a使用检测对gtpgn‑c3 dsv36s‑d2对δ阿片gpcr进行的激活测试。32.图8说明了使用检测对gtpgn‑辛基‑c3 dsv36s‑d2对δ阿片gpcr进行的结合测定。33.图9说明了根据格式1a使用检测对gtpgo‑己基‑c3 dsv36s‑d2对δ阿片gpcr进行的结合测定。34.图10a和图10b说明了膜和gtp供体的浓度对根据格式1a使用检测对gtpgn‑辛基‑c2 dsv36s‑d2对δ阿片gpcr进行的激活测试的影响。35.图11a和图11b说明了根据格式1a使用检测对gtpgn‑辛基‑c2 dsv36s‑d2对gpcr多巴胺d2进行的激活测试。36.图12a和图12b说明了根据格式1a使用检测对gtpgn‑辛基‑c11 dsv36s‑d2对gpcr多巴胺d2进行的激活测试。37.[图13a‑图13b]图13a和图13b说明了根据格式1b使用检测对gtpgo‑接头‑cy5(p) dsv36s‑lumi4tb对δ阿片gpcr进行的激活测试。[0038]图14a和图14b说明了根据格式1b使用检测对gtpgs‑接头‑cy5(r) dsv36s‑lumi4tb对δ阿片gpcr进行的激活测试。[0039]图15a和图15b说明了根据格式1b使用检测对gtpgn‑l18‑荧光素 dsv36s‑lumi4tb对δ阿片gpcr进行的激活测试。[0040]图16a和图16b说明了根据格式2a使用检测对gtpgn‑辛基‑c2 dsv36s‑d2对δ阿片gpcr进行的激活测试。[0041]图17a和图17b说明了根据格式2a使用检测对gtpgn‑辛基‑c2 dsv36s‑d2对δ阿片gpcr进行的激活测试。[0042]图18a和图18b说明了根据格式2a使用检测对gtpgn‑辛基‑c2 dsv38s‑d2对δ阿片gpcr进行的激活测试。[0043]图19a和图19b说明了根据格式2a使用检测对gtpgn‑辛基‑c11 dsv36s‑d2对δ阿片gpcr进行的激活测试。[0044]图20a和图20b说明了根据格式2a使用检测对gtpgo‑己基‑c2 dsv36s‑d2对δ阿片gpcr进行的激活测试。[0045]图21a和图21b说明了根据格式2a使用检测对gtpgn‑c2 dsv36s‑d2对δ阿片gpcr进行的激活测试。[0046]图22a和图22b说明了根据格式2a使用检测对gtpgn‑辛基‑c2 dsv36s‑d2对gpcr多巴胺d2s进行的激活测试。[0047]图23a和图23b说明了根据格式2a使用检测对gtpgn‑辛基‑c2 dsv36s‑d2对gpcr多巴胺d2s进行的激活测试。[0048]图24a和图24b说明了根据格式2a使用检测对gtpgn‑辛基‑c2 dsv36s‑d2对gpcr多巴胺d2s进行的激活测试。[0049]图25a和图25b说明了根据格式2b使用检测对gtpgn‑辛基‑cy5 dsv36s‑lumi4tb对δ阿片gpcr进行的激活测试。[0050]图26a和图26b说明了根据格式2b使用检测对gtpgn‑辛基‑af488 dsv36s‑lumi4tb对δ阿片gpcr进行的激活测试。[0051]图27a和图27b说明了根据格式2a使用检测对gtp‑gn‑辛基‑硫代琥珀酰亚胺基‑c2 dsv36s‑d2对δ阿片gpcr进行的激活测试。具体实施方式[0052]定义[0053]在本发明的意义中，术语“g蛋白”表示由称为αg蛋白、βg蛋白和γg蛋白的三个亚基组成的异三聚体蛋白。[0054]在本发明的意义中，术语“αg蛋白”或“g‑α”表示g蛋白的α亚基。αg蛋白有两个结构域，即gtpase结构域和α螺旋结构域。存在至少20种不同的αg蛋白，它们可以分为以下主要蛋白质家族：g‑αs(已知激活腺苷酸环化酶以增加camp合成)、g‑αi(已知抑制腺苷酸环化酶)、g‑αolf(与嗅觉受体相关)、g‑αt(已知与视紫红质联合在视网膜中转导视觉信号)、g‑αq(已知刺激磷脂酶c)或g‑α12/13家族(已知调节细胞骨架、细胞连接以及与细胞运动相关的其它过程)。在本发明的优选实施方式中，αg蛋白选自于蛋白g‑αi1、g‑αi2、g‑αi3、g‑αo1、g‑αo2、g‑αq、g‑α12、g‑α13、g‑αs、g‑αz、g‑αt1、g‑αt2、g‑α11、g‑α14、g‑α15、g‑α16和g‑αgus，优选选自于蛋白g‑αi1、g‑αi2和g‑αi3。[0055]在本发明的意义中，术语“全αg蛋白”表示结合至gtp或结合至不可水解或可缓慢水解的gtp(根据本发明进行标记或未标记)或结合至gdp的αg蛋白。然后将其称为“结合至gtp的全αg蛋白”、“结合至不可水解或可缓慢水解的gtp的全αg蛋白”或“结合至gdp的全αg蛋白”。全αg蛋白(结合至gdp或结合至gtp)在图1中示出。在本发明的上下文中，使用标记有ret伴侣对的第一成员的不可水解或可缓慢水解的gtp，其能够结合至αg蛋白，这使得能够获得结合至标记有ret伴侣对的第一成员的不可水解或可缓慢水解的gtp的全αg蛋白。[0056]术语“gdp”表示二磷酸鸟苷。[0057]术语“gtp”表示三磷酸鸟苷。[0058]术语“不可水解或可缓慢水解的gtp”表示不水解或极少量水解为gdp的gtp类似物。可以提及例如gtpγs(casno.37589‑80‑3)、gppnhp(casno.148892‑91‑5)或gppcp(casno.10470‑57‑2)。[0059]术语“标记有ret伴侣对的成员的不可水解或可缓慢水解的gtp”或“经标记的不可水解或可缓慢水解的gtp”或“经标记的gtp类似物”表示标记有ret伴侣对的成员的不可水解或可缓慢水解的供体gtp(“gtp‑供体”)或标记有ret伴侣对的成员的不可水解或可缓慢水解的接受体gtp(“gtp‑接受体”)。[0060]在本发明的意义中，术语“空αg蛋白”表示未结合至gtp或gdp或不可水解或可缓慢水解的gtp(根据本发明进行修饰或未修饰)的αg蛋白，特别是未结合至标记有ret伴侣对的成员的不可水解或可缓慢水解的gtp的αg蛋白。空αg蛋白在文献中被描述为处于结合至gdp的全形式和结合至gtp或者不可水解或可缓慢水解的gtp的全形式之间的过渡状态。空αg蛋白在图1中示出。[0061]在本发明的意义中，术语“膜制剂”表示包含携带(或在其表面表达)一种或多种gpcr和一种或多种αg蛋白的细胞膜或细胞膜碎片或模拟细胞膜的人工系统的制剂。因此，术语“膜制剂”包括携带(或在其表面表达)一种或多种gpcr和一种或多种αg蛋白的全细胞、透化全细胞、裂解细胞、纯化细胞膜以及在纳米盘(nanodisk)(也称为“纳米级磷脂双层”)或去污剂混合物中纯化和重构的gpcr/αg蛋白复合物。[0062]术语“抗体”，也称为“免疫球蛋白”，表示由通过链内和链间二硫键相互结合的各约50‑70kda的两条重链(称为h链)和各约25kda的两条轻链(称为l链)组成的异四聚体。每条链由在n端位置的可变区或结构域(轻链称为vl，重链称为vh)和在c端位置的恒定区(由对于轻链称为cl的单个结构域以及对于重链称为ch1、ch2、ch3、ch4的三个或四个结构域组成)组成。每个可变结构域通常包含4个“铰链区”(称为fr1、fr2、fr3、fr4)和3个直接负责结合至抗原的区域，称为“cdr”(称为cdr1、cdr2、cdr3)。[0063]根据本发明的“抗体”可为哺乳动物来源的(例如人或小鼠或骆驼科)、人源化的、嵌合的、重组的。它优选地为由根据本领域技术人员熟悉的技术进行遗传修饰的细胞重组产生的单克隆抗体。抗体可为任何同种型，例如igg、igm、iga、igd或ige，优选igg。[0064]“嵌合抗体”意指其重链和轻链可变区序列属于与轻链和重链恒定区序列不同的物种的抗体。为了本发明的目的，优选重链和轻链可变区序列是鼠源的，而重链和轻链恒定区序列属于非鼠物种。在这方面，对于恒定区，所有非鼠哺乳动物物种都是可用的，特别是人、猴、猪、牛、马、猫、犬或鸟，该列表并非穷举。优选地，根据本发明的嵌合抗体包含人源重链和轻链恒定区序列以及鼠源重链和轻链可变区序列。[0065]“人源化抗体”意指这样的抗体：对于所述抗体，参与抗原识别的区域(高变区或cdr：互补决定区)的一些或全部序列以及有时fr区(框架区)的某些氨基酸是非人源的，而不参与抗原识别的可变区和恒定区的序列是人源的。[0066]“人抗体”是指仅包含人序列(轻链可变区和恒定区以及重链可变区和恒定区两者)的抗体。[0067]“抗体片段”意指通过酶消化获得或通过生物生产获得的包含至少一个二硫键并且能够结合至完整抗体所识别的抗原的免疫球蛋白的任何部分，例如fv、fab、fab'、fab'‑sh、f(ab')2、双抗体(diabodies)、线性抗体(也称为“单结构域抗体”或sdab、或纳米抗体(nanobodies))、具有单链的抗体(例如scfv)。胃蛋白酶对免疫球蛋白的酶消化产生分裂成数个肽的fc片段和f(ab')2片段。f(ab')2由通过链间二硫键结合的两个fab'片段形成。fab部分由可变区以及结构域ch1和cl组成。fab'片段由fab区和铰链区组成。fab'‑sh指其中的铰链区的半胱氨酸残基带有游离硫醇基团的fab'片段。[0068]术语“亲和力”是指分子(例如抗体或抗体片段)与被识别的抗原(例如诸如αg蛋白的抗原)之间的所有非共价相互作用的强度。亲和力通常由解离常数(kd)表示。解离常数(kd)可以通过公知的方法(例如通过fret或spr)测量。[0069]在本发明的意义中，“同一性”或“同源性”是通过比较在比较窗口中比对的两个序列来计算的。序列的比对使得可以确定比较窗口中两个序列的共同位置(核苷酸或氨基酸)的数量。因此，将共同位置的数量除以比较窗口中的位置总数并乘以100以获得同一性百分比。可以手动或使用公知的软件来实施序列同一性百分比的确定。[0070]在本发明的具体实施方式中，同一性或同源性对应于氨基酸残基的至少一个置换，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个置换，优选为保守地进行的氨基酸残基的至少一个置换。“保守地进行的氨基酸残基的置换”由将氨基酸残基替换为侧链具有相似特性的另一氨基酸残基组成。侧链具有相似性质的氨基酸家族是公知的，可以提及例如碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、极性和不带电荷的侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β‑支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。[0071]因此，同源抗体或抗体片段或“抗体或抗体片段的变体”(即具有相同功能的抗体或抗体片段)具有某些氨基酸，所述氨基酸可以在恒定区和/或可变区水平被其它氨基酸置换，而不会失去抗原结合能力。优选在编码抗体或抗体片段的dna序列内进行这种置换，即置换实质上是保守的。本领域技术人员利用其一般知识来确定可进行的置换的数量及其定位，以能够保留抗体或抗体片段的功能。为了确定抗体或抗体片段的一种或多种变体特异性结合至抗原的能力，可以使用本领域技术人员熟悉以及在现有技术中描述的数种合适的方法。因此，抗体或抗体片段可以通过结合方法(例如elisa方法)、亲和层析方法等进行测定。抗体或抗体片段的变体可以例如通过“噬菌体展示”方法产生，使得能够产生噬菌体文库。已知用于产生“噬菌体展示”文库和用于靶向具有所需功能特性的抗体或抗体片段的变体的大量方法。[0072]有利地，在本发明的上下文中使用的抗体或抗体片段结合至蛋白gαi、gαo和/或gαz，例如，它结合至蛋白gαi1、蛋白gαi2和/或蛋白gαi3。人源αi1g蛋白的同种型1的标识符为uniprotp63096‑1，同种型2的标识符为uniprotp63096‑2。编码人源αi1g蛋白的基因以名称“gnai1”而被知晓(基因id:2770，ncbi)。[0073]在本发明的意义中，术语“能够调控gpcr激活的分子”表示能够激活或能够抑制gpcr并因此能够诱导或能够防止来自细胞外部的信号通过gpcr转导至细胞内部的分子。它可为激动剂、拮抗剂、反向激动剂、正变构调控剂(allostericmodulator)或负变构调控剂。[0074]在本发明的意义中，术语“待测分子”是可能调控gpcr激活的分子。[0075]在本说明书中，未进一步详细说明的术语“分子”表示术语“能够调控gpcr激活的分子”和“待测分子”两者。[0076]术语“ret”(来自英文“共振能量转移”)表示能量转移技术。[0077]术语“fret”(来自英文“荧光共振能量转移”)表示两个荧光分子之间的能量转移。fret被定义为由能量供体和能量接受体之间的偶极‑偶极相互作用引起的非辐射能量转移。这种物理现象要求这些分子之间具有能量兼容性。这意味着供体的发射光谱必须至少部分地覆盖接受体的吸收光谱。与理论一致，fret是取决于分隔供体和接受体两个分子之间的距离的过程：当这些分子彼此靠近时，将发出fret信号。[0078]术语“bret”(“生物发光共振能量转移”)表示生物发光分子和荧光分子之间的能量转移。[0079]在本发明的意义中，术语“配体”表示能够结合至靶分子的分子。在本发明的上下文中，靶分子是结合至标记有ret伴侣对的第一成员的不可水解或可缓慢水解的gtp的全αg蛋白。在本发明的上下文中，配体必须能够结合至全αg蛋白，所述全αg蛋白结合至标记有ret伴侣对的第一成员的不可水解或可缓慢水解的gtp。然而，配体不必对结合至标记有ret伴侣对的第一成员的不可水解或可缓慢水解的gtp的全αg蛋白具有特异性。因此，在本发明的上下文中使用的配体还能够结合至以下蛋白：结合至gdp的αg蛋白、结合至gtp的αg蛋白、结合至未标记的不可水解或可缓慢水解的gtp的αg蛋白，或者甚至能够结合至空αg蛋白。配体可为蛋白质性质的(例如蛋白质或肽)或核苷酸性质的(例如dna或rna)。在本发明的上下文中，配体有利地选自于抗体、抗体片段、肽或适体，优选抗体或抗体片段。在本发明的上下文中，配体可以通过本领域技术人员熟悉的方法直接或间接标记，例如如下文所述，但优选配体通过共价结合至ret伴侣对的成员而直接标记。[0080]术语“ret伴侣对”表示由能量供体化合物(以下称为“供体化合物”)和能量接受体化合物(以下称为“接受体化合物”)组成的对；当它们彼此靠近并且在供体化合物的激发波长下被激发时，这些化合物发出ret信号。已知对于成为ret伴侣的两种化合物，供体化合物的发射光谱必须部分覆盖接受体化合物的激发光谱。例如，在使用荧光供体化合物和接受体化合物时，将其称为“fret伴侣对”；或者在使用生物发光供体化合物和接受体化合物时，将其称为“bret伴侣对”。[0081]术语“ret信号”表示代表供体化合物和接受体化合物之间的ret的任何可测量信号。例如，fret信号因此可为荧光供体化合物或接受体化合物(在后者具有荧光性时)的强度或发光寿命的变化。[0082]术语“容器”表示适合于将膜制剂与进行根据本发明的方法所需的试剂进行混合的板的孔、试管或任何其它容器。[0083]本发明涉及用于确定分子调控g蛋白偶联受体(gpcr)激活的能力的方法，所述方法包括以下步骤：[0084]a)在第一容器中引入以下物质：[0085]‑携带一种或多种gpcr和一种或多种αg蛋白的膜制剂，[0086]‑标记有ret伴侣对的第一成员的不可水解或可缓慢水解的gtp源，[0087]‑标记有ret伴侣对的第二成员的g蛋白的α亚基(αg蛋白)的配体，所述配体能够结合至全αg蛋白，所述全αg蛋白结合至标记有ret伴侣对的第一成员的不可水解或可缓慢水解的gtp，[0088]‑任选的gpcr激动剂；[0089]b)测量第一容器中发出的ret信号；[0090]c)(i)在第二容器中引入与步骤a)中相同的试剂和待测分子，或(ii)在第一容器中引入待测分子；[0091]d)测量在步骤c)中获得的第一容器中或第二容器中发出的ret信号；[0092]e)比较在步骤b)和步骤d)中获得的信号，在步骤d)中获得的信号相对于在步骤b)中获得的信号存在调控表明待测分子能够调控gpcr激活。[0093]在进行根据本发明的方法时，除了经标记的不可水解或可缓慢水解的gtp之外，没有必要添加gtp源。有利地，在进行根据本发明的方法时，除了经标记的不可水解或可缓慢水解的gtp之外，不添加其它gtp源。[0094]在进行根据本发明的方法时也没有必要添加gdp源。然而，在进行根据本发明的方法时，例如在步骤a)中，可以容忍少量的gdp。在格式1a和格式1b(图2a和图2b)中，有利地，在进行根据本发明的方法时，不添加gdp源。在格式2a和格式2b(图2c和图2d)中，添加gdp可允许更好地区分不含激动剂的条件和含有激动剂的条件之间的信号。[0095]步骤a)[0096]步骤a)包括在第一容器中引入以下三种或四种要素：[0097]‑携带一种或多种gpcr和一种或多种αg蛋白的膜制剂，[0098]‑标记有ret伴侣对的第一成员的不可水解或可缓慢水解的gtp源，[0099]‑标记有ret伴侣对的第二成员的g蛋白的α亚基(αg蛋白)的配体，所述配体能够结合至全αg蛋白，所述全αg蛋白结合至标记有ret伴侣对的第一成员的不可水解或可缓慢水解的gtp，以及[0100]‑任选的gpcr激动剂。[0101]有利地，不可水解或可缓慢水解的gtp选自于gtpgammas(gtpγs或gtpgs)、gppnhp和gppcp。gtpγs必须标记在第三个磷酸(γ磷酸)以外的位置。三种或四种要素可以以任何顺序依次引入容器中，或者同时或准同时地(quasi‑simultaneously)引入容器中。混合三种要素使得可以获得适合进行ret的反应溶液。其它要素也可以添加到容器中以调节用于进行ret的溶液。例如，可以添加腔肠素h(苄基腔肠素)或双脱氧腔肠素(deepbluectm)或双脱氢腔肠素(腔肠素‑400a)或d‑萤光素。[0102]在第一具体实施方式中，αg蛋白的配体特异性结合至αg蛋白的switchii结构域，特别是结合至αg蛋白的肽215‑294。例如，αg蛋白选自于g‑αi1、g‑αi2和g‑αi3，并且αg蛋白的配体为序列ser‑ser‑arg‑gly‑tyr‑tyr‑his‑gly‑lle‑trp‑val‑gly‑glu‑glu‑gly‑arg‑leu‑ser‑arg(seqidno:1)的肽kb1753。[0103]在第二具体实施方式中，αg蛋白选自于g‑αi1、g‑αi2和g‑αi3，并且αg蛋白的配体与肽kb1753(seqidno:1)竞争结合至所述αg蛋白。配体与肽kb1753(seqidno:1)竞争结合至所述αg蛋白的能力可通过竞争方法进行测试。[0104]“竞争方法”由以下组成：测试αg蛋白的配体阻断肽kb1753(seqidno:1)与αg蛋白之间的结合的能力、或者与肽kb1753(seqidno:1)竞争结合至αg蛋白的能力。换言之，与肽kb1753(seqidno:1)竞争结合至αg蛋白的αg蛋白的配体结合至与肽kb1753(seqidno:1)相同的表位或结合至与由肽kb1753(seqidno:1)识别的表位足够接近的表位，以由于空间位阻的原因而防止αg蛋白的配体的结合。许多类型的竞争方法可用于确定αg蛋白的配体是否与肽kb1753(seqidno:1)竞争，例如通过elisa测定法。例如，elisa竞争方法涉及使用结合至固体表面或细胞的纯化αg蛋白、结合至αg蛋白的待测αg蛋白的配体以及经标记的肽kb1753。通常，参考肽kb1753(seqidno:1)以非饱和浓度(相对于其对αg蛋白的解离常数kd)使用，并在不存在或存在浓度增加的待测αg蛋白的配体的情况下测量信号。当感兴趣的αg蛋白的配体过量存在时，它可以将肽kb1753(seqidno:1)对αg蛋白的特异性结合阻断至少40％‑45％、45％‑50％、50％‑55％、55％‑60％、60％‑65％、65％‑70％、70％‑75％或75％以上。在某些情况下，结合被阻断至少80％‑85％、85％‑90％、90％‑95％、95％‑97％或97％以上。[0105]竞争方法的另一实例可以使用tr‑fret。例如，tr‑fret涉及使用经纯化并带标签的αg蛋白、能够结合在αg蛋白的标签上的标记有tr‑fret伴侣对的第一成员(有利地为供体)的抗标签配体(有利地为抗体)、标记有tr‑fret伴侣对的第二成员(有利地为接受体，通过用肽上的生物素和链霉亲和素‑接受体进行间接标记的方法)的肽kb1753(seqidno:1)以及待测αg蛋白的配体。通常，肽kb1753(seqidno:1)以非饱和浓度(相对于其对αg蛋白的解离常数kd)使用，并在不存在或存在浓度增加的待测αg蛋白的配体的情况下测量tr‑fret信号。当测定感兴趣的αg蛋白的配体时，它可以将肽kb1753(seqidno:1)对αg蛋白的特异性结合阻断至少40％‑45％、45％‑50％、50％‑55％、55％‑60％、60％‑65％、65％‑70％、70％‑75％或75％以上。在某些情况下，结合被阻断至少80％‑85％、85％‑90％、90％‑95％、95％‑97％或97％以上。如果所测试的αg蛋白的配体抑制肽kb1753(seqidno:1)的结合，则抑制的正构(orthosteric)特性(与变构抑制相反)可以通过schild‑plot实验证实，schild‑plot实验由以下组成：在不存在或存在浓度增加的αg蛋白的配体的情况下，测量经标记的肽kb1753(seqidno:1)对αg蛋白的解离常数(kd)。如果当αg蛋白的配体浓度增加时kd以线性且非饱和的方式变化，则抑制是正构的(即肽kb1753(seqidno:1)和αg蛋白的配体结合在αg蛋白的相同表位上)。如果当αg蛋白的配体浓度增加时kd以非线性且可饱和的方式变化，则抑制是变构的(即肽kb1753(seqidno:1)和配体不结合在αg蛋白的相同表位上)。[0106]αg蛋白的配体可为抗体或抗体片段。[0107]因此，在第三具体实施方式中，αg蛋白的配体是能够结合至αg蛋白的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含：[0108]‑重链可变结构域，所述重链可变结构域包含氨基酸序列seqidno:2的cdr1、氨基酸序列seqidno:3的cdr2和氨基酸序列seqidno:4的cdr3；以及[0109]‑轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含氨基酸序列seqidno:5的cdr1、氨基酸序列dts(即三个氨基酸“aspthrser”，即三个氨基酸天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸)的cdr2和氨基酸序列seqidno:6的cdr3。[0110]能够结合至αg蛋白的抗体或抗体片段的重链可变结构域可以包含：[0111]‑与氨基酸序列seqidno:7具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性或甚至100％同源性的fr1；[0112]‑与氨基酸序列seqidno:8具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性或甚至100％同源性的fr2；[0113]‑与氨基酸序列seqidno:9具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性或甚至100％同源性的fr3；和/或[0114]‑与氨基酸序列seqidno:10具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性或甚至100％同源性的fr4。[0115]能够结合至αg蛋白的抗体或抗体片段的轻链可变结构域可以包含：[0116]‑与氨基酸序列seqidno:11具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性或甚至100％同源性的fr1；[0117]‑与氨基酸序列seqidno:12具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性或甚至100％同源性的fr2；[0118]‑与氨基酸序列seqidno:13具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性或甚至100％同源性的fr3；和/或[0119]‑与氨基酸序列seqidno:14具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性或甚至100％同源性的fr4。[0120]在能够结合至αg蛋白的抗体或抗体片段的具体实施方式中：[0121]·重链可变结构域包含：[0122]‑氨基酸序列seqidno:7的fr1(即与氨基酸序列seqidno:7具有100％同源性)，[0123]‑氨基酸序列seqidno:8的fr2，[0124]‑氨基酸序列seqidno:9的fr3，和[0125]‑氨基酸序列seqidno:10的fr4；以及[0126]·轻链可变结构域包含：[0127]‑氨基酸序列seqidno:11的fr1，[0128]‑氨基酸序列seqidno:12的fr2，[0129]‑氨基酸序列seqidno:13的fr3，和[0130]‑氨基酸序列seqidno:14的fr4。[0131]在能够结合至αg蛋白的抗体或抗体片段的具体实施方式中，重链可变结构域可与氨基酸序列seqidno:15具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性或100％同源性；并且轻链可变结构域可与氨基酸序列seqidno:16具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性或100％同源性。[0132]因此，αg蛋白的配体可为抗体或抗体片段，其中：[0133]‑重链可变结构域与氨基酸序列seqidno:15具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性或100％同源性；[0134]‑轻链可变结构域与氨基酸序列seqidno:16具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，例如至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性或100％同源性；以及‑重链可变结构域的cdr1由氨基酸序列seqidno:2组成，重链可变结构域的cdr2由氨基酸序列seqidno:3组成，重链可变结构域的cdr3由氨基酸序列seqidno:4组成，轻链可变结构域的cdr1由氨基酸序列seqidno:5组成，轻链可变结构域的cdr2由氨基酸序列dts组成，并且轻链可变结构域的cdr3由氨基酸序列seqidno:6组成。[0135]有利地，αg蛋白的配体为抗体或抗体片段，其中，重链可变结构域由氨基酸序列seqidno:15组成(即重链可变结构域与氨基酸序列seqidno:15具有100％同源性)，并且轻链可变结构域由氨基酸序列seqidno:16组成。[0136]以参考号dsv36s在实施例中描述的抗体(dsv抗体可根据要求从cisbiobioassays获得)包含由氨基酸序列seqidno:15组成的重链可变结构域和由氨基酸序列seqidno:16组成的轻链可变结构域。[0137]根据上述第三具体实施方式的能够结合至αg蛋白的抗体或抗体片段在下文第四具体实施方式中称为“参考抗体或抗体片段”。[0138]在第四具体实施方式中，αg蛋白的配体为与参考抗体或抗体片段竞争结合至αg蛋白的抗体或抗体片段，下文称为“竞争抗体或抗体片段”。[0139]抗体或抗体片段与参考抗体或抗体片段竞争结合至αg蛋白的能力可以通过竞争方法来测试。“竞争方法”由以下组成：测试抗体(或抗体片段)阻断参考抗体或抗体片段与抗原之间的结合的能力、或者与参考抗体或抗体片段竞争结合至抗原的能力。换言之，与参考抗体或抗体片段竞争的抗体结合至与参考抗体或抗体片段相同的表位或结合至与由参考抗体或抗体片段识别的表位足够接近的表位，以由于空间位阻的原因而防止参考抗体或抗体片段的结合。[0140]许多类型的竞争方法可用于确定抗体或抗体片段是否与参考抗体或抗体片段竞争，例如：通过竞争elisa测定法、通过直接或间接夹心法、通过直接或间接固相放射免疫测定法(ria)、通过直接或间接固相酶免疫测定法(eia)等。例如，竞争elisa方法涉及使用结合至固体表面或细胞的纯化抗原、结合至未标记的抗原的待测抗体以及经标记的参考抗体或抗体片段。通常，参考抗体或抗体片段以非饱和浓度(相对于其对αg蛋白的解离常数kd)存在，并在浓度增加的被测抗体或抗体片段下测量信号。当抗体过量存在时，它可以将参考抗体或抗体片段对抗原的特异性结合阻断或抑制(例如降低)至少40％‑45％、45％‑50％、50％‑55％、55％‑60％、60％‑65％、65％‑70％、70％‑75％或75％以上。在某些情况下，结合被抑制至少80％‑85％、85％‑90％、90％‑95％、95％‑97％或97％以上。[0141]在根据本发明的方法中使用的竞争抗体或抗体片段可例如通过进行实施例26中描述的方案与参考抗体或抗体片段一起获得。以参考号dsv38s在实施例中描述的抗体(dsv抗体可根据要求从cisbiobioassays获得)是可在根据本发明的方法中使用的竞争抗体。[0142]上文定义的参考抗体或抗体片段和竞争抗体或抗体片段在下文中统称为“在根据本发明的方法中使用的抗体或抗体片段”。[0143]在根据本发明的方法中使用的抗体或抗体片段可结合至分离形式的αg蛋白和/或存在于膜环境中的αg蛋白，例如它可结合至存在于由携带一种或多种gpcr和一种或多种αg蛋白的膜制成的制剂中的αg蛋白。因为根据本发明的抗体能够结合至αg蛋白，αg蛋白不必与gpcr复合。[0144]在根据本发明的方法中使用的抗体或抗体片段可以以在fret中测量的小于或等于20nm的解离常数(kd)结合至αg蛋白。低于20nm的解离常数对于恰当执行ret而言是优选的。有利地，在根据本发明的方法中使用的抗体或抗体片段可以以在fret中测量的小于或等于20nm的解离常数(kd)结合至αg蛋白，例如小于或等于10nm或者小于或等于5nm的亲和常数，例如0‑20nm(不包括0)、0‑10nm(不包括0)、0‑5nm(不包括0)。实施例27中描述了在fret中测量根据本发明的抗体或抗体片段的kd的方法。[0145]在根据本发明的方法中使用的抗体或抗体片段特别有利于进行根据本发明的方法。[0146]例如，在根据本发明的方法中使用的抗体或抗体片段可通过进行实施例26中描述的方案获得。[0147]本发明人还表明，在根据本发明的方法中使用的抗体或抗体片段结合至αg蛋白的switchii结构域，更具体地结合至αg蛋白的肽215‑294。[0148]第一容器可以任选地包含gpcr激动剂。gpcr激动剂在文献中被广泛描述，例如在申请wo2011/018586的表1中。[0149]步骤b)[0150]步骤b)包括测量第一容器(即在步骤a)中获得的容器)中发出的ret信号。测量的信号对应于在不存在待测分子的情况下在容器中获得的信号。可以通过本领域技术人员熟悉的常规方法进行测量并且不会造成任何特定问题。通常使用能够检测和测量ret信号的设备，例如在tr‑fret或生物发光读取模式下的pherastarfs酶标仪(bmglabtech)。[0151]步骤c)[0152]在一个实施方式中，步骤c)包括在第二容器中引入与步骤a)中相同的试剂和待测分子。有利地，以与第一容器相同的方式制备第二容器，不同之处仅在于在第二容器中存在待测分子。该实施方式是有利的，因为它使得能够同时测量第一容器中和第二容器中发出的ret信号。该实施方式还使得能够同时测量一个或多个第二容器中发出的ret信号。因此，该实施方式特别有利，因为它使得能够平行测试数个不同的分子。[0153]在另一实施方式中，步骤c)包括在第一容器中引入待测分子。该实施方式具有仅使用一个容器来进行根据本发明的方法的优点。[0154]步骤d)[0155]步骤d)包括测量在步骤c)中获得的第一容器中或第二容器中发出的ret信号。测量的信号对应于在存在待测分子的情况下在容器中获得的信号。如在步骤b)中，可以通过本领域技术人员熟悉的常规方法进行测量并且不会造成任何特定问题。通常使用能够检测和测量ret信号的设备，例如在tr‑fret或生物发光读取模式下的pherastarfs酶标仪(bmglabtech)。[0156]步骤e)[0157]步骤e)包括比较在步骤b)和步骤d)中获得的信号，在步骤d)中获得的信号相对于在步骤b)中获得的信号存在调控表明待测分子能够调控gpcr激活。信号的调控可为信号的增加或信号的减少。[0158]本领域技术人员可以容易地比较步骤b)和步骤d)中的信号，并定义允许其对调控进行评定(qualify)的阈值，例如信号之间的差异大于5％、大于10％、大于15％、大于20％或大于25％。例如，可以计算步骤b)和步骤d)中的信号之间的比。通常，对于给定的ret伴侣对，信号之间的差异越大，信号之间的比就越大，并且对gpcr激活的调控(例如激活或抑制)就越大。然而，信号之间的差异可能会根据用于进行根据本发明的方法的ret伴侣对而变化。gpcr激活的调控水平使得能够对在一定程度上属于激动剂、拮抗剂、反向激动剂、正变构调控剂或负变构调控剂的分子进行鉴定。[0159]在第一具体实施方式中，第一容器不包含gpcr激动剂，并且在步骤e)中，在步骤d)中获得的信号相对于在步骤b)中获得的信号存在降低表明待测分子为gpcr激动剂。[0160]在第二具体实施方式中，第一容器包含gpcr激动剂，并且在步骤e)中：[0161]‑在步骤d)中获得的信号相对于在步骤b)中获得的信号存在增加表明待测分子为gpcr的拮抗剂或负变构调控剂；[0162]‑在步骤d)中获得的信号相对于在步骤b)中获得的信号存在降低表明待测分子为gpcr的激动剂或正变构调控剂。[0163]在第三具体实施方式中，第一容器不包含gpcr激动剂，并且在步骤e)中，在步骤d)中获得的信号相对于在步骤b)中获得的信号存在增加表明待测分子为gpcr激动剂。[0164]在第四具体实施方式中，第一容器包含gpcr激动剂，并且在步骤e)中：[0165]‑在步骤d)中获得的信号相对于在步骤b)中获得的信号存在降低表明待测分子为gpcr的拮抗剂或负变构调控剂；[0166]‑在步骤d)中获得的信号相对于在步骤b)中获得的信号存在增加表明待测分子为gpcr的激动剂或正变构调控剂。[0167]用ret伴侣对的成员标记配体[0168]可以直接或间接标记配体。[0169]可以基于配体上反应基团的存在通过本领域技术人员已知的常规方法用ret伴侣对的成员(例如在进行fret时为荧光化合物)直接标记配体。例如，当配体是抗体或抗体片段时，可以使用以下反应基团：末端氨基基团、天冬氨酸和谷氨酸的羧酸基团、赖氨酸的胺基团、精氨酸的胍基团、半胱氨酸的硫醇基团、酪氨酸的酚基基团、色氨酸的吲哚环、甲硫氨酸的硫醚基团、组氨酸的咪唑基团。[0170]反应基团可以与配体所携带的反应基团形成共价键。配体所携带的合适的反应基团是本领域技术人员熟悉的，例如用马来酰亚胺基团官能化的供体化合物或接受体化合物将能够例如共价结合至蛋白质或肽(例如抗体或抗体片段)所携带的半胱氨酸所携带的硫醇基团。类似地，携带n‑羟基琥珀酰亚胺酯的供体化合物/接受体化合物将能够共价结合至蛋白质或肽中存在的胺。[0171]配体也可以间接标记有荧光化合物或生物发光化合物，例如通过将自身共价结合至接受体化合物/供体化合物的抗体或抗体片段引入测量介质中，该第二抗体或抗体片段特异性识别配体。[0172]另一种非常经典的间接标记方法包括将生物素固定在待标记的配体上，然后在存在标记有接受体化合物/供体化合物的链霉亲和素的情况下孵育该生物素化配体。合适的生物素化配体可通过本领域技术人员熟悉的技术制备；cisbiobioassays公司例如以商品名“d2”(ref.610sadla)销售标记有荧光团的链霉亲和素。[0173]在本发明的上下文中，配体标记有(i)荧光供体化合物或发光供体化合物；或(ii)荧光接受体化合物或非荧光接受体化合物(淬灭剂)。优选地，配体标记有荧光接受体化合物或非荧光接受体化合物(淬灭剂)。[0174]用ret伴侣对的成员标记不可水解或可缓慢水解的gtp[0175]可以直接或间接标记不可水解或可缓慢水解的gtp。优选地，直接标记不可水解或可缓慢水解的gtp。[0176]可以通过基于不可水解或可缓慢水解的gtp上反应基团的存在的方法进行用ret伴侣对的成员(例如在进行fret时为荧光化合物)对不可水解或可缓慢水解的gtp的直接标记。[0177]反应基团可以与ret伴侣对的成员所携带的反应基团形成共价键。ret伴侣对的成员所携带的合适的反应基团是本领域技术人员熟悉的，例如用马来酰亚胺基团官能化的供体化合物或接受体化合物将能够例如共价结合至硫醇基团。类似地，携带n‑羟基琥珀酰亚胺酯的供体化合物/接受体化合物将能够共价结合至胺。[0178]在本发明的上下文中，不可水解或可缓慢水解的gtp标记有(i)荧光供体化合物；或(ii)荧光接受体化合物或非荧光接受体化合物(淬灭剂)。优选地，不可水解或可缓慢水解的gtp标记有荧光供体化合物。[0179]在具体实施方式中，不可水解或可缓慢水解的gtp标记有荧光供体化合物，并且αg蛋白的配体标记有荧光接受体化合物或非荧光接受体化合物(淬灭剂)。在另一具体实施方式中，不可水解或可缓慢水解的gtp标记有荧光接受体化合物或非荧光接受体化合物(淬灭剂)，并且αg蛋白的配体标记有荧光供体化合物或发光供体化合物。[0180]用于进行fret的标记[0181]在具体实施方式中，配体和不可水解或可缓慢水解的gtp各自标记有fret伴侣对的成员，即荧光能量供给化合物或荧光能量接受化合物。[0182]选择用于获得fret信号的fret伴侣对在本领域技术人员的能力范围内。例如，可用于研究fret现象的供体‑接受体对在josephr.lakowicz的工作(principlesoffluorescencespectroscopy，第2版，338)中特别描述，本领域技术人员可以加以参考。[0183]荧光供体化合物[0184]长寿命(>0.1ms，优选在0.5ms至6ms范围内)的荧光能量供给化合物，特别是镧系元素配合物(complexes)(即稀土元素的螯合物、大环化合物或穴状化合物)是有利的，因为它们使得能够进行时间分辨测量，即测量tr‑fret(时间分辨fret)信号，消除测量介质所发出的大部分背景噪声。由于这个原因，通常它们对于实施根据本发明的方法而言是优选的。有利地，这些化合物为镧系元素配合物。这些配合物(例如螯合物或穴状化合物)特别适合作为能量供给fret对的成员。[0185]铕(eu3 )、铽(tb3 )、镝(dy3 )、钐(sm3 )、钕(nd3 )、镱(yb3 )或铒(er3 )的配合物也是适用于本发明目的的稀土元素配合物，特别优选铕(eu3 )和铽(tb3 )的配合物。[0186]已经描述了大量稀土元素配合物，并且数种目前由perkinelmer、invitrogen和cisbiobioassays公司销售。[0187]适于本发明目的的稀土元素螯合物或穴状化合物的实例为：[0188]‑包含一个或多个吡啶单元的镧系元素穴状化合物。此类稀土元素穴状化合物描述于例如专利ep0180492、ep0321353、ep0601113和国际申请wo01/96877中。铽(tb3 )和铕(eu3 )的穴状化合物特别适用于本发明的目的。镧系元素穴状化合物由cisbiobioassays公司销售。作为非限制性实例，可以提及具有下式的铕穴状化合物(其可通过反应基团偶联至待标记的化合物，此处反应基团例如为nh2基团)：[0189][0190][0191]‑专利us4761481、us5032677、us5055578、us5106957、us5116989、us4761481、us4801722、us4794191、us4637988、us4670572、us4837169、us4859777中具体描述的镧系元素螯合物。专利ep0403593、us5324825、us5202423、us5316909描述了由九齿(nonadentate)配体(例如三联吡啶)形成的螯合物。镧系元素螯合物由perkinelmer公司销售。[0192]‑也可使用由螯合剂(例如四氮杂环十二烷)形成的镧系元素配合物，其被含芳环的发色团取代，例如pooler.等在biomol.chem,2005,3,1013‑1024“synthesisandcharacterisationofhighlyemissiveandkineticallystablelanthanidecomplexessuitableforusageincellulo”中所描述的那些。也可使用申请wo2009/10580中描述的配合物。[0193]‑也可使用专利ep1154991和ep1154990中描述的镧系元素穴状化合物。[0194]‑下式的铽穴状化合物(其可通过反应基团偶联至待标记的化合物，此处反应基团例如为nh2基团)：[0195][0196]其合成描述于国际申请wo2008/063721中(化合物6a，第89页)。[0197]‑来自lumiphore公司的铽穴状化合物lumi4‑tb，由cisbiobioassays销售。[0198]‑来自researchorganics公司的下式的量子染料(其可通过反应基团偶联至待标记的化合物，此处反应基团为ncs)：[0199][0200]‑钌螯合物，特别是由钌离子和数个联吡啶形成的配合物，例如钌(ii)三(2,2'‑联吡啶)。[0201]‑下式的铽螯合物dtpa‑cs124tb，由lifetechnologies公司销售(其可通过反应基团r偶联至待标记的化合物)，其合成描述于美国专利us5622821中。[0202][0203]‑下式的铽螯合物，由latva等描述(journalofluminescence1997,75(2):149‑169)：[0204][0205]有利地，荧光供体化合物为选自于以下化合物中的fret伴侣：铕穴状化合物、铕螯合物、铽螯合物、铽穴状化合物、钌螯合物、量子点、别藻蓝蛋白、罗丹明、花青素(cyanins)、方酸菁(squaraines)、香豆素、原黄素(proflavins)、吖啶、荧光素(fluoresceins)、硼‑二吡咯亚甲基衍生物和硝基苯并噁二唑。[0206]特别有利地，荧光供体化合物为选自于以下化合物中的fret伴侣：铕穴状化合物、铕螯合物、铽螯合物、铽穴状化合物、钌螯合物和量子点；特别优选铕和铽的螯合物和穴状化合物。[0207]可用于本发明的fret方法的标记有荧光供体化合物的不可水解或可缓慢水解的gtp由以下通式(1)和(2a、2b、2c)表示：[0208][0209]gtp类似物的标记可以在gtp的不同位置进行：[0210]‑在磷酸酯的γ位置(o、nh、ch2)；或[0211]‑在核糖的2'和3'位置[0212]在具体实施方式中，可用于本发明的fret方法的标记有荧光供体化合物的不可水解或可缓慢水解的gtp由通式(i)表示：[0213][0214]其中：[0215]x＝o、nh或ch2；[0216]y＝o、nh或ch2；[0217]l为二价接头；[0218]ln3 为镧系元素配合物，任选地携带反应基团g3。[0219]“镧系元素配合物”是指能够配合镧系元素家族的原子的螯合物、大环化合物、穴状化合物或任何有机物质，镧系元素(ln)选自于：eu、sm、tb、gd、dy、nd、er；优选镧系元素为tb、sm或eu；甚至更优选为eu或tb。[0220]y＝o的化合物称为gtp‑γ‑o类似物。y＝nh的化合物称为gtp‑γ‑n类似物。y＝ch2的化合物称为gtp‑γ‑c类似物。[0221]二价接头l有利地选自于：[0222]‑直接键合；[0223]‑直链或支链c1‑c20(优选c1‑c8)亚烷基基团，任选地含有一个或多个双键或三键；[0224]‑c5‑c8亚环烷基基团；或[0225]‑c6‑c14亚芳基基团；[0226]所述亚烷基、亚环烷基或亚芳基基团任选地含有一个或多个杂原子(例如氧、氮、硫、磷)或一个或多个氨基甲酰基或甲酰胺基(carboxamido)基团，所述亚烷基、亚环烷基或亚芳基基团任选地被1个至5个、优选1至3个c1‑c8烷基、c6‑c14芳基、磺酸酯或氧代(oxo)基团取代。[0227]甚至更有利地，二价接头l选自于以下基团：[0228][0229][0230]其中，n、m、p、q为1至16的整数，优选1至5；并且e为1至6的整数，优选1至4。[0231]相当有利地，二价接头l选自于直接键合、直链或支链c1‑c8亚烷基基团或下式的基团：[0232][0233]二价接头l优选地选自于：[0234]‑(ch2)n‑；‑(ch2)n‑o‑(ch2)m‑o‑(ch2)p‑；[0235]基团‑(ch2)n‑是相当特别优选的。[0236]基团l也可以有利地为下式的基团：[0237][0238]其中，m、n和p为1至16的整数，优选1至5。[0239]反应基团g3选自于以下基团之一：丙烯酰胺、任选活化的胺(例如尸胺或乙二胺)、活化的酯、醛、卤代烷、酸酐、苯胺、叠氮化物、氮丙啶、羧酸、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪(例如一氯三嗪、二氯三嗪)、肼(包括酰肼)、亚胺酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、磺酰卤化物、硫醇、酮、酰卤、琥珀酰亚胺酯、羟基琥珀酰亚胺酯、羟基磺基琥珀酰亚胺酯、叠氮硝基苯基、叠氮苯基、3‑(2‑吡啶基二硫)‑丙酰胺、乙二醛、三嗪、乙炔基团，特别是选自于具有下式的基团中的基团：[0240][0241]其中，w从0到8变化；v等于0或1；ar是具有5个或6个环成员的饱和或不饱和杂环，含有1个至3个杂原子，任选地被卤素原子取代。[0242]优选地，反应基团g3选自于胺(任选地以‑nhboc形式受保护)、琥珀酰亚胺酯、羟基琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、肼、卤代三嗪、异硫氰酸酯、马来酰亚胺基团或羧酸(任选地以基团‑co2me、‑co2tbu的形式受保护)。在后一种情况下，酸必须活化为酯形式，以能够与亲核物质反应。镧系元素配合物ln3 有利地选自于以下给出的配合物之一：[0243][0244][0245][0246][0247][0248][0249][0250][0251]有利地，镧系元素配合物ln3 选自于配合物c1至c17、c24至c32和c36至c44之一。更有利地，镧系元素配合物ln3 选自于配合物c1至c17和c36至c44之一。甚至更有利地，镧系元素配合物ln3 选自于配合物c1至c17之一。甚至更有利地，镧系元素配合物ln3 选自于配合物c1至c4和c11至c17之一。甚至更有利地，镧系元素配合物ln3 选自于配合物c1至c4和c11之一。非常有利地，镧系元素配合物ln3 为配合物c2或配合物c3。[0252]上述gtp类似物的制备在文献中或在2019年1月30日提交的编号为fr1900856的法国专利申请中有所描述。[0253]有利地，标记有荧光供体化合物的gtp类似物可以选自于如下所展示的gtpgn‑c2(gtp‑γ‑n‑c2)、gtpgn‑c3(gtp‑γ‑n‑c3)、gtpgn‑辛基‑c2(gtp‑γ‑n‑辛基‑c2)、gtpgn‑辛基‑c11(gtp‑γ‑n‑辛基‑c11)、gtpgn‑辛基‑c3(gtp‑γ‑n‑辛基‑c3)、gtpgo‑己基‑c2(gtp‑γ‑o‑己基‑c2)、gtpgo‑己基‑c3(gtp‑γ‑o‑己基‑c3)或gtp‑gn‑辛基‑硫代琥珀酰亚胺基‑c2(gtp‑γ‑n‑辛基‑硫代琥珀酰亚胺基‑c2)。[0254][0255][0256]在特别优选的实施方式中，标记有荧光供体化合物的gtp类似物是gtp‑gn‑辛基‑硫代琥珀酰亚胺基‑c2。[0257]荧光接受体化合物[0258]荧光接受体化合物可选自于以下组：别藻蓝蛋白，尤其是已知的商品名为xl665的别藻蓝蛋白；发光有机分子，例如罗丹明、花青素(例如cy5)、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硼‑二吡咯亚甲基衍生物(以名称“bodipy”出售)、名称为“atto”的荧光团、名称为“dy”的荧光团、名称为“alexa”的化合物、硝基苯并噁二唑。有利地，荧光接受体化合物选自于别藻蓝蛋白、罗丹明、花青素、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硼‑二吡咯亚甲基衍生物、硝基苯并噁二唑。[0259]表述“花青素”和“罗丹明”分别应理解为“花青素衍生物”和“罗丹明衍生物”。本领域技术人员熟悉这些各种可商购的荧光团。[0260]“alexa”化合物由invitrogen公司出售；“atto”化合物由attotec公司出售；“dy”化合物由dyomics公司出售；“cy”化合物由amershambiosciences公司出售；其它化合物由各种化学试剂供应商(例如sigmaaldrich或acros公司)出售。[0261]也可以将以下荧光蛋白用作荧光接受体化合物：青色荧光蛋白(amcyan1、midori‑ishicyan、mtfp1)，绿色荧光蛋白(egfp、acgfp、turbogfp、emerald、azamigreen、zsgreen)，黄色荧光蛋白(eyfp、topaz、venus、mcitrine、ypet、phiyfp、zsyellow1、mbanana)，橙色和红色荧光蛋白(orangekusibari、morange、tdtomato、dsred、dsred2、dsred‑express、dsred‑monomer、mtangerine、asred2、mrfp1、jred、mcherry、mstrawberry、hcred1、mraspberry、hcred‑tandem、mplim、aq143)，远红外荧光蛋白(mkate、mkate2、tdkatushka2)。[0262]有利地，对于αg蛋白的配体，荧光接受体化合物为选自于以下化合物中的fret伴侣：别藻蓝蛋白，罗丹明，花青素，方酸菁，香豆素，原黄素，吖啶，荧光素，硼‑二吡咯亚甲基衍生物，硝基苯并噁二唑和量子点；gfp，选自于gfp10、gfp2和egfp的gfp变体；yfp，选自eyfp、yfptopaz、yfpcitrine、yfpvenus和ypet的yfp变体；morange；dsred。[0263]有利地，对于经标记的gtp类似物，荧光接受体化合物为选自于以下化合物中的fret伴侣：罗丹明、花青素、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硼‑二吡咯亚甲基衍生物和硝基苯并噁二唑。[0264]可用于本发明的fret方法的标记有荧光接受体化合物的不可水解或可缓慢水解的gtp由以下通式(3)和(4a、4b、4c)表示：[0265][0266]gtp类似物的标记可以在gtp的不同位置进行：[0267]‑在磷酸酯的γ位置(o、nh、ch2)；或[0268]‑在核糖的2'和3'位置。[0269]在具体实施方式中，可用于本发明方法的标记有荧光接受体化合物的不可水解或可缓慢水解的gtp可以选自于gtpgo‑接头‑cy5(p)(gtp‑go‑己基‑cy5diso3‑)(jenabioscience‑nu‑834‑cy5)、gtpgs‑接头‑cy5(r)(gtp‑gs‑eda‑cy5)(jenabioscience‑nu‑1610‑cy5)、gtpgn‑辛基‑af488(gtp‑gn‑辛基‑af488)(cisbiobioassays)、gtpgn‑l18‑荧光素(gtp‑gn‑eda‑戊基‑荧光素)(cisbiobioassays)和gtpgn‑辛基‑cy5(gtp‑gn‑辛基‑cy5)(cisbiobioassays)，并由下式表示：[0270][0271]用于进行bret的标记[0272]在具体实施方式中，配体标记有bret伴侣对的成员，即能量供给发光化合物或能量接受荧光化合物。[0273]用蛋白质型的发光供体化合物或荧光接受体化合物(bret伴侣对的成员)对配体进行的直接标记可通过本领域技术人员已知并且在本领域技术人员可参考的tarikissad和ralfjockers的文章(bioluminescenceresonanceenergytransfertomonitorprotein‑proteininteractions,transmembranesignalingprotocolspp195‑209,methodsinmolecularbiologytm书系列mimb的部分，第332卷)中特别描述的常规方法进行。[0274]可以基于上述配体上反应基团的存在通过本领域技术人员已知的常规方法进行用有机分子型荧光接受体化合物(bret伴侣对的成员)对配体或者不可水解或可缓慢水解的gtp的直接标记。[0275]反应基团可以与bret伴侣对的成员所携带的反应基团形成共价键。bret伴侣对的成员所携带的合适的反应基团是本领域技术人员熟悉的，例如用马来酰亚胺基团官能化的接受体化合物将能够例如共价结合至蛋白质或肽(例如抗体或抗体片段)所携带的半胱氨酸所携带的硫醇基团。类似地，携带n‑羟基琥珀酰亚胺酯的接受体化合物将能够共价结合至蛋白质或肽中存在的胺。[0276]选择用于获得bret信号的bret伴侣对在本领域技术人员的能力范围内。例如，可用于研究bret现象的供体‑接受体对在dasielo.borroto‑escuela的文章(bioluminescenceresonanceenergytransfer(bret)methodstostudygprotein‑coupledreceptor‑receptortyrosinekinaseheteroreceptorcomplexes,methodscellbiol.2013；117:141–164)中特别描述，本领域技术人员可以加以参考。[0277]发光供体化合物[0278]在具体实施方式中，发光供体化合物为选自于以下化合物中的bret伴侣：萤光素酶(luc)、海肾萤光素酶(renillaluciferase，rluc)、海肾萤光素酶变体(rluc8)以及萤火虫萤光素酶。[0279]荧光接受体化合物[0280]在具体实施方式中，荧光接受体化合物为选自于以下化合物中的bret伴侣：别藻蓝蛋白，罗丹明，花青素，方酸菁，香豆素，原黄素，吖啶，荧光素，硼‑二吡咯亚甲基衍生物，硝基苯并噁二唑，量子点；gfp，gfp变体(gfp10、gfp2、egfp)；yfp，yfp变体(eyfp、yfptopaz、yfpcitrine、yfpvenus、ypet)；morange；dsred。[0281]实施例[0282]材料[0283]‑表达所研究的受体和αig蛋白的细胞膜制剂购自perkinelmer或euroscreen。下表列出了所使用的各种样品的参考号和基底细胞(basecell)：[0284][表1][0285]基底细胞供应商参考号δ阿片hek293perkinelmer6110549400uaδ阿片cho‑k1euroscreen服务多巴胺d2scho‑k1euroscreen服务[0286]‑dsv36s和dsv38s抗体由cisbiobioassays产生并且可应要求从cisbiobioassays获得(在各自的参考号dsv36s和dsv38s下)。dsv36s抗体包含由氨基酸序列seqidno:14组成的重链可变结构域和由氨基酸序列seqidno:15组成的轻链可变结构域。抗体标记有与tr‑fret检测兼容的荧光探针(接受体红色‑d2或供体lumi4tb)。两种抗体dsv36s和dsv38s在αig蛋白的switchii结构域的水平上结合。[0287]‑核苷酸gtp、gdp和gtpγs购自sigmaaldrich(各自的目录参考号g8877、g7127和g8634)。[0288]‑gpcrδ阿片激动剂(snc162)和多巴胺d2s激动剂(ppht)以及gpcrδ阿片拮抗剂(纳曲吲哚(naltrindole))购自tocris(各自的目录参考号1529和0740)。[0289]‑低体积384孔板，白色白底，购自greinerbioone(目录参考号784075)。[0290]‑标记有供体或接受体荧光团的不可水解/可缓慢水解的gtp类似物(gtpgn‑c2；gtpgn‑c3；gtpgn‑辛基‑c2；gtpgn‑辛基‑c11；gtpgn‑辛基‑c3；gtpgo‑己基‑c2；gtpgo‑己基‑c3；gtp‑gn‑辛基‑硫代琥珀酰亚胺基‑c2；gtpgn‑辛基‑cy5；gtpgn‑辛基‑af488)在cisbiobioassays合成。[0291]‑标记有接受体荧光团的不可水解/可缓慢水解的gtp类似物gtpgo‑接头‑cy5(p)和gtpgs‑接头‑cy5(r)以各自的参考号nu‑834‑cy5和nu‑1610‑cy5购自jenabioscience。[0292]方法[0293]试剂的制备[0294]将所有试剂稀释于trishcl缓冲液50mmph7.4、mgcl210mm、bsa0.1％、nacl10mm或100mm或300mm或500mm(浓度在每个图的图例中指定)、0μm或0.5μm或1μmgdp(浓度在每个图的图例中指定)。将膜制备为4×，用于以1μg/孔或10μg/孔(量在每个图的图例中指定)分布。将核苷酸gtpgs(非特异性信号条件)制备为6.67×，以获得100μm的孔中终浓度。将测试化合物(激动剂或拮抗剂)制备为10×，以获得图中提及的孔中终浓度。将用于检测的抗g‑αi抗体制备为4×，用于如下孔中终浓度：抗体dsv36s‑d2(10nm)；抗体dsv36s‑lumi4tb(0.5nm或1nm)；抗体dsv38s‑d2(10nm)。将标记有供体或接受体荧光探针的不可水解/可缓慢水解的gtp类似物制备为4×，用于每个图的图例中提及的孔中终浓度。[0295]试剂在384孔板中的分布[0296]·表达gpcr和g蛋白的膜：5μl[0297]·缓冲液或gtpgs核苷酸(用于非特异性信号条件)：3μl[0298]·不可水解/可缓慢水解的gtp类似物‑供体或接受体：5μl[0299]·抗g‑αi‑供体或接受体配体：5μl[0300]·缓冲液或测试化合物(激动剂和/或拮抗剂)：2μl。[0301]非特异性信号(荧光背景噪声)利用含有过量gtpgs(100μm)的孔进行测量。[0302]读取htrf信号[0303]将板在21℃下孵育20h(除非图中另有说明)，然后利用以下配置在pherastar读取器(bmglabtech)上测量htrf信号：[0304]·模块：htrf(激发337nm；发射665nm和620nm)[0305]·激发：激光，40次闪光；或灯，100次闪光[0306]·读取窗口：时间：60μs‑积分：400μs。[0307]信号处理[0308]根据665nm(对于红色接受体‑cy5)或520nm(对于绿色接受体‑af488或荧光素)和620nm处的原始信号，由以下公式计算htrf比：htrf比＝665nm处的信号或520nm处的信号/620nm处的信号*10,000。[0309]测试格式[0310]图2a示出了使用标记有ret供体伴侣的不可水解/可缓慢水解的gtp类似物和标记有ret接受体伴侣的抗g蛋白配体的测试原理，其中用激动剂化合物激活gpcr诱导供体gtp类似物对g蛋白的结合的降低以及因此的ret信号的降低(格式1a)。[0311]图2b示出了使用标记有ret接受体伴侣的不可水解/可缓慢水解的gtp类似物和标记有ret供体伴侣的抗g蛋白配体的测试原理，其中用激动剂化合物激活gpcr诱导接受体gtp类似物对g蛋白的结合的降低以及因此的ret信号的降低(格式1b)。[0312]图2c示出了使用标记有ret供体伴侣的不可水解/可缓慢水解的gtp类似物和标记有ret接受体伴侣的抗g蛋白配体的测试原理，其中用激动剂化合物激活gpcr诱导供体gtp类似物对g蛋白的结合的增加以及因此的ret信号的增加(格式2a)。[0313]图2d示出了使用标记有ret接受体伴侣的不可水解/可缓慢水解的gtp类似物和标记有ret供体伴侣的抗g蛋白配体的测试原理，其中用激动剂化合物激活gpcr诱导接受体gtp类似物对g蛋白的结合的增加以及因此的ret信号的增加(格式2b)。[0314]实施例1至实施例7：根据格式1a对δ阿片gpcr(dor)进行的激活测试：在激动剂刺激下gtp‑供体和抗g‑αi蛋白抗体接受体之间的tr‑fret信号降低[0315]首先，使用表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293或cho‑k1细胞膜制剂来检测gtp‑供体/抗g‑αi抗体接受体对在结合至g蛋白时产生特异性tr‑fret信号的能力。使用以下实验条件：[0316]‑实施例1/图3a：gtpgn‑辛基‑c2(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl10mm；bsa0.1％。[0317]‑实施例2/图4a：gtpgn‑辛基‑c11(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl10mm；bsa0.1％。[0318]‑实施例3/图5a：gtpgo‑己基‑c2(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl10mm；bsa0.1％。[0319]‑实施例4/图6a：gtpgn‑c2(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl10mm；bsa0.1％。[0320]‑实施例5/图7a：gtpgn‑c3(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；1μghek‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl10mm；bsa0.1％。[0321]‑实施例6/图8：gtpgn‑辛基‑c3(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；1μghek‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl10mm；bsa0.1％。[0322]‑实施例7/图9：gtpgo‑己基‑c3(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；1μghek‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl10mm；bsa0.1％。[0323]在不存在或存在大量过量gtpgs(100μm)的情况下孵育膜。在这两种条件之间观察到的tr‑fret信号差异(htrf比)表明类似物gtpgn‑辛基‑c2、gtpgn‑辛基‑c11、gtpgo‑己基‑c2、gtpgn‑c2、gtpgn‑c3、gtpgn‑辛基‑c3、gtpgo‑己基‑c3能够结合至αig蛋白并与抗g‑αi抗体接受体产生tr‑fret信号(图3a至图9)。[0324]其次，用上述相同的膜和实验条件测试了gpcr激动剂调控结合至gtp‑供体的αg蛋白的比例的能力。通过激动剂刺激产生的tr‑fret信号(htrf比)的降低表明结合至gtp‑供体的αg蛋白形式的比例降低(即空αg蛋白形式增加)。因此，被其激动剂激活的gpcr受体引起gtp‑供体离开g蛋白，该g蛋白然后变为空形式并引起tr‑fret信号降低。这些结果在图3b(实施例1)、图4b(实施例2)、图5b(实施例3)、图6b(实施例4)和图7b(实施例5)中示出。对于类似物gtpgn‑辛基‑c3(实施例6)和gtpgo‑己基‑c3(实施例7)，没有测试到激动剂对信号的这种调控。[0325]实施例8：膜和gtp‑供体的浓度对根据格式1a对δ阿片gpcr(dor)进行的激活测试的影响：在激动剂刺激下gtp‑供体和抗g‑αi蛋白抗体接受体之间的tr‑fret信号降低[0326]首先，使用表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的cho‑k1细胞膜制剂(1μg/孔或10μg/孔)来检测gtpgn‑辛基‑c2/抗g‑αi抗体dsv36s‑d2对在结合至g蛋白时产生特异性tr‑fret信号的能力。gtpgn‑辛基‑c2以孔中最终2nm或6nm使用。在不存在或存在大量过量gtpgs(100μm)的情况下孵育膜。在这两种条件之间观察到的tr‑fret信号差异(htrf比)表明gtpgn‑辛基‑c2类似物能够结合至αig蛋白并与抗g‑αi抗体dsv36s‑d2产生tr‑fret信号(图10a)。此外，左侧子图示出了随着膜的量从每孔1μg增加到10μg，信号幅度(s/b＝总信号/非特异性信号)的增加。右侧子图示出了随着gtpgn‑辛基‑c2的浓度从2nm增加到6nm，信号幅度(s/b)的增加。[0327]其次，用上述相同的膜和实验条件测试了gpcr激动剂调控结合至gtp‑供体的αg蛋白的比例的能力。通过激动剂刺激产生的tr‑fret信号(htrf比)的降低表明结合至gtp‑供体的αg蛋白形式的比例降低(即空αg蛋白形式增加)。因此，被其激动剂激活的gpcr受体引起gtp‑供体离开g蛋白，该g蛋白然后变为空形式并引起tr‑fret信号降低。这些结果在图10b中示出。此外，左侧子图示出了随着膜的量从每孔1μg增加到10μg，信号幅度(s/b＝没有激动剂的媒介的信号/激动剂信号)的增加。右侧子图示出了随着gtpgn‑辛基‑c2的浓度从2nm增加到6nm，信号幅度(s/b)的增加。[0328]实施例9和实施例10：根据格式1a对gpcr多巴胺d2s(d2s)进行的激活测试：在激动剂刺激下gtp‑供体和抗g‑αi蛋白抗体接受体之间的tr‑fret信号降低[0329]首先，使用表达gpcr多巴胺d2s和αig蛋白的cho‑k1细胞膜制剂来检测gtp‑供体/抗g‑αi抗体接受体对在结合至g蛋白时产生特异性tr‑fret信号的能力。使用以下实验条件：[0330]‑实施例9/图11a：gtpgn‑辛基‑c2(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑d2s膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl10mm；bsa0.1％。[0331]‑实施例10/图12a：gtpgn‑辛基‑c11(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑d2s膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl10mm；bsa0.1％。[0332]在不存在或存在大量过量gtpgs(100μm)的情况下孵育膜。在这两种条件之间观察到的tr‑fret信号差异(htrf比)表明类似物gtpgn‑辛基‑c2和gtpgn‑辛基‑c11能够结合至αig蛋白并与抗g‑αi抗体接受体产生tr‑fret信号(图11a至图12a)。[0333]其次，用上述相同的膜和实验条件测试了gpcr激动剂调控结合至gtp‑供体的αg蛋白的比例的能力。通过激动剂刺激产生的tr‑fret信号(htrf比)的降低表明结合至gtp‑供体的αg蛋白形式的比例降低(即空αg蛋白形式增加)。因此，被其激动剂激活的gpcr受体引起gtp‑供体离开g蛋白，该g蛋白然后变为空形式并引起tr‑fret信号降低。这些结果在图11b(实施例9)和图12b(实施例10)中示出。[0334]实施例11至实施例13：根据格式1b对δ阿片gpcr(dor)进行的激活测试：在激动剂刺激下gtp‑接受体和抗g‑αi蛋白抗体供体之间的tr‑fret信号降低[0335]首先，使用表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293细胞膜制剂来检测gtp‑接受体/抗g‑αi抗体供体对在结合至g蛋白时产生特异性tr‑fret信号的能力。使用以下实验条件：[0336]‑实施例11/图13a：gtpgo‑接头‑cy5(p)(孔中最终250nm)；dsv36s‑lumi4tb(孔中最终0.25nm)；1μghek‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl10mm；bsa0.1％。21℃孵育3h后读取。[0337]‑实施例12/图14a：gtpgs‑接头‑cy5(r)(孔中最终250nm)；dsv36s‑lumi4tb(孔中最终0.25nm)；10μghek‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl10mm；bsa0.1％。21℃孵育1h后读取。[0338]‑实施例13/图15a：gtpgn‑l18‑荧光素(孔中最终31nm)；dsv36s‑lumi4tb(孔中最终0.25nm)；1μghek‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl10mm；bsa0.1％。[0339]在不存在或存在大量过量gtpgs(100μm)的情况下孵育膜。在这两种条件之间观察到的tr‑fret信号差异(htrf比)表明类似物gtpgo‑接头‑cy5(p)、gtpgs‑接头‑cy5(r)和gtpgn‑l18‑荧光素能够结合至αig蛋白并与抗g‑αi抗体供体产生tr‑fret信号(图13a至图15a)。[0340]其次，用上述相同的膜和实验条件测试了gpcr激动剂调控结合至gtp‑接受体的αg蛋白的比例的能力。通过激动剂刺激产生的tr‑fret信号(htrf比)的降低表明结合至gtp‑接受体的αg蛋白形式的比例降低(即空αg蛋白形式增加)。因此，被其激动剂激活的gpcr受体引起gtp‑接受体离开g蛋白，该g蛋白然后变为空形式并引起tr‑fret信号降低。这些结果在图13b(实施例11)、图14b(实施例12)、图15b(实施例13)中示出。对于类似物gtpgs‑接头‑cy5(r)(实施例12)，激动剂对信号的这种调控非常轻微。[0341]实施例14至实施例19：根据格式2a对δ阿片gpcr(dor)进行的激活测试：在激动剂刺激下gtp‑供体和抗g‑αi蛋白抗体接受体之间的tr‑fret信号增加[0342]首先，使用表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的cho‑k1细胞膜制剂来检测gtp‑供体/抗g‑αi抗体接受体对在结合至g蛋白时产生特异性tr‑fret信号的能力。使用以下实验条件：[0343]‑实施例14/图16a：gtpgn‑辛基‑c2(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl500mm；bsa0.1％。[0344]‑实施例15/图17a：gtpgn‑辛基‑c2(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl300mm；gdp0.5μm；bsa0.1％。[0345]‑实施例16/图18a：gtpgn‑辛基‑c2(孔中最终6nm)；dsv38s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl300mm；gdp0.5μm；bsa0.1％。[0346]‑实施例17/图19a：gtpgn‑辛基‑c11(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl300mm；gdp0.5μm；bsa0.1％。[0347]‑实施例18/图20a：gtpgo‑己基‑c2(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl300mm；gdp0.5μm；bsa0.1％。[0348]‑实施例19/图21a：gtpgn‑c2(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl300mm；gdp0.5μm；bsa0.1％。[0349]在不存在或存在大量过量gtpgs(100μm)的情况下孵育膜。在这两种条件之间观察到的tr‑fret信号差异(htrf比)表明类似物gtpgn‑辛基‑c2、gtpgn‑辛基‑c11、gtpgo‑己基‑c2、gtpgn‑c2能够结合至αig蛋白并与抗g‑αi抗体接受体产生tr‑fret信号(图16a至图21a)。[0350]其次，用上述相同的膜和实验条件测试了gpcr激动剂调控结合至gtp‑供体的αg蛋白的比例的能力。通过激动剂刺激产生的tr‑fret信号(htrf比)的增加表明结合至gtp‑供体的αg蛋白形式的比例增加(即空αg蛋白形式减少)。因此，被其激动剂激活的gpcr受体引起gtp‑供体结合至g蛋白，该g蛋白然后变为gtp‑供体形式并引起tr‑fret信号增加。这些结果在图16b(实施例14)、图17b(实施例15)、图18b(实施例16)、图19b(实施例17)、图20b(实施例18)和图21b(实施例19)中示出。此外，图17b(实施例15)示出了第二种条件，其中固定浓度的gpcr激动剂snc162(200nm)引起的激活被浓度增加的gpcr拮抗剂(纳曲吲哚)抑制。这种激活抑制从tr‑fret信号(htrf比)的减少观察到。[0351]实施例20至实施例22：根据格式2a对gpcr多巴胺d2s(d2s)进行的激活测试：在激动剂刺激下gtp‑供体和抗g‑αi蛋白抗体接受体之间的tr‑fret信号增加[0352]首先，使用表达gpcr多巴胺d2s和αig蛋白的cho‑k1细胞膜制剂来检测gtp‑供体/抗g‑αi抗体接受体对在结合至g蛋白时产生特异性tr‑fret信号的能力。使用以下实验条件：[0353]‑实施例20/图22a：gtpgn‑辛基‑c2(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑d2s膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl10mm；gdp1μm；bsa0.1％。[0354]‑实施例21/图23a：gtpgn‑辛基‑c2(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑d2s膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl100mm；bsa0.1％。[0355]‑实施例22/图24a：gtpgn‑辛基‑c2(孔中最终6nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑d2s膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl100mm；gdp1μm；bsa0.1％。[0356]在不存在或存在大量过量gtpgs(100μm)的情况下孵育膜。在这两种条件之间观察到的tr‑fret信号差异(htrf比)表明类似物gtpgn‑辛基‑c2能够结合至αig蛋白并与抗g‑αi抗体接受体产生tr‑fret信号(图22a至图24a)。[0357]其次，用上述相同的膜和实验条件测试了gpcr激动剂调控结合至gtp‑供体的αg蛋白的比例的能力。通过激动剂刺激产生的tr‑fret信号(htrf比)的增加表明结合至gtp‑供体的αg蛋白形式的比例增加(即空αg蛋白形式减少)。因此，被其激动剂激活的gpcr受体引起gtp‑供体结合至g蛋白，该g蛋白然后变为gtp‑供体形式并引起tr‑fret信号增加。这些结果在图22b(实施例20)、图23b(实施例21)和图24b(实施例22)中示出。[0358]实施例23和实施例24：根据格式2b对δ阿片gpcr(dor)进行的激活测试：在激动剂刺激下gtp‑接受体和抗g‑αi蛋白抗体供体之间的tr‑fret信号增加[0359]首先，使用表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的cho‑k1细胞膜制剂来检测gtp‑接受体/抗g‑αi抗体供体对在结合至g蛋白时产生特异性tr‑fret信号的能力。使用以下实验条件：[0360]‑实施例23/图25a：gtpgn‑辛基‑cy5(孔中最终50nm)；dsv36s‑lumi4tb(孔中最终1nm)；10μgcho‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl300mm；gdp0.5μm；bsa0.1％。21℃孵育3h后读取。[0361]‑实施例24/图26a：gtpgn‑辛基‑af488(孔中最终50nm)；dsv36s‑lumi4tb(孔中最终1nm)；10μgcho‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl210mm；nacl300mm；gdp0.5μm；bsa0.1％。21℃孵育3h后读取。[0362]在不存在或存在大量过量gtpgs(100μm)的情况下孵育膜。在这两种条件之间观察到的tr‑fret信号差异(htrf比)表明类似物gtpgn‑辛基‑cy5和gtpgn‑辛基‑af488能够结合至αig蛋白并与抗g‑αi抗体供体产生tr‑fret信号(图25a至图26a)。[0363]其次，用上述相同的膜和实验条件测试了gpcr激动剂调控结合至gtp‑接受体的αg蛋白的比例的能力。通过激动剂刺激产生的tr‑fret信号(htrf比)的增加表明结合至gtp‑接受体的αg蛋白形式的比例增加(即空αg蛋白形式减少)。因此，被其激动剂激活的gpcr受体引起gtp‑接受体结合至g蛋白，该g蛋白然后变为gtp‑接受体形式并引起tr‑fret信号增加。这些结果在图25b(实施例23)和图26b(实施例24)中示出。[0364]实施例25：根据格式2a对δ阿片gpcr(dor)进行的激活测试：在激动剂刺激下gtp‑供体和抗g‑αi蛋白抗体接受体之间的tr‑fret信号增加[0365]首先，使用表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的cho‑k1细胞膜制剂来检测gtp‑供体/抗g‑αi抗体接受体对在结合至g蛋白时产生特异性tr‑fret信号的能力。使用以下实验条件：[0366]‑实施例25/图27a：gtp‑gn‑辛基‑硫代琥珀酰亚胺基‑c2(孔中最终7.5nm)；dsv36s‑d2(孔中最终10nm)；10μgcho‑dor膜/孔；缓冲液：trishcl50mmph7.4；mgcl260mm；nacl150mm；bsa0.1％。[0367]在不存在或存在大量过量gtpgs(100μm)的情况下孵育膜。在这两种条件之间观察到的tr‑fret信号差异(htrf比)表明类似物gtp‑gn‑辛基‑硫代琥珀酰亚胺基‑c2能够结合至αig蛋白并与抗g‑αi抗体接受体产生tr‑fret信号(图27a)。[0368]其次，用上述相同的膜和实验条件测试了gpcr激动剂调控结合至gtp‑供体的αg蛋白的比例的能力。通过激动剂刺激产生的tr‑fret信号(htrf比)的增加表明结合至gtp‑供体的αg蛋白形式的比例增加(即空αg蛋白形式减少)。因此，被其激动剂激活的gpcr受体引起gtp‑供体结合至g蛋白，该g蛋白然后变为gtp‑供体形式并引起tr‑fret信号增加。这些结果在图27b(实施例25)中示出。[0369]实施例26：用于获得在根据本发明的方法中使用的抗gαi1蛋白抗体的方案[0370]小鼠的免疫[0371]tst‑gαi1重组蛋白(序列uniprotp63096‑1的αi1g蛋白，通过tev接头而在n端带有标签twinstreptag(tst)(iba))在sf9昆虫细胞(用编码所述蛋白的杆状病毒进行感染)中生产，然后通过标签twinstreptag(tst)在亲和柱上进行纯化(strep‑tactinsuperflow高容量树脂(iba，目录号：2‑1208‑002))。[0372]通过注射预先在含有gtpgs的缓冲液(hepes20mmph8，nacl100mm，mgcl23mm，chaps11mm，gtpgs100μm)中稀释的tst‑gαi1蛋白来免疫balb/c小鼠。初次注射后，以一个月的间隔进行三次增强注射(threeboosters)。[0373]每次注射后15天，对小鼠进行的血液穿刺允许验证免疫应答的存在。[0374]为此，建立elisa类型的测定法。将预先在含有gtpgs的缓冲液(trishcl20mmph8.5、nacl140mm、edta2mm、mgcl210mm、bsa0.1％、gtpgs1μm)中稀释至20μg/ml的tst‑gαi1蛋白通过标签twinstreptag吸附在含有xt(iba，目录号：2‑4101‑001)的96孔板上。为此，将100μl蛋白质添加到每个孔中，然后在37℃下孵育2h，然后在1×pbs缓冲液、0.05％tween20中洗涤3次。[0375]然后，以100μl/孔的水平加入稀释因子为10至100百万的血液穿刺物的连续稀释液，并在37℃下孵育2h。通过在1×pbs缓冲液、0.05％tween20中的三个洗涤步骤去除未固定至蛋白的抗体，然后使用结合至hrp(辣根过氧化物酶)的抗小鼠fc二抗(sigma#a0168，在pbs、bsa0.1％中稀释至1/10000)检测经固定的抗体。在37℃下孵育1h并然后在1×pbs缓冲液、0.05％tween20中洗涤3次后，在伴随搅拌在室温下对hrp底物tmb(3,3',5,5'‑四甲基联苯胺，sigma#t0440)孵育20min后，通过450nm处的比色测定法进行hrp的显影。[0376]为了确保通过elisa测定法检测的抗体确实针对αi1g蛋白而不是针对标签twinstreptag，在与过量的带有标签twinstreptag的另一种正交蛋白(orthogonalprotein)(snaptag‑twinstreptag)进行预孵育后，通过elisa测定法测试了相同的穿刺物。因此，抗标签抗体结合至带标签的正交蛋白，因此不会结合至附着在孔底部的αi1g蛋白；在这种情况下，未检测到hrp信号或hrp信号降低。[0377]选择在抗标签对照情况下具有最小信号降低和具有最佳抗体效价的小鼠用于下一步骤的淋巴细胞杂交(也称为融合)。回收小鼠的脾，并在存在聚乙二醇型的细胞融合催化剂的情况下将从所述脾获得的淋巴细胞和浆细胞的混合物在体外与骨髓瘤细胞系融合。使用缺乏hgprt酶(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)的突变骨髓瘤细胞系来选择杂交细胞(称为杂交瘤)。将这些细胞在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤(甲氨蝶呤)和胸腺嘧啶的培养基(hat培养基)中培养，以使得能够去除未融合的骨髓瘤细胞，从而选择感兴趣的杂交瘤。未融合的脾细胞死亡，因为它们无法在体外增殖。因此，只有杂交瘤存活。[0378]然后，在培养板中培养这些杂交瘤。然后，对这些杂交瘤的上清液进行测试以评价它们产生抗αi1g蛋白抗体的能力。为此，进行如上所述的elisa测定法。[0379]为了评价抗体在不同形式的αi1g蛋白(结合至gdp的全形式vs结合至gtpgs的全形式vs空形式)中的选择性，在将tst‑gαi1蛋白在含有1μmgdp或1μmgtpgs或不含核苷酸的缓冲液中预孵育的条件下平行进行测定。然后用有限稀释步骤克隆最佳杂交瘤以获得杂交瘤克隆。[0380]然后，将感兴趣的杂交瘤克隆注射到小鼠中(腹膜内注射)以允许在腹水中大量产生抗体。[0381]然后，在具有蛋白质a的树脂的柱上通过亲和层析来纯化抗体。[0382]如上纯化的抗体与dsv36s抗体竞争结合至αg蛋白的能力[0383]将所有试剂稀释于trishcl缓冲液50mmph7.4、mgcl210mm、bsa0.1％、nacl10mm。将gαi1蛋白制备为2×，以获得2.5nm的孔中终浓度。将核苷酸gtpgs制备为2×，以获得10μm的孔中终浓度。这两种试剂在同一溶液中制备并在室温下预孵育30分钟，然后再分布到孔中。将如上纯化的抗体制备为4×，以获得在0.01μm和1μm之间的孔中终浓度。将抗体dsv36s‑d2制备为4×，以获得10nm的终浓度。将抗twin‑strep‑标签‑lumi4tb抗体制备为4×，以获得0.5nm的孔中终浓度。[0384]将试剂如下分布在384孔板中：[0385]1.每孔加入αi1g蛋白 gtpgs的10μl预孵育混合物；[0386]2.每孔加入5μl纯化抗体；[0387]3.将板在室温下孵育30分钟；[0388]4.每孔加入抗twin‑strep‑标签‑lumi4tb抗体和抗体dsv36s‑d2的5μl混合物。[0389]在读取htrf信号前，将板在室温下孵育1小时。[0390]根据本发明的抗体能够抑制用抗体dsv36s‑d2获得的htrf信号。相反，不是根据本发明的抗体不能抑制由dsv36s‑d2产生的信号。[0391]序列表[0392][表3][0393]当前第1页12当前第1页12