准确区分紫海胆-中间球海胆和紫海胆上市性腺的方法与流程

准确区分紫海胆
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中间球海胆和紫海胆上市性腺的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种准确区分紫海胆
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中间球海胆和紫海胆上市性腺的方法。


背景技术：

2.可食用海胆是全球渔业经济的重要组成部分，其性腺是广受消费者欢迎的海珍品，同时也是中医学的传统药物之一。中间球海胆（strongylocentrotus intermedius）又称虾夷马粪海胆，原产于日本北方及俄罗斯远东部分沿海地区。与其它可食用海胆种类相比，中间球海胆具有性腺色泽好、不饱和脂肪酸含量高、口感甜润等特点，深受东南亚地区消费者喜爱，市场需求量逐年增加，目前已在辽宁、山东等地形成养殖规模。研究显示，中间球海胆的最适生长水温为15℃~20℃，当水温升高到23℃时，会引起中间海胆的大量死亡。紫海胆（anthocida riscrassispina）是自然分布于我国南方海域的海胆种类，对高温环境具有较高的耐受性。实验证实，以紫海胆(
♀
)和中间球海胆(
♂
)为亲本杂交产生的紫海胆
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中间球海胆杂交种，12月龄时的性腺在不饱和脂肪酸及物活性物质含量等方面相较于紫海胆具有优于母本的性腺品质。然而，紫海胆
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中间球海胆杂交种的性腺与紫海胆性腺具有相似的颜色，很难用常规的颜色、弹性以及饱满度等传统指标进行区分，而且两种海胆中部分性腺的不饱和脂肪酸与生物活性物质在相对含量上存在一定的重合区间，导致亦不能以两者在营养成分上的区别点为标志而进行准确区分。因此，对紫海胆
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中间球海胆和紫海胆上市性腺的质量分级以及定价等方面造成一定的影响。


技术实现要素：

3.本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种准确区分紫海胆
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中间球海胆和紫海胆上市性腺的方法，本发明的技术解决方案是：一种准确区分紫海胆
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中间球海胆和紫海胆上市性腺的方法，依次按照如下步骤进行：a. 取待区分紫海胆
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中间球海胆上市性腺或紫海胆上市性腺，制成液相色谱
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质谱分析用样本；b. 采用液相色谱
‑
质谱联用分析仪对样本进行小分子代谢物组学分析，获得样本中的小分子代谢物相对含量；c. 选出样本中同时有15种小分子代谢物相对含量均位于标准区间值的海胆性腺为紫海胆
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中间球海胆性腺，否则为紫海胆性腺，所述15种小分子代谢物及相对含量标准区间值如下：5'
‑
单磷酸腺苷1544935
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2683833；柠檬酸哌嗪 27169
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34038；苯氧苄胺盐酸盐16285
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39853；阿匹啶13729
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27718；攀打胺7160
‑
18202；腺嘌呤57401
‑
134457；磷酸乙醇酸磷酸酶(22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z)/20:2(11z,14z)) 125
‑
29861；n
‑
乙酰咪唑4389
‑
25508；（3s）
‑2‑
氧代
‑3‑
苯基丁酸2922
‑
21405；lysopa(22:0/0:0) 251
‑
11093；1
‑
十二烷基
‑
sn
‑
甘油2995
‑
10281；3β
‑
羟基孕烷
‑5‑
烯
‑
20
‑
酮硫酸盐1075
‑
4203；2,2'
‑
（3
‑
甲基环己烷
‑
1,1
‑
二酰基）二乙酸345
‑
9888；(ara
‑
f)3
‑
hyp1452
‑
11140；前列腺素e2对苯甲酰胺苯酯133
‑
8733。
4.所述a步骤依次如下：称取上市性腺50
±
2 mg加入到2 ml 离心管中，加入
‑
20℃预冷的500 ul内含1 ppm的2
‑
氯苯丙氨酸的甲醇溶液中，所述甲醇溶液的质量浓度为70%；超声匀浆4次，每次30 s，30 hz；匀浆后振荡5 min，冰上静置15 min；在4℃，12000 r/min下离心10 min，吸取上清液400 ul到另一个离心管中；在原离心管沉淀中加入500 ul乙酸乙酯/甲醇溶液，所述乙酸乙酯与甲醇的体积比为1：3，振荡5 min，冰上静置15 min，在4℃、12000 rmp下离心10min，取上清液400 ul；合并两次上清液，浓缩干燥；干燥物加入100 ul 质量浓度为70%的甲醇溶液，超声3min，在4℃，12000 r/min下离心3 min，吸取60 ul上清液，即制成液相色谱
‑
质谱分析用样本。
5.所述b步骤如下：所述液相色谱
‑
质谱联用分析仪的条件：色谱柱：waters t3 c18柱，i.d.2.1
×
100 mm, 1.8 μm；流动相a：质量0.04%甲酸/水；流动相b：含有质量0.04%甲酸的纯乙腈；柱温：35℃；流速：0.3ml/min；进样量：1 ul；质谱下机原始数据经过proteowizard 转换为mzml格式，采用xcms程序进行峰提取，对齐，保留时间校正；采用svr方法对峰面积进行校正并对各组样本中缺失率>50%的峰进行过滤；校正筛选后的峰，计算小分子代谢物质谱图中的峰面积以确定代谢物的相对含量，同时确定小分子代谢物种类。
6.本发明是以15种小分子代谢物的相对含量标准区间值为标志区分紫海胆
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中间球海胆杂交种上市性腺与紫海胆上市性腺的方法，首先取待区分的海胆上市性腺并经过前期处理制成样本，通过液相色谱
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质谱联用分析仪对样本进行小分子代谢物检测，进而取样本中15种小分子代谢物的相对含量均位于标准区间值的海胆上市性腺为紫海胆
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中间球海胆杂交种的性腺。可以准确地将紫海胆
‑
中间球海胆杂交种上市性腺与紫海胆上市性腺进行区分，准确率达到100%，有助于紫海胆
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中间球海胆和紫海胆上市性腺的质量分级以及定价。
具体实施方式
7.本发明是按照如下步骤获得标志物—15种小分子代谢物及相对含量标准区间值：步骤1：各选取60只健康有活力的成体中间球海胆和紫海胆进行常规养殖，所述养殖期间每天按每只海胆投喂10
‑
20g新鲜海带，养殖水体为20
±
1℃自然海水（盐度为30
±
1，ph值8.0），每天换水一次且换水前后的水温差不大于1℃；步骤2：繁殖期间，催产中间球海胆和紫海胆各30只，选取5只产卵量最高的雌性紫海胆和5只精子质量最好的雄性中间球海胆进行杂交，获得其后代杂交海胆；同时各选择5只雌雄紫海胆进行自交（挑选标准与前文相同）；两组后代均按照步骤1进行正常投喂，养殖至16月龄且规格满足上市要求；步骤3：每个组至少随机选取6只海胆，解剖获取性腺，分别按照下列方法制成液相
色谱
‑
质谱分析用样本：称取管足50
±
2 mg加入到2 ml 离心管中，加入
‑
20℃预冷的500 ul内含1 ppm的2
‑
氯苯丙氨酸的甲醇溶液中，所述甲醇溶液的质量浓度为70%；超声匀浆4次，每次30 s，30 hz；匀浆后振荡5 min，冰上静置15 min；在4℃，12000 r/min下离心10 min，吸取上清液400 ul到另一个离心管中；在原离心管沉淀中加入500 ul乙酸乙酯/甲醇溶液，所述乙酸乙酯与甲醇的体积比为1：3，振荡5 min，冰上静置15 min，在4℃、12000 rmp下离心10min，取上清液400 ul；合并两次上清液，浓缩干燥；干燥物加入100 ul 质量浓度为70%的甲醇溶液，超声3min，在4℃，12000 r/min下离心3 min，吸取60 ul上清液，即制成液相色谱
‑
质谱分析用样本；步骤4：采用液相色谱
‑
质谱联用分析仪（lc
‑
ms/ms）对两组样本进行小分子代谢物组学分析，获得每组样本中的小分子代谢物相对含量； 色谱柱：waters t3 c18柱，i.d.2.1
×
100 mm, 1.8 μm；流动相a：质量0.04%甲酸/水；流动相b：含有质量0.04%甲酸的纯乙腈； 柱温：35℃；流速：0.3ml/min；进样量：1 ul； 质谱下机原始数据经过proteowizard 转换为mzml格式，采用xcms程序进行峰提取，对齐，保留时间校正；采用svr方法对峰面积进行校正并对各组样本中缺失率>50%的峰进行过滤；校正筛选后的峰，利用svr回归分析计算代谢物质谱图中的峰面积以确定代谢物的相对含量；根据代谢物在色谱中的通过速度、代谢物从质谱进样开始至达到峰顶时的保留时间以及代谢物二次解离后在质谱中的保留时间，利用metdna方法与已知代谢物标准品的色谱通过速度、质谱保留时间以及二次解离后在质谱中的保留时间等信息进行比对，确定代谢物种类并进行注释；最后通过r程序进行统计学分析； 步骤5：结合单变量分析的p
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value和差异倍数值（fold change，fc）来进一步筛选出紫海胆与紫海胆
‑
中间球海胆杂交种性腺中相对含量存在显著性差异的15种小分子代谢物并确定其相对含量区间值（如下表所示）。
8.从上表可以看出，紫海胆和紫海胆
‑
中间球海胆杂交种性腺中的15种小分子代谢物相对含量区间值存在较大差异，故以15种小分子代谢物及其相对含量标准区间值作为区分紫海胆
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中间球海胆杂交种上市性腺的标志物。
9.本发明的技术解决方案是：一种准确区分紫海胆
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中间球海胆和紫海胆上市性腺的方法，依次按照如下步骤进行：a. 取待区分紫海胆
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中间球海胆上市性腺或紫海胆上市性腺，制成液相色谱
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质谱分析用样本：称取上市性腺50
±
2 mg加入到2 ml 离心管中，加入
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20℃预冷的500 ul内含1 ppm的2
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氯苯丙氨酸的甲醇溶液中，所述甲醇溶液的质量浓度为70%；超声匀浆4次，每次30 s，30 hz；匀浆后振荡5 min，冰上静置15 min；在4℃，12000 r/min下离心10 min，吸取上清液400 ul到另一个离心管中；在原离心管沉淀中加入500 ul乙酸乙酯/甲醇溶液，所述乙酸乙酯与甲醇的体积比为1：3，振荡5 min，冰上静置15 min，在4℃、12000 rmp下离心10min，
取上清液400 ul；合并两次上清液，浓缩干燥；干燥物加入100 ul 质量浓度为70%的甲醇溶液，超声3min，在4℃，12000 r/min下离心3 min，吸取60 ul上清液，即制成液相色谱
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质谱分析用样本。
10.b. 采用液相色谱
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质谱联用分析仪对样本进行小分子代谢物组学分析，获得样本中的小分子代谢物相对含量：所述液相色谱
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质谱联用分析仪的条件：色谱柱：waters t3 c18柱，i.d.2.1
×
100 mm, 1.8 μm；流动相a：质量0.04%甲酸/水；流动相b：含有质量0.04%甲酸的纯乙腈；柱温：35℃；流速：0.3ml/min；进样量：1 ul；质谱下机原始数据经过proteowizard 转换为mzml格式，采用xcms程序进行峰提取，对齐，保留时间校正；采用svr方法对峰面积进行校正并对各组样本中缺失率>50%的峰进行过滤；校正筛选后的峰，利用svr回归分析计算代谢物质谱图中的峰面积以确定代谢物的相对含量；根据代谢物在色谱中的通过速度、代谢物从质谱进样开始至达到峰顶时的保留时间以及代谢物二次解离后在质谱中的保留时间，利用metdna方法与已知代谢物标准品的色谱通过速度、质谱保留时间以及二次解离后在质谱中的保留时间等信息进行比对，确定代谢物种类并进行注释；c. 选出样本中同时有15种小分子代谢物相对含量均位于标准区间值的海胆性腺为紫海胆
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中间球海胆性腺，否则为紫海胆性腺，所述15种小分子代谢物及相对含量标准区间值如下：5'
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单磷酸腺苷1544935
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2683833；柠檬酸哌嗪 27169
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34038；苯氧苄胺盐酸盐16285
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39853；阿匹啶13729
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27718；攀打胺7160
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18202；腺嘌呤57401
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134457；磷酸乙醇酸磷酸酶(22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z)/20:2(11z,14z)) 125
‑
29861；n
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乙酰咪唑4389
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25508；（3s）
‑2‑
氧代
‑3‑
苯基丁酸2922
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21405；lysopa(22:0/0:0) 251
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11093；1
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十二烷基
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sn
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甘油2995
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10281；3β
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羟基孕烷
‑5‑
烯
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20
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酮硫酸盐1075
‑
4203；2,2'
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（3
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甲基环己烷
‑
1,1
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二酰基）二乙酸345
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9888；(ara
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f)3
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hyp1452
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11140；前列腺素e2对苯甲酰胺苯酯133
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8733。
11.实验例：a. 取16月龄以上且规格满足上市要求的具有紫海胆外形的紫
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中杂交海胆6只和紫海胆个体6只，分别解剖获取性腺组织并进行标号，之后随机打乱顺序至无法区分，作为待区分海胆；b. 将所获得的性腺组织制成液相色谱
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质谱分析用样本；c. 按照本发明实施例的方法对各样本进行代谢组学分析，取15种小分子代谢物的相对含量均位于标准区间值的海胆为鉴别紫海胆
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中间球海胆杂交种的性腺，其余为紫海胆性腺，d. 与标号比对结果显示，本发明实施例的方法区分紫海胆
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中间球海胆和紫海胆上市性腺方法的准确率为100%。