血根碱在制备幽门螺杆菌脲酶抑制剂中的应用的制作方法

1.本发明属于天然化合物应用技术领域，具体涉及血根碱在制备幽门螺杆菌脲酶抑制剂中的应用。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(helicobacter pylori)是世界范围内最常见的传染性病原菌之一，全球有超过50％的人群感染。幽门螺杆菌感染不但是消化性溃疡、慢性胃炎的主要病因，而且与胃黏膜相关性淋巴瘤及胃腺癌的发生密切相关。世界卫生组织已将幽门螺杆菌列为第一类致癌因子。目前，幽门螺杆菌感染的一线治疗方案是以抗生素为主的三联或四联疗法，该方案虽能在一定程度上清除已感染的幽门螺杆菌，但存在毒副作用明显，疗效不稳定，易复发，病人依从性差等问题；其中抗生素的广泛使用，不但引起胃肠道菌群失调及功能紊乱，而且致使抗生素的耐药问题日益凸显。
3.胃内是一个强酸环境，幽门螺旋杆菌能在胃内存活的最主要原因是它的脲酶活性，脲酶水解尿素释放出来的氨能提高ph值，并且最新研究显示，受体结构中的尿素分子是幽门螺旋杆菌感知和避免胃酸环境的关键因素。因此脲酶的作用为幽门螺旋杆菌营造了一个适宜的微环境。具有脲酶活性的病原菌要么靠脲酶水解尿素产生氨为自身的生命活动提供氮源，要么利用氨的碱性为其生存提供一个适宜的微环境。但是氨的释放会造成细胞毒性、引发炎症或溃疡，也会因造成血氨过高引发肝性脑病等，此外脲酶本身会通过免疫反应，刺激人中性粒细胞的氧化爆发，产生氯氨，参与细胞损伤和诱发癌变，因此脲酶是上述致病菌重要的毒力因子。故阻断了脲酶活性，就能有效的抑制甚至杀灭这类病菌，达到治疗上述疾病的目的。同时，毒力因子并非像dna、蛋白质等一样，是细菌生存必不可少的，因此与传统抗生素相比，抑制细菌的毒力因子较为不容易发展耐药性，这些优越性显示脲酶抑制剂将有可能成为治疗上述疾病的一线药物。
4.然而，现有的脲酶抑制剂的有效性大多受温度、时间、ph环境等因素的影响，因而现在国内较为成熟的脲酶抑制剂是乙酰氧肟酸，其具有合成简单，成本不高，毒性低的特点。但存在的主要问题为长期使用乙酰氧肟酸，仍然会使微生物产生适应性和耐药性，从而导致乙酰氧肟酸失去效果。
5.因此，希望提出一种效果良好的新型脲酶抑制剂产品，以减少对乙酰氧肟酸的依赖，进一步降低耐药性的发生几率。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种血根碱在制备幽门螺杆菌脲酶抑制剂中的应用，本发明指出血根碱抑制幽门螺杆菌脲酶的效果良好，且具有结构简单，安全性好等特点，具备良好的应用价值与开发前景，可作为幽门螺杆菌脲酶抑制剂广泛用于治疗与幽门螺杆菌相关的胃部疾病，如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤等，并进一步降低耐药性的发生几率。
7.本发明提供了血根碱在制备幽门螺杆菌脲酶抑制剂中的应用，所述血根碱的结构式如式(ⅰ)所示：
[0008][0009]
血根碱是一种苯菲啶异喹啉类生物碱，为白屈菜、紫堇、博落回、血水草等中药的关键活性成分，其化学结构式如式(ⅰ)所示。血根碱是已知的一种安全、低毒的化合物，具有多种药理作用，如抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗血管生成、提高机体免疫力、改善肠道健康等。本发明率先发现，血根碱具有抑制幽门螺杆菌脲酶活性的作用，因而可应用于制备幽门螺杆菌脲酶抑制剂。
[0010]
本发明还提供了一种幽门螺杆菌脲酶抑制剂，包括血根碱或其在药学上可接受的盐。
[0011]
优选的，所述幽门螺杆菌脲酶抑制剂中还包括药学上可接受的辅料。
[0012]
优选的，所述药学上可接受的辅料包括溶剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、粘合剂或助悬剂中的至少一种。
[0013]
优选的，所述幽门螺杆菌脲酶抑制剂的制剂形式为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液或包衣药丸。
[0014]
本发明还提供了所述幽门螺杆菌脲酶抑制剂在制备治疗胃部疾病的药物中的应用。
[0015]
优选的，所述胃部疾病包括胃炎、胃溃疡或胃癌
[0016]
所述幽门螺杆菌抑制剂可抑制人体内的幽门螺杆菌脲酶活性，减少消化系统疾病尤其是胃部疾病的发生率，可在制备抗胃炎、胃溃疡、胃癌等药物领域得到应用。
[0017]
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
[0018]
本发明开拓了血根碱作为幽门螺杆菌脲酶抑制剂在医药领域中的新用途，可用于制备治疗和预防胃炎、胃溃疡等胃部相关疾病的药物。同时，将血根碱作为幽门螺杆菌脲酶抑制剂还丰富了现有脲酶抑制剂的可选种类，有助于减少药物的耐药性。同时，由于血根碱本身为天然药物成分，并具有高效低毒的特点，因此在抑制幽门螺杆菌脲酶活性方面具有良好的开发前景。
附图说明
[0019]
图1为血根碱与乙酰氧肟酸对脲酶的抑制活性；其中，a表示血根碱的抑制活性，b表示乙酰氧肟酸的抑制活性；
[0020]
图2为血根碱对幽门螺杆菌脲酶的抑制类型研究；其中，a表示血根碱抑制脲酶的
lineweaver
‑
burk双倒数图，b表示血根碱抑制脲酶lineweaver
‑
burk双倒数图中曲线的斜率与抑制剂浓度关系图，c表示血根碱抑制脲酶lineweaver
‑
burk双倒数图中曲线的截距与抑制剂浓度关系图；
[0021]
图3为含疏基化合物对幽门螺杆菌脲酶活性影响的条形图；其中，a图为含疏基化合物与幽门螺杆菌脲酶孵育时间对脲酶活性影响的条形图，b图为含疏基化合物、血根碱与幽门螺杆菌脲酶三种的加入顺序对脲酶活性影响的条形图；*为与脲酶组比较p<0.05，**为与脲酶组比较p<0.01，##为与脲酶 血根碱组比较p<0.01；
[0022]
图4为无机化合物对血根碱抑制脲酶活性影响的条形图；*为与脲酶组比较p<0.05，**为与脲酶组比较p<0.01，##为与脲酶 血根碱组比较p<0.01。
具体实施方式
[0023]
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
[0024]
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
[0025]
实验材料
[0026]
受试药物
[0027]
血根碱，购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均大于98％；尿素，二硫苏糖醇、半胱氨酸均购自索莱宝；谷胱甘肽购自美仑生物；氟化钠、硼酸均购自麦克林。hepes、水杨酸钠、硝普钠、氢氧化钠、次氯酸钠、丙三醇，均购自广州化学试剂厂，均为分析纯。
[0028]
幽门螺杆菌的培养
[0029]
在37℃，含5％o2、10％co2和85％n2的微氧条件下，对幽门螺杆菌进行24h的培养，培养液为含有10％灭活马血清的布氏肉汤。复苏培养3天后，对经过鉴定且无污染的幽门螺杆菌进行传代培养：用接种环从母板刮取菌团，接种于新鲜的培养平板上，轻轻均匀涂布于整个平板，然后装罐培养3天。
[0030]
幽门螺杆菌脲酶的提取
[0031]
取50ml幽门螺杆菌菌液在5000g，4℃的条件下离心分离并收集幽门螺杆菌，用ph为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤两次后，将幽门螺杆菌沉淀在
‑
80℃保存24h，取出放置至室温，加入3ml蒸馏水和蛋白酶抑制剂，超声1min，以15000g、4℃离心10min，取出上层清液透析除盐，得到脲酶溶液，加入等体积的甘油后放于4℃储存。
[0032]
药物的配制
[0033]
分别称取适量血根碱和乙酰氧肟酸，用20mm的hepes缓冲液(ph为7.5)配制成相应浓度，置于4℃避光保存，备用。
[0034]
尿素的配制
[0035]
称取尿素适量，溶解于20mm的hepes缓冲液(ph为7.5)中，配制成150mm的尿素溶液，放于4℃冰箱中冷冻保存，备用。
[0036]
berthelot显色液的配制
[0037]
a液：分别称取适量的硝普钠和水杨酸钠粉末，溶解于20mm的hepes缓冲液(ph为7.5)中，配制成含9.73mm亚硝基铁氰化钠、700mm水杨酸钠的显色a液，置于4℃避光保存，备用。
[0038]
b液：称取氢氧化钠9g，溶解于20mm的hepes缓冲液(ph为7.5)中，放冷，加入12ml次氯酸钠，混匀，定容至50ml，置4℃避光保存，备用。
[0039]
实施例1：血根碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶活性试验
[0040]
将一定浓度的幽门螺杆菌脲酶和一系列浓度的血根碱溶液混匀，置37℃孵育20min，然后在室温下加入尿素溶液避光反应20min，再加入berthelot显色液避光显色10min，吸取200μl孵育液至96孔板上，通过酶标仪测定595nm下的od
绝对
值，求得相应的od
相对
值，以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。根据公式1求得相应的od相对值。根据公式2求得残余酶活性(residual activity，ra)，并通过浓度
‑
剩余酶活性曲线求得相应半数抑制浓度ic
50
，以平均值
±
标准偏差表示。
[0041]
od
相对
＝od
绝对
–
od
空白
ꢀꢀ
(公式1)
[0042]
剩余酶活性(％)＝od
相对值供试品
/od
相对空白
×
100％
ꢀꢀ
(公式2)
[0043]
结果如图1所示，血根碱抑制幽门螺杆菌脲酶活性的半数抑制浓度(ic
50
)为0.48
±
0.14mm，虽略弱于阳性药乙酰氧肟酸(ic
50
＝0.06
±
0.01mm)，但从ic
50
数值来看，可以认为其具有较强的抗幽门螺杆菌脲酶抑制活性。
[0044]
实施例2：血根碱对幽门螺旋杆菌脲酶的抑制类型研究
[0045]
取一定浓度的幽门螺杆菌脲酶和一系列浓度的血根碱溶液(0、0.25、0.5、1.0mm)混匀，置37℃孵育20min。然后在室温下加入一系列浓度的尿素溶液(0.468
‑
7.5mm)避光反应20min，再根据实施例1的方法显色并测得od
绝对
值并求得相应的od
相对
值。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。实验通过反应速度的倒数(1/v，即1/od
相对
)对底物浓度的倒数(1/[urea])作lineweaver
‑
burk图，最后通过l
‑
b曲线结合公式3求得动力学参数k
m
、v
max
，并通过l
‑
b曲线进行二次作图求得抑制常数k
i
，k
is
。
[0046][0047]
结果如图2所示，由lineweaver
‑
burk双倒数图可知，随着血根碱浓度的增加，血根碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶的动力学参数k
m
逐渐增大，v
max
逐渐降低，由此可初步推断血根碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶的作用类型为混合型抑制类型。此外，结合血根碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶类型，对lineweaver
‑
burk双倒数图进行二次作图可求得血根碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶的抑制常数k
i
为0.18
±
0.08mm，k
is
为0.34
±
0.18mm。
[0048]
实施例3：含巯基化合物对幽门螺旋杆菌脲酶活性的影响
[0049]
孵育时间试验
[0050]
把幽门螺旋杆菌脲酶溶液，含巯基化合物溶液(二硫苏糖醇，半胱氨酸或谷胱甘肽溶液，浓度均为1.25mm)以及1.0mm血根碱溶液混匀，置37℃分别预孵育5，10，20或40min后，于室温下加入尿素反应20min，再根据实施例1的方法显色并测得od
绝对
值并求得相应的od
相对
值，并求出相应的残余酶活性ra。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。
[0051]
血根碱
‑
巯基
‑
脲酶的相互作用试验
[0052]
把幽门螺旋杆菌脲酶溶液，含巯基化合物溶液(二硫苏糖醇，半胱氨酸或谷胱甘肽
溶液，浓度均为1.25mm)以及1.0mm血根碱溶液中的其中两种溶液混匀，置37℃预孵育20min后，接着加入第三种溶液混匀，并在37℃再孵育20min，然后在室温下向共孵育液加入尿素反应20min，再根据实施例1的方法显色并测得od
绝对
值并求得相应的od
相对
值，并求出相应的残余酶活性ra。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。
[0053]
图3显示，当系统中含有巯基化合物(二硫苏糖醇，半胱氨酸或谷胱甘肽)时，即使是在血根碱存在的情况下，幽门螺旋杆菌脲酶仍能保持较高的酶活性，且幽门螺旋杆菌脲酶的活性与含巯基化合物，幽门螺旋杆菌脲酶，血根碱三者的孵育时间和加入顺序密切相关。由此我们可推测血根碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶活性的其中一个作用位点为脲酶氨基酸系列中的巯基基团。
[0054]
实施例4：无机化合物对幽门螺旋杆菌脲酶活性的影响
[0055]
取幽门螺旋杆菌脲酶溶液与无机化合物溶液(1.25mm硼酸或氟化钠溶液)各100μl混匀，置37℃培养箱预孵育20min。再加入血根碱溶液(1.0mm)混匀，置37℃培养箱再孵育20min后取出，在室温下加入尿素反应20min，再根据实施例1的方法显色并测得od
绝对
值并求得相应的od
相对
值，并求出相应的残余酶活性ra。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。
[0056]
实验结果如图4所示，当系统中幽门螺旋杆菌脲酶同时与血根碱及硼酸或氟化钠存在时，剩余酶活性ra均降低，但血根碱与硼酸或氟化钠共同作用的脲酶残余活性高于血根碱单独作用，表明硼酸和氟化钠对血根碱抑制幽门螺杆菌脲酶具有一定的保护作用。由此我们可推测血根碱抑制幽门螺旋杆菌脲酶活性的其中一个作用位点为ni
2
。
[0057]
以上实验表明，血根碱能显著抑制幽门螺杆菌脲酶的活性。此外，血根碱抑制幽门螺杆菌脲酶作用机理的研究证明血根碱是一种缓慢结合的混合型脲酶抑制剂，其抑制幽门螺杆菌脲酶的作用是时间、浓度依赖的，且主要是通过作用于幽门螺杆菌脲酶活性位点ni
2
和氨基酸序列中的巯基活性基团从而抑制脲酶的活性。通过上述机理研究可进一步证实血根碱具抗幽门螺杆菌脲酶的作用，且作用效果明显。再结合血根碱结构简单，安全等优点可知，血根碱在制备抗幽门螺杆菌的药物方面具有良好的应用价值与开发前景，是潜在的脲酶抑制剂，具有治疗幽门螺旋杆菌相关性胃肠道疾病的作用。
[0058]
实施例5：胶囊剂
[0059]
血根碱1g，与300g淀粉混合均匀，用7％的淀粉浆300g作为粘合剂，湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁16g混合，制得血根碱胶囊内容物；填充胶囊，规格为每粒含血根碱1mg的胶囊1000粒，每粒净重0.30g。每次1～2粒，一日3次，10～15天为一疗程，可连续使用2～3疗程。在治疗幽门螺杆菌相关性的胃肠道疾病如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤，甚至胃癌等期间，用于口服使用。
[0060]
实施例6：片剂
[0061]
血根碱10g，加入乳糖480g、淀粉1100g混合均匀，用7％的淀粉浆300g作为粘合剂、湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁16g混合，压制成每片含血根碱1mg的片剂10000片，每片净重0.20g，每次1～3片，一日3次，10～15天为一疗程，可连续使用2～3疗程。在治疗幽门螺杆菌相关性的胃部疾病如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤等期间，用于口服使用。
[0062]
实施例7：颗粒剂
[0063]
血根碱10g，用400g倍他环糊精包合得包合物；包合物加淀粉至600g，混匀，制成颗
粒，60℃以下干燥，分装成1000袋(lg/袋)。服用剂量为每天2次，每次一袋。在治疗幽门螺杆菌相关性的胃部疾病如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤等期间，用于口服使用。
[0064]
实施例8：口服液
[0065]
血根碱10g，加入增溶剂泊洛沙姆，和一定比例的乙醇，充分搅匀；然后加入蔗糖、山梨酸钾等适宜附加剂(如矫味剂、抑菌剂、抗氧化剂、着色剂)，溶解均匀，滤过澄清，将内容物装入口服液玻璃瓶中，灭菌。规格为每瓶含血根碱10mg的口服液，每瓶净含量10ml。在治疗幽门螺杆菌相关性的胃部疾病如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤等期间，用于口服使用。
[0066]
上面结合附图对本技术实施例作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。