一种组织工程修复支架及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及生物医学材料技术领域，具体涉及一种组织工程修复支架及其制备方法与应用。


背景技术：

2.成熟的软骨没有血管、神经组织和淋巴管，一旦损伤，其自我修复能力非常有限。软骨不同于其它具有血管的组织，因缺少血供，导致很难获得血管中的营养物质。软骨细胞分布在稠密的细胞外基质中，迁移能力较差，软骨损伤后软骨细胞不能快速的聚集到软骨缺损部位参与修复，很小的软骨缺损都可能会导致严重的软骨病变，如关节炎和关节退变等，所以自我修复能力差。
3.骨是人体最大、但也最容易受到损伤的组织器官。与软组织相比较而言，骨组织具有很高的硬度，是一种坚硬的结缔组织，从而发挥其支架作用，是人体最重要的组织之一。一直以来，创伤、感染、肿瘤切除等因素造成的骨组织缺损和相关病症，严重影响人们的健康和生活。尤其创伤、肿瘤切除等因素造成的大面积骨缺损，更是临床骨缺损治疗的难点。因此，骨缺损修复长期以来始终是医学界持续研究的重要领域之一。组织工程是一门多学科交叉的学科，它运用细胞生物学和工程学的原理，从体内获得组织细胞或者具有分化能力的干细胞，在体外种植在具有优异生物相容性的支架材料上培养、增殖，构建工程化的组织，植入到组织缺损处，达到修复和重建组织的目的。运用组织工程的方法修复缺损软骨组织是一种非常有前途的方法。
4.三维打印技术是一种新型制造技术，已应用于仿生组织器官的个性化打印中。其具有制造精度高、空间层次结构清晰、制作效率高、个性化适配性好等优点。运用三维打印技术和气凝胶工艺制备填充气凝胶的组织工程修复支架，三维打印支架可以提供力学支持，填充的气凝胶可以模拟细胞外基质的纤维结构，促进细胞的生长。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种组织工程修复支架的制备方法，本发明所得组织工程修复支架能够促进细胞的生长，促进软骨缺损、骨缺损等的修复。
6.本发明是通过如下技术方案实现的：
7.一种组织工程修复支架的制备方法，该方法包括如下步骤：
8.(1)将聚乳酸聚乙醇酸共聚物和明胶溶于有机溶剂中，得到聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶纺丝液；
9.(2)将所述聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶纺丝液静电纺丝，然后干燥，得到聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶的生物纳米纤维膜；
10.(3)将所述生物纳米纤维膜剪碎后加入分散液中，匀浆粉碎处理，得到碎纤维混合液；
11.(4)三维打印圆柱形网状支架并高温固化；
12.(5)将所述碎纤维混合液与所述圆柱形网状支架，在模具中浇筑成型，交联，得到组织工程修复支架。本发明中的三维打印圆柱形网状支架作为框架，明胶填充在网格之中。
13.进一步地，步骤(1)中所述聚乳酸聚乙醇酸共聚物与所述明胶的质量比为1：(3
‑
8)；所述的有机溶剂为六氟异丙醇；将所述聚乳酸聚乙醇酸共聚物和所述明胶溶于六氟异丙醇中，得到10
‑
15wt％的聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶纺丝液。
14.进一步地，步骤(2)中所述静电纺丝的工艺参数为:电压10
‑
14kv，锡箔纸作为接收装置，接收距离10
‑
15cm，纺丝速率2.0
‑
3.0ml/h；所述干燥为真空干燥，且真空度为
‑
35至
‑
25kpa，干燥温度为22
‑
26℃，干燥时间为24
‑
48小时。
15.进一步地，步骤(3)中所述分散液为叔丁醇；所述匀浆的工艺参数为:转速8000
‑
13000rmp，匀浆时间10
‑
15分钟；所述碎纤维混合液的含固率为1％
‑
2％。具体的，含固率是指溶质占溶剂体积的质量体积比，如1％指1g聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶的生物纳米纤维膜分散于100ml的叔丁醇溶液中。
16.进一步地，步骤(4)中所述圆柱形网状支架的材料为羟基磷灰石粉末；所述圆柱形网状支架的直径为6.8
‑
7.0mm，厚度为2.8
‑
3.2mm，线距为1.6
‑
2.0mm，线条交联角度90
°
；三维打印的溶液为f127水溶液，所述羟基磷灰石与f127水溶液的质量比为1：1；所述高温固化的温度为1050
‑
1150℃，固化时间为2
‑
5小时。
17.进一步地，三维打印的工艺参数为：打印机针头移动速度为2.0
‑
3.0mm/s，喷料速度为0.02
‑
0.03mm/s，打印机管腔温度为室温，打印机针头温度为室温，针头选用21g点胶针头；所述f127水溶液中f127的质量分数为20％。
18.进一步地，步骤(5)在模具中浇筑成型具体为：模具为6孔板，先将高温固化后的圆柱形网状支架放入96孔板中，然后进行碎纤维混合液浇筑，浇筑好后先置于
‑
20℃条件下2
‑
4小时，再置于
‑
80℃条件下12
‑
24小时，然后放入冷冻干燥机中48
‑
72小时冷冻干燥；所述交联为热交联，交联温度为170
‑
190℃，交联时间为2
‑
3小时。
19.一种组织工程修复支架，其特征在于，采用上述的制备方法制得。本发明以羟基磷灰石三维打印圆柱形网状支架作为框架，并填充聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶气凝胶，制备三维多孔组织工程修复支架。
20.一种组织工程修复支架的应用，其特征在于，将上述的制备方法制得的组织工程修复支架用于软骨缺损修复或骨缺损修复中。
21.本发明的有益效果：
22.(1)本发明的羟基磷灰石三维打印框架(圆柱形网状支架)，具有较强的机械性能，聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶气凝胶具有纳米纤维结构，是一种多孔的仿细胞外基质纤维结构的材料；本发明所得组织工程修复支架能够促进细胞的生长，促进软骨缺损、骨缺损等修复。
23.(2)本发明的材料来源于羟基磷灰石，高分子聚合物和明胶，所需材料容易获得且加工方式为静电纺丝和三维打印结合，进而制备的支架力学性能、气凝胶的纤维多孔结构等特征更能模拟生物体组织生长的微环境。
24.(3)本发明以羟基磷灰石为材料三维打印的圆柱形网状支架可以提供良好的力学支撑；气凝胶具有纳米纤维结构，可以仿生细胞外基质；高孔隙率可以促进细胞生长，可应用于软骨缺损修复、骨缺损修复等组织工程领域。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
26.图1为本发明实施例1三维打印羟基磷灰石圆柱形网状支架的扫描电镜图；
27.图2为本发明实施例1填充气凝胶的三维打印羟基磷灰石组织工程修复支架的扫描电镜图；
28.图3为气凝胶的压缩回弹应力应变曲线。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例1
31.一种组织工程修复支架的制备方法，包括如下步骤：
32.(1)将0.2g的聚乳酸聚乙醇酸共聚物(分子量100000，济南岱罡有限公司)和1.0g的明胶(北京伊诺凯，innochem，b76801)溶于10ml的六氟异丙醇(>99％，上海达瑞化工有限公司)中，得到质量分数为12％的聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶纺丝液；
33.(2)将所得聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶纺丝液吸入注射器中，控制微量注射泵推进速率为2.5ml/h，连接14kv的高压电源与注射器针头相连，用铝箔接收，接收距离为15cm，静电纺丝，然后在真空度为
‑
25kpa，干燥温度为25℃的条件下，真空干燥24小时，得到聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶的生物纳米纤维膜；
34.(3)将所得的生物纳米纤维膜用剪刀剪成0.5
×
0.5cm大小的片状，然后称取1.0g该片状生物纳米纤维膜加入到含100ml的叔丁醇中，用高速粉碎机将片状的生物纳米纤维膜粉碎成均匀的短纤维溶液(粉碎机的转速为10000rpm，粉碎时间为15分钟)，得到含固率为1％的碎纤维混合液；
35.(4)三维打印模型设计：圆柱形网状支架的直径为6.8mm，线距2mm，线条交联角度设定为0
°
和90
°
，平面层数为8层，每层高度为0.4mm；三维打印羟基磷灰石粉末(粒径200nm，aldrich)圆柱形网状支架：将0.1g的f127(aldrich)溶于去离子水中，得到5ml20％的f127溶液，然后与5g羟基磷灰石混合搅拌均匀，将混合液倒入打印机的管腔中，通过软件控制打印机针头移动速度为2mm/s，喷料速度为0.02mm/s，打印机管腔温度为室温，打印机针头温度为室温，针头选用21g点胶针头；圆柱形网状支架的高温固化：将圆柱形网状支架放入马弗炉中，高温固化处理，固化处理的温度为1100℃，固化处理的时间为3小时，固化后的圆柱体支架的直径5.8mm；
36.(5)将高温固化处理后的圆柱体网状支架放入孔板中，将制备的碎纤维混合液浇筑在圆柱体网状支架的网格中，随后置于
‑
20℃的冰箱中2小时，再置于
‑
80℃的冰箱中12小时，然后放入冷冻干燥机中72小时至完全冷冻干燥，得到碎纤维未交联的组织工程修复支
架；组织工程修复支架的交联：将圆柱形网状支架放入马弗炉中，高温处理，温度为190℃，时间为2小时，得到组织工程修复支架(即填充气凝胶的三维打印羟基磷灰石组织工程修复支架)。
37.通过扫描电镜(sem)观察实施例1步骤(4)中的三维打印羟基磷灰石圆柱形网状支架，如图1所示，从图1中可以看出三维打印圆柱形网状支架的线径约为400微米，形成了直径约300微米的孔，孔中可以填充气凝胶；通过扫描电镜(sem)观察实施例1步骤(5)中的组织工程修复支架(即填充气凝胶的三维打印羟基磷灰石组织工程修复支架)，如图2所示，从图2中可以看出气凝胶是纳米纤维网状结构，模拟了细胞外基质的结构，可以促进细胞生长；对气凝胶进行压缩回弹实验，得到应力应变曲线，如图3所示，气凝胶压缩到60％可以回弹，填充气凝胶的三维打印组织工程修复支架内部是纤维多孔结构，有利于细胞的生长。
38.实施例2
39.一种组织工程修复支架的制备方法，包括如下步骤：
40.(1)将0.2g的聚乳酸聚乙醇酸共聚物(分子量100000，济南岱罡有限公司)和0.6g的明胶(北京伊诺凯，innochem，b76801)溶于六氟异丙醇(>99％，上海达瑞化工有限公司)中，得到质量分数为10％的聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶纺丝液；
41.(2)将所得聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶纺丝液吸入注射器中，控制微量注射泵推进速率为2.0ml/h，连接13kv的高压电源与注射器针头相连，用铝箔接收，接收距离为10cm，静电纺丝，然后在真空度为
‑
35kpa，干燥温度为22℃的条件下，真空干燥48小时，得到聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶的生物纳米纤维膜；
42.(3)将所得的生物纳米纤维膜用剪刀剪成0.5
×
0.5cm大小的片状，然后称取2.0g该片状生物纳米纤维膜加入到含100ml的叔丁醇中，用高速粉碎机将片状的生物纳米纤维膜粉碎成均匀的短纤维溶液(粉碎机的转速为8000rpm，粉碎时间为13分钟)，得到含固率为2％的碎纤维混合液；
43.(4)三维打印模型设计：圆柱形网状支架的直径为6.8mm，线距1.8mm，线条交联角度设定为0
°
和90
°
，平面层数为8层，每层高度为0.4mm；三维打印羟基磷灰石粉末(粒径200nm，aldrich)圆柱形网状支架：将0.1g的f127(aldrich)溶于去离子水中，得到5ml 20％的f127溶液，然后与5g羟基磷灰石混合搅拌均匀，将混合液倒入打印机的管腔中，通过软件控制打印机针头移动速度为3mm/s，喷料速度为0.03mm/s，打印机管腔温度为室温，打印机针头温度为室温，针头选用21g点胶针头；圆柱形网状支架的高温固化：将圆柱形网状支架放入马弗炉中，高温固化处理，固化处理的温度为1050℃，固化处理的时间为5小时，固化后的圆柱体支架的直径5.8mm；
44.(5)将高温固化处理后的圆柱体网状支架放入孔板中，将制备的碎纤维混合液浇筑在圆柱体网状支架的网格中，随后置于
‑
20℃的冰箱中3小时，再置于
‑
80℃的冰箱中24小时，然后放入冷冻干燥机中60小时至完全冷冻干燥，得到碎纤维未交联的组织工程修复支架；组织工程修复支架的交联：将圆柱形网状支架放入马弗炉中，高温处理，温度为170℃，时间为3小时，得到组织工程修复支架。
45.实施例3
46.一种组织工程修复支架的制备方法，包括如下步骤：
47.(1)将0.2g的聚乳酸聚乙醇酸共聚物(分子量100000，济南岱罡有限公司)和1.6g
的明胶(北京伊诺凯，innochem，b76801)溶于六氟异丙醇(>99％，上海达瑞化工有限公司)中，得到质量分数为15％的聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶纺丝液；
48.(2)将所得聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶纺丝液吸入注射器中，控制微量注射泵推进速率为3.0ml/h，连接10kv的高压电源与注射器针头相连，用铝箔接收，接收距离为12cm，静电纺丝，然后在真空度为
‑
30kpa，干燥温度为24℃的条件下，真空干燥36小时，得到聚乳酸聚乙醇酸共聚物/明胶的生物纳米纤维膜；
49.(3)将所得的生物纳米纤维膜用剪刀剪成0.5
×
0.5cm大小的片状，然后称取1.5g该片状生物纳米纤维膜加入到含100ml的叔丁醇中，用高速粉碎机将片状的生物纳米纤维膜粉碎成均匀的短纤维溶液(粉碎机的转速为13000rpm，粉碎时间为10分钟)，得到含固率为2％的碎纤维混合液；
50.(4)三维打印模型设计：圆柱形网状支架的直径为7.0mm，线距1.6mm，线条交联角度设定为0
°
和90
°
，平面层数为8层，每层高度为0.4mm；三维打印羟基磷灰石粉末(粒径200nm，aldrich)圆柱形网状支架：将0.1g的f127(aldrich)溶于去离子水中，得到5ml20％的f127溶液，然后与5g羟基磷灰石混合搅拌均匀，将混合液倒入打印机的管腔中，通过软件控制打印机针头移动速度为2.5mm/s，喷料速度为0.025mm/s，打印机管腔温度为室温，打印机针头温度为室温，针头选用21g点胶针头；圆柱形网状支架的高温固化：将圆柱形网状支架放入马弗炉中，高温固化处理，固化处理的温度为1150℃，固化处理的时间为2小时，固化后的圆柱体支架的直径6.0mm；
51.(5)将高温固化处理后的圆柱体网状支架放入孔板中，将制备的碎纤维混合液浇筑在圆柱体网状支架的网格中，随后置于
‑
20℃的冰箱中4小时，再置于
‑
80℃的冰箱中18小时，然后放入冷冻干燥机中72小时至完全冷冻干燥，得到碎纤维未交联的组织工程修复支架；组织工程修复支架的交联：将圆柱形网状支架放入马弗炉中，高温处理，温度为180℃，时间为2小时，得到组织工程修复支架。
52.上述为本发明的较佳实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。凡由本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。