大肠杆菌O157:H7活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法与流程

大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明涉及微生物检测技术领域，特别是涉及一种大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.常见的大肠杆菌o157:h7的检测方法有常规培养技术、qpcr技术和胶体金免疫层析技术。常规培养技术操作繁琐费时，且需要专业人员操作，不利于现场快速检测；qpcr技术需要借助大型仪器完成，操作步骤繁琐，成本高，对专业人员和实验环境要求高，不利于现场快速检测；胶体金免疫层析技术只能进行定性分析，灵敏度低，干扰因素大。同时上述三种检测技术难以实现对死活菌的鉴别，容易出现假阳性或假阴性结果。


技术实现要素：

3.基于此，有必要针对现有的大肠杆菌o157:h7检测方法操作繁琐费时，不利于现场快速检测，灵敏度低，干扰因素大，准确率低的问题，本发明提供一种大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法，上述的大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条及试剂盒，能对大肠杆菌o157:h7的活菌进行快速、便捷、准确的检测，能够减少因死菌干扰出现的假阳性以及耐受菌导致的假阴性结构，灵敏度好、准确率高。
4.一种大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条，包括：样品垫、检测膜、吸水垫和底板；所述检测膜上分别设有包被大肠杆菌o157:h7抗体的检测线和包被羊抗鼠igg抗体或兔抗鼠igg抗体的质控线；所述检测膜设置在所述底板上，所述样品垫与所述检测膜靠近所述检测线一端连接，所述吸水垫与所述检测膜靠近所述质控线一端连接。
5.在其中一个实施例中，所述样品垫的制备步骤如下：制备样品垫预处理液，所述样品垫预处理液为含tween20和bsa的pbs缓冲液；将所述样品垫预处理液滴加至样品垫上，45℃烘干3～4小时，获得所述样品垫。
6.在其中一个实施例中，所述检测线的制备步骤如下：将pbs溶液稀释后的大肠杆菌o157:h7抗体在室温且湿度为30％～60％的环境中平衡后，划线于所述检测膜上，包被量为0.5～1.0μl/cm膜，置于37℃烘箱过夜。
7.在其中一个实施例中，所述质控线的制备步骤如下：将pbs溶液稀释后的羊抗鼠igg抗体或兔抗鼠igg抗体在室温且湿度为30％～60％的环境中平衡后，划线于所述检测膜上，包被量为0.5～1.0μl/cm膜，置于37℃烘箱过夜。
8.在其中一个实施例中，所述检测线与所述质控线之间的间隔为3～8mm。
9.一种大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试剂盒，包括：样品标记液、荧光微球标记小鼠igg抗体、检测卡以及如前述任一一项的大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条，所述检测卡具有检测腔，并设有与所述检测腔连通的加样槽和观察窗，所述大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条安装在所述检测腔内。
10.在其中一个实施例中，所述样品标记液的制备步骤如下：将syto
‑
9和pi两种核酸
荧光染料储液各取1～5μl于1ml无菌超纯水中，混匀，得到syto
‑
9与pi混合工作液，获得所述样品标记液。
11.在其中一个实施例中，所述荧光微球标记小鼠igg抗体的制备步骤如下：将粒径为200nm～400nm的荧光微球加入到hepes偶联缓冲液中，再加入待标记的小鼠igg抗体，小鼠igg抗体与荧光微球的比例为1:0.025～1:0.125，超声偶联5～30min，加入封闭液进行封闭，高速离心5～30min，用保存液洗涤重悬2～4次，4℃冰箱中保存。
12.一种大肠杆菌o157:h7活菌定量检测方法，包括如下步骤：
13.将待测样品与样品标记液按比例混匀，避光染色；用稀释液将荧光微球标记的小鼠igg抗体进行稀释，加入待测样品中；开启免疫荧光分析仪，读取标准曲线；向所述大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条加入所述经荧光微球标记的小鼠igg抗体标记的待测样品，反应5～20min，将所述大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条插入免疫荧光分析仪中，读取检测线和质控线的荧光强度，给出t值、c值以及t/c值，通过标准曲线可获取样品中大肠杆菌o157:h7活菌的浓度，并进行判断。
14.在其中一个实施例中，所述将待测样品与样品标记液按比例混匀，所述待测样品与样品标记液的体积比为0.5:1～2:1，所述避光染色时间为5～20min。
15.在其中一个实施例中，所述用稀释液将荧光微球标记的小鼠igg抗体进行稀释，稀释倍数为50～200倍，加样量为待测样品体积的2％～10％。
16.在其中一个实施例中，所述向所述大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条加入所述经荧光微球标记的小鼠igg抗体标记的待测样品，滴加待测样品的体积为50～100μl。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18.(一)、本发明采用的死活菌鉴别标记染料是核酸染料syto
‑
9和pi，syto
‑
9是一种能穿透完整细胞膜的小分子，pi是一种可以渗透到细胞膜破损细胞内的大分子，且pi可以取代syto
‑
9进行染色。两种染料染色后有完整质膜结构的细胞呈绿色，细胞膜结构被损坏的细胞呈红色，而且两种染料的激发光谱和发射光谱不同，其中syto
‑
9激发波长为485nm，发射波长为530nm，从而实现死菌和活菌的鉴别；
19.(二)、本发明结合死活菌鉴别标记染料和荧光免疫层析试剂条能对大肠杆菌o157:h7活菌进行定量检测，具有准确、检测方便、快捷、价格便宜、无需专业人员操作等优势，有利于基层的现场快速检测；
20.(三)、本发明制备的荧光免疫层析试剂条能减少因死菌干扰出现的假阳性结果以及耐受菌导致的假阴性结果，可应用于食品检测和生产过程中消毒效果的快速检测和即时评估。
附图说明
21.图1为本发明所述大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条的结构示意图；
22.图2为本发明所述大肠杆菌o157:h7活菌检测标准曲线。
23.1、底板；2、样品垫；3、检测膜；4吸水垫；5、检测线；6、质控线。
具体实施方式
24.为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实
施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
25.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
26.下面参照附图描述本发明一些实施例所述一种大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法。
27.实施例一：
28.本实施例提供了一种大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条。
29.如图1所示，包括：样品垫2、检测膜3、吸水垫4和底板1；检测膜3上分别设有包被大肠杆菌o157:h7抗体的检测线5和包被羊抗鼠igg抗体或兔抗鼠igg抗体的质控线6；检测膜3设置在底板1上，样品垫2与检测膜3靠近检测线5一端连接，吸水垫4与检测膜3靠近质控线6一端连接。
30.上述的一种大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条，检测膜3的检测线5上包被有大肠杆菌o157:h7抗体，可以特异性地结合待测样品中的大肠杆菌o157:h7菌体，并固定在检测线上，从而提高了试纸条对大肠杆菌o157:h7菌体的检测灵敏度和准确性，且通过免疫层析技术进行大肠杆菌o157:h7菌体的检测，操作简便、快捷，能够有效提高检测速度。
31.实施例二：
32.本实施例提供了一种大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条的制备方法。
33.(1)、样品垫的制备
34.制备样品垫预处理液，样品垫预处理液为含0.1～0.5％tween20和0.1～0.5％的bsa的pbs缓冲液(ph7.0～7.5)；
35.将样品垫预处理液滴加至样品垫上，45℃烘干3～4小时，获得样品垫。优选地，样品垫预处理液为含0.2％tween20和0.2％bsa的pbs缓冲液(ph7.4)。
36.(2)、检测膜上的检测线的制备
37.将经浓度为0.005～0.02mol/l，ph值为7.2～7.4的pbs溶液稀释后的大肠杆菌o157:h7抗体在室温且湿度为30％～60％的环境中平衡后，划线于检测膜上，包被量为0.5～1.0μl/cm膜，置于37℃烘箱过夜。
38.(3)、检测膜上的质控线的制备
39.将经浓度为0.005～0.02mol/l，ph值为7.2～7.4的pbs溶液稀释后的羊抗鼠igg抗体或兔抗鼠igg抗体在室温且湿度为30％～60％的环境中平衡后，划线于所述检测膜3上，包被量为0.5～1.0μl/cm膜，置于37℃烘箱过夜。
40.(4)、检测线5与质控线6在检测膜3上的间隔为3～8mm。从而使免疫层析过程中，待测样品中的大肠杆菌o157:h7菌体能有足够的时间和空间进行免疫结合反应，提高o157:h7活菌定量检测结果的准确性。
41.实施例三：
42.本实施例提供了一种大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试剂盒，包括：样品标记液、荧光微球标记小鼠igg抗体、检测卡以及大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条，检测卡具有检测腔，并设有与检测腔连通的加样槽和观察窗，大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条
安装在检测腔内。
43.实施例四：
44.本实施例提供了一种大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试剂盒的制备方法。
45.(1)、样品标记液的制备
46.将syto
‑
9和pi两种核酸荧光染料储液各取1～5μl于1ml无菌超纯水中，混匀，得到syto
‑
9与pi混合工作液，获得样品标记液。
47.优选地，在一些实施例中，syto
‑
9的储存浓度为3.34mm，pi的浓度为20mm，将syto
‑
9和pi储液溶解在20％dmso中，于
‑
20℃避光保存。各取3ul syto
‑
9储存液与pi储存液于1ml无菌超纯水中，混匀，得到syto
‑
9与pi混合工作液，作为样品标记液。
48.(2)、荧光微球标记小鼠igg抗体的制备
49.将东莞汉诺生物技术有限公司生产的粒径为200nm～400nm的绿色荧光微球加入到hepes偶联缓冲液中，再加入待标记的小鼠igg抗体，小鼠igg抗体与绿色荧光微球的比例为1:0.025～1:0.125，超声偶联5～30min，加入封闭液进行封闭，封闭剂优选是牛血清白蛋白。高速离心5～30min，用保存液洗涤重悬2～4次，4℃冰箱中保存。
50.优选地，在一些实施中，将粒径为200nm～400nm的绿色荧光微球加入到0.025～0.2m的hepes偶联缓冲液中，再加入待标记的小鼠igg抗体，抗体与微球的比例为1:0.075，超声偶联10min。
51.(3)、样品垫的制备
52.将样品垫预处理液滴加在样品垫上，45℃烘3
‑
4小时。其中，样品垫预处理液为含0.1～0.5％tween20和0.1～0.5％的bsa的pbs缓冲液(ph7.0～7.5)。
53.(4)、检测膜的制备
54.将浓度为0.005～0.02mol/l，ph值为7.2～7.4的pbs溶液稀释后的大肠杆菌o157:h7抗体和羊抗鼠igg抗体或兔抗鼠igg抗体分别作为检测线和质控线，划线于检测膜上，检测线靠近样品垫，质控线靠近吸水垫，两条线之间的间隔为3～8mm，包被量为0.5～1μl/cm膜，置于37℃烘箱过夜。
55.(5)、将处理好的样品垫、检测膜以及吸水垫依次粘贴于底板上，切割成3～4mm的试纸条，并装入检测卡壳中。
56.上述实施例提供的一种大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试剂盒，包括：样品标记液、荧光微球标记的小鼠igg抗体、检测卡以及大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条，其中使用包含syto
‑
9和pi两种核酸荧光染料的样品标记液对待测样品中的大肠杆菌o157:h7的活菌和死菌分别进行标记，syto
‑
9是一种能穿透完整细胞膜的小分子，pi是一种可以渗透到细胞膜破损细胞内的大分子，且pi可以取代syto
‑
9进行染色。两种染料染色后有完整质膜结构的细胞呈绿色，细胞膜结构被损坏的细胞呈红色，从而实现死菌和活菌的鉴别。标记后的待测样品再与绿色荧光微球标记的小鼠igg抗体溶液进行反应，使待测样品中待测菌体结合上绿色荧光微球，最终通过将待测样品液滴入检测卡内的大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条上，使待测样品中加入荧光微球标记的菌体与检测膜上检测线的大肠杆菌o157:h7
‑
bsa抗体特异性结合，并在试纸条上形成相应的红、绿荧光，通过免疫荧光分析仪读取检测线和质控线的荧光强度，给出t值、c值以及t/c值，通过标准曲线可获取样品中大肠杆菌o157:h7活菌的浓度，并进行判断。
57.实施例五：
58.本实施例提供了一种大肠杆菌o157:h7活菌定量检测方法，包括如下步骤：
59.(1)、将待测样品与样品标记液按比例混匀，避光染色；
60.可选地，待测样品与样品标记液的体积比为0.5:1～2:1，避光染色时间为5～20min；
61.优选地，待测样品与样品标记液的体积比为1:1，避光染色时间为10min；
62.(2)、用稀释液将荧光微球标记的小鼠igg抗体进行稀释，加入待测样品中；
63.可选地，用稀释液将荧光微球标记的小鼠igg抗体进行稀释，稀释倍数为50～200倍，加样量为待测样品体积的2％～10％；
64.优选地，用稀释液将荧光微球标记的小鼠igg抗体进行稀释，稀释倍数为100倍，加样量为待测样品体积的5％；
65.(3)、开启免疫荧光分析仪，插入相应基质的id卡，读取标准曲线；
66.(4)、将大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条恢复至室温使用，向大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条加入经荧光微球标记的小鼠igg抗体标记的待测样品，反应5～20min；
67.可选地，向大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条加入经荧光微球标记的小鼠igg抗体标记的待测样品，滴加待测样品的体积为50～100μl。
68.优选地，滴加待测样品的体积为50μl。
69.(5)、将大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条插入免疫荧光分析仪中，读取检测线和质控线的荧光强度，给出t值、c值以及t/c值，通过标准曲线可获取样品中大肠杆菌o157:h7活菌的浓度，并进行判断。
70.实施例六：
71.本实施例为实施例五中大肠杆菌o157:h7活菌进行定量检测中，标准曲线的建立方法，如图2所示：
72.本实施例中标准曲线建立所使用的大肠杆菌o157:h7菌株保藏于美国菌种保藏中心(atcc)，菌株编号为：atcc35150，任何公众都可以通过商业途径向其购买。
73.对培养至对数期的大肠杆菌o157:h7菌悬液进行平板计数，取od值在0.5～1.0的菌液1ml，8000rpm离心5min，除去培养基等上清液。无菌pbs洗涤菌体2次后，将菌液稀释并通过10倍倍比连续稀释得到系列浓度梯度，浓度数量级范围依次为：104cfu/ml、105cfu/ml、106cfu/ml、107cfu/ml，共四个浓度梯度，每个浓度梯度设三个重复，通过不同浓度的菌悬液来制备标准曲线。吸取菌液100ul和样品标记液100ul，吹打混匀，每个浓度设置3个重复，暗室孵育15min后，取含不同浓度标记菌液80ul加入到试剂条上，反应10分钟后，将试剂条插入到配套的免疫荧光分析仪，得到t/c值，以标准品浓度为横坐标，t/c值为纵坐标，建立方程并拟合成标准曲线，具体数值如表1所示。
74.表1不同浓度大肠杆菌o157:h7活菌检测值
75.[0076][0077]
根据表1的数据，以大肠杆菌o157:h7活菌浓度为横坐标，以t/c值为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线如图2所示，该标准曲线线性良好(r2＝0.9959)，可以通过该曲线进行定量检测。由表1数据可知，检测大肠杆菌o157:h7活菌的灵敏度可达4.7
×
104cfu/ml，各浓度点的cv均低于在15％。
[0078]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0079]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。