一种LC-MS/MS技术测定干血斑中氧化三甲胺的方法与流程

一种lc
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ms/ms技术测定干血斑中氧化三甲胺的方法
技术领域
1.本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种lc
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ms/ms技术测定干血斑中氧化三甲胺的方法。


背景技术：

2.心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病，心血管疾病做好的临床检测手段就是氧化三甲胺检测，氧化三甲胺(tmao)是由肠道细菌消化红肉、鸡蛋、乳制品、咸水鱼收后，再经过肝脏加工产生的一种极性小分子化合物。近年来，随着肠道菌群研究的深入，科学家们发现tmao与心血管疾病、脑卒中、糖尿病、慢性肾病、癌症等多种疾病密切相关，因此tmao越来越受到广泛关注。tmao是一个新型的预测心脑血管疾病风险的生物标记物，能很好的独立预测心脑血管疾病的风险。tmao定量分析可为心脑血管疾病的诊断、风险分层和预测等方面提供可靠的依据。tmao浓度升高与主要不良心血管事件的风险是呈现显著相关性的，并且相对风险的增加不随身体质量指数、糖尿病、心血管疾病史、肾功能障碍等因素的变化而变化，并且可在通过传统危险因素以及血液检测无法识别的人群中作为预测将来心脏病发作、脑卒中和死亡风险的一种准确筛查工具。代谢小分子氧化三甲胺检测与胆固醇、甘油三酯或血糖水平一样有助于指导临床医师提供个体化营养建议以预防心血管疾病，传统的tmao检测方法为分光光度法、毛细管电泳法及色谱法，其灵敏度和准确度有限、重复性差，液相色谱串联质谱法(lc
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ms/ms)具有分析时间短、灵敏度高、特异性高等优点，显示极高优越性和应用前景，是目前tmao检测最常用的方法。
3.现有的应用较多的氧化三甲胺检测方法就是气相色谱
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质谱联用法，气相色谱
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质谱联用法虽然灵敏度较高，但操作繁琐、耗时长，样品衍生过程可使氧化三甲胺降解从而影响测定结果的准确性。


技术实现要素：

4.为此，本发明提供一种lc
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ms/ms技术测定干血斑中氧化三甲胺的方法，以解决氧化三甲胺检测操作繁琐、耗时快，检测结果不准确的问题。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种lc
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ms/ms技术测定干血斑中氧化三甲胺的方法，其特征在于：具体步骤如下：
6.s1、采集样本：用针扎破手指，并用少量的指尖血滴于滤纸上，使用采血滤纸采集指尖血或静脉血，合格滤纸干血片需要3个血斑，每个血斑直径大于8毫米，血滴自然渗透，滤纸正反面血斑一致血斑无污染，血斑无渗血环，并在室温下进行干燥，干燥完成后将氧化三甲胺样本放入含有干燥剂的密封袋内保存备用；
7.s2、样本处理：利用打孔器将氧化三甲胺样本上的有血部分打下并标记为a样本，取直径为6mm的a样本，加入超纯水和除蛋白液，超声后，加入水2ml，并进行涡流30s，加入甲酸铵溶液并经常涡流混合，涡流混合后往复振荡并进行溶液离心；
8.s3、lc
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ms/ms测定：分取上层有机相于另一试管中，40℃空气流下吹干，吸取90μl转移至密封的进样瓶后上机检测，以保留时间和质谱图定性，内标法定量，以此测氧化三甲胺。
9.具体的，lc
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ms/ms技术是样品经过色谱分离后经离子源离子化产生带有一定电荷、质量数的离子，采用不同的质量分析器把电离子按质荷比(m/z)分开，得到依质量顺序排列的质谱图，通过对质谱图的分析处理，进行定性、定量分析的技术，且干血斑制造涉及到的全血量更加的稀少。
10.优选的，所述步骤s1中，室温下干燥120
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150min。
11.具体的，通过室温干燥使干血斑血样本凝固。
12.优选的，所述步骤s2中，加入超纯水为200
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260μl，除蛋白液为10
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14μl。
13.具体的，通过不同量的超纯水浸泡干血斑样本，以此得到不同浓度的血样本，除蛋白液可沉淀血液中的蛋白质。
14.优选的，所述步骤s2中，超声条件控制在40khz、200w，并超声15
‑
17min。
15.具体的，通过超声使蛋白凝固。
16.优选的，所述步骤s2中，加入的甲酸铵溶液为3
‑
5ml，并进行涡流混合1min，往复振荡10min(240次
·
min－1)，离心5min(3500r
·
min－1)。
17.具体的，通过离心使蛋白沉淀。
18.优选的，所述步骤s3中，离心后将a样本溶液置于4℃中，在分离后的0h、24h和72h进行测定并对浓度变化进行测定。
19.具体的，通过不同的时间后的样本检测并得到更好的氧化三甲胺检测数据。
20.优选的，所述除蛋白液由超纯水稀释乙腈溶液获得。
21.具体的，乙腈溶液有优良的溶剂性能，能溶解多种有机、无机和气体物质。
22.优选的，所述甲酸铵溶液制备方法是：称0.6306g的甲酸铵，用超纯水配成10mmol/l甲酸铵溶液，用甲酸调ph至3.0，0.45m滤膜过滤，超声脱气处理获得适用的甲酸铵溶液。
23.具体的，甲酸铵无色结晶，易潮解，可溶于水和乙醇，其水溶液显酸性。
24.优选的，所述lc
‑
ms/ms测定色谱条件：色谱柱为：ultimatesio，column(2.1mm
×
100mm，5ixm，welchmaterials，inc)，流动相：乙腈：10mmol/l、甲酸铵(ph3.0)＝70％：30％(v/v)，等度洗脱，流速：0.4ml/min，进样量：5μl，柱温：30℃。
25.优选的，所述lc
‑
ms/ms测定质谱条件：离子源为电喷雾电离源(esi源)，喷雾电压4.2kv，离子源温度300℃，离子源气体1(n2)压力为0.3mpa，离子源气体2(n2)压力为0.3mpa，气帘气体(n2)压力为0.07mpa，碰撞气体(n2)压力为0.03mpa，正离子方式检测，去簇电压(dp)为54v，扫描方式为多反应监测(mrm)，碰撞能量(ce)为22v。
26.本发明实施例具有如下优点：
27.无需衍生，简单快速，在缩短前处理时间的同时也避免了衍生化过程中高温对氧化三甲胺的影响，使检测更为准确；乙腈具有良好的除蛋白作用且氧化三甲胺溶于乙腈，高效液相色谱串联质谱法检测干血斑氧化三甲胺是一种快速、准确且灵敏的方法，可应用于临床检测和科研研究，尤其适用于大样本的人群研究，样本保存时应注意保存温度、时间对干血斑中氧化三甲胺浓度的影响，lc
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ms/ms技术测定样本预处理过程更加简单、耗时短同时成本下降，避免大样本测定时受限制的问题，且干血斑制造涉及到的全血量更加的稀少。
具体实施方式
28.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施列1：
30.本发明提供的一种lc
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ms/ms技术测定干血斑中氧化三甲胺的方法，具体步骤如下：
31.s1、采集样本：用针扎破手指，并用少量的指尖血滴于滤纸上，使用采血滤纸采集指尖血或静脉血，合格滤纸干血片需要3个血斑，每个血斑直径大于8毫米，血滴自然渗透，滤纸正反面血斑一致血斑无污染，血斑无渗血环，并在室温下进行干燥，干燥完成后将氧化三甲胺样本放入含有干燥剂的密封袋内保存备用；
32.s2、样本处理：利用打孔器将氧化三甲胺样本上的有血部分打下并标记为a样本，取直径为6mm的a样本，加入超纯水为200μl，除蛋白液为10μl，并进行超声，超声条件控制在40khz、200w，并超声15min，加入水2ml，并进行涡流30s，加入的甲酸铵溶液为3ml，并进行涡流混合1min，往复振荡10min(240次
·
min－1)，离心5min(3500r
·
min－1)；
33.s3、lc
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ms/ms测定：离心后将a样本溶液置于4℃中，在分离后的0h、24h和72h进行测定并对浓度变化进行测定，分取上层有机相于另一试管中，40℃空气流下吹干，吸取90μl转移至密封的进样瓶后上机检测，以保留时间和质谱图定性，内标法定量，以此测氧化三甲胺。
34.进一步地，所述除蛋白液由超纯水稀释乙腈溶液获得。
35.进一步地，所述甲酸铵溶液制备方法是：称0.6306g的甲酸铵，用超纯水配成10mmol/l甲酸铵溶液，用甲酸调ph至3.0，0.45m滤膜过滤，超声脱气处理获得适用的甲酸铵溶液。
36.进一步地，所述lc
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ms/ms测定色谱条件：色谱柱为：ultimatesio，column(2.1mm
×
100mm，5ixm，welchmaterials，inc)，流动相：乙腈：10mmol/l、甲酸铵(ph3.0)＝70％：30％(v/v)，等度洗脱，流速：0.4ml/min，进样量：5μl，柱温：30℃。
37.进一步地，所述lc
‑
ms/ms测定质谱条件：离子源为电喷雾电离源(esi源)，喷雾电压4.2kv，离子源温度300℃，离子源气体1(n2)压力为0.3mpa，离子源气体2(n2)压力为0.3mpa，气帘气体(n2)压力为0.07mpa，碰撞气体(n2)压力为0.03mpa，正离子方式检测，去簇电压(dp)为54v，扫描方式为多反应监测(mrm)，碰撞能量(ce)为22v。
38.实施列2：
39.本发明提供的一种lc
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ms/ms技术测定干血斑中氧化三甲胺的方法，具体步骤如下：
40.s1、采集样本：用针扎破手指，并用少量的指尖血滴于滤纸上，并在室温下进行干燥，室温下干燥135min，干燥完成后将氧化三甲胺样本放入含有干燥剂的密封袋内保存备用；
41.s2、样本处理：利用打孔器将氧化三甲胺样本上的有血部分打下并标记为a样本，取直径为6mm的a样本，加入超纯水为230μl，除蛋白液为12μl，并进行超声，超声条件控制在
40khz、200w，并超声16min，加入水2ml，并进行涡流30s，加入的甲酸铵溶液为4ml，并进行涡流混合1min，往复振荡10min(240次
·
min－1)，离心5min(3500r
·
min－1)；
42.s3、lc
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ms/ms测定：离心后将a样本溶液置于4℃中，在分离后的0h、24h和72h进行测定并对浓度变化进行测定，分取上层有机相于另一试管中，40℃空气流下吹干，吸取90μl转移至密封的进样瓶后上机检测，以保留时间和质谱图定性，内标法定量，以此测氧化三甲胺。
43.进一步地，所述除蛋白液由超纯水稀释乙腈溶液获得。
44.进一步地，所述甲酸铵溶液制备方法是：称0.6306g的甲酸铵，用超纯水配成10mmol/l甲酸铵溶液，用甲酸调ph至3.0，0.45m滤膜过滤，超声脱气处理获得适用的甲酸铵溶液。
45.进一步地，所述lc
‑
ms/ms测定色谱条件：色谱柱为：ultimatesio，column(2.1mm
×
100mm，5ixm，welchmaterials，inc)，流动相：乙腈：10mmol/l、甲酸铵(ph3.0)＝70％：30％(v/v)，等度洗脱，流速：0.4ml/min，进样量：5μl，柱温：30℃。
46.进一步地，所述lc
‑
ms/ms测定质谱条件：离子源为电喷雾电离源(esi源)，喷雾电压4.2kv，离子源温度300℃，离子源气体1(n2)压力为0.3mpa，离子源气体2(n2)压力为0.3mpa，气帘气体(n2)压力为0.07mpa，碰撞气体(n2)压力为0.03mpa，正离子方式检测，去簇电压(dp)为54v，扫描方式为多反应监测(mrm)，碰撞能量(ce)为22v。
47.实施列3：
48.本发明提供的一种lc
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ms/ms技术测定干血斑中氧化三甲胺的方法，具体步骤如下：
49.s1、采集样本：用针扎破手指，并用少量的指尖血滴于滤纸上，并在室温下进行干燥，室温下干燥150min，干燥完成后将氧化三甲胺样本放入含有干燥剂的密封袋内保存备用；
50.s2、样本处理：利用打孔器将氧化三甲胺样本上的有血部分打下并标记为a样本，取直径为6mm的a样本，加入超纯水为260μl，除蛋白液为14μl，并进行超声，超声条件控制在40khz、200w，并超声17min，加入水2ml，并进行涡流30s，加入的甲酸铵溶液为5ml，并进行涡流混合1min，往复振荡10min(240次
·
min－1)，离心5min(3500r
·
min－1)；
51.s3、lc
‑
ms/ms测定：离心后将a样本溶液置于4℃中，在分离后的0h、24h和72h进行测定并对浓度变化进行测定，分取上层有机相于另一试管中，40℃空气流下吹干，吸取90μl转移至密封的进样瓶后上机检测，以保留时间和质谱图定性，内标法定量，以此测氧化三甲胺。
52.进一步地，所述除蛋白液由超纯水稀释乙腈溶液获得。
53.进一步地，所述甲酸铵溶液制备方法是：称0.6306g的甲酸铵，用超纯水配成10mmol/l甲酸铵溶液，用甲酸调ph至3.0，0.45m滤膜过滤，超声脱气处理获得适用的甲酸铵溶液。
54.进一步地，所述lc
‑
ms/ms测定色谱条件：色谱柱为：ultimatesio，column(2.1mm
×
100mm，5ixm，welchmaterials，inc)，流动相：乙腈：10mmol/l、甲酸铵(ph3.0)＝70％：30％(v/v)，等度洗脱，流速：0.4ml/min，进样量：5μl，柱温：30℃。
55.进一步地，所述lc
‑
ms/ms测定质谱条件：离子源为电喷雾电离源(esi源)，喷雾电
压4.2kv，离子源温度300℃，离子源气体1(n2)压力为0.3mpa，离子源气体2(n2)压力为0.3mpa，气帘气体(n2)压力为0.07mpa，碰撞气体(n2)压力为0.03mpa，正离子方式检测，去簇电压(dp)为54v，扫描方式为多反应监测(mrm)，碰撞能量(ce)为22v。
56.实施列1
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3通过lc
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ms/ms技术测定干血斑中氧化三甲胺的根据不同浓度的血样本溶液以及添加的不同比例的除蛋白液和甲酸铵溶液所测得的氧化三甲胺浓度数据
[0057][0058][0059]
由此可得实施列1通过lc
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ms/ms技术测定干血斑中氧化三甲胺的方法所测得的氧化三甲胺浓度最高同时最为准确。
[0060]
由上表对实施列1的lc
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ms/ms技术测定干血斑中氧化三甲胺的方法进行重复试验并得到相同温度条件下不同放置时间后对lc
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ms/ms技术测定结果的影响：
[0061][0062]
由上表可知在4℃保存24h后血样本氧化三甲胺浓度变化不明显，浓度变化在10％以内，但保存72h后，浓度升高明显，浓度变化为15.82％，因此在离心后应当尽快对样本进行lc
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ms/ms技术测定。
[0063]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，任何熟悉本领域的技术人员均可能利用上述阐述的技术方案对本发明加以修改或将其修改为等同的技术方案。因此，依据本发明的技术方案所进行的任何简单修改或等同置换，尽属于本发明要求保护的范围。