一种辣椒及其制品辣度分级的试纸条及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及辣椒及其制品的检测，具体涉及一种辣椒及其制品辣度分级的胶体金试纸条。


背景技术：

2.辣椒为木兰纲、茄科，属一年或多年生草本植物，也是一种重要的蔬菜和调味品，其营养丰富，维生素c含量在蔬菜中位居首位。辣椒中体现辣味的物质统称为辣椒素，其含量的高低已成为评价辣椒品种及品质的重要指标，常用分级单位是shu(斯科维尔指数，scovill heat units)。目前，辣椒及其制品中有关辣度检测的方法主要是高效液相色谱法及紫外分光光度法，其中国家标准gb/t 21266
‑
2007规定了用高效液相色谱仪(紫外检测器)检测辣椒素和二氢辣椒素，根据其含量确定辣度，同时还定义了shu与辣椒素浓度之间的换算关系。
3.目前，根据shu大小，国际上将辣椒辣度粗分为四等，微辣(＜500)、中辣(500～1500)、辣(1500～3000)、猛辣(＞3000)。但现在市场上的大多数辣椒及其制品并没有标明辣度分级，少数产品上标有的微辣、中辣和重辣等字样，消费者亦没有直接的感受，且不同厂家生产出的辣味食品存在一定的差异，使得消费者无法对产品的辣度做出准确的判断，很难购买到适合自己口味的辣椒制品。而且现有的辣度检测方法样本前处理繁琐、耗时，需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员，无法进行现场大规模检测，时效性差，难以推广。因此，开发一种操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低并且能够实现对大批量样品进行快速检测的产品和方法成为迫切需要解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有的辣度分级方法存在的对设备依赖性高，并且不能够实现对大批量样品的快速检测的特点，提供一种操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低的试纸条及其制备方法和应用，以实现对大批量的辣椒及其制品进行现场快速分级。
5.为了实现本发明的目的，本发明提供了一种辣椒及其制品辣度分级的试纸条，该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；所述反应膜上具有包被有辣椒素半抗原
‑
载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线；所述结合物释放垫上喷涂有辣椒素单克隆抗体
‑
胶体金标记物。
6.所述辣椒素单克隆抗体是以辣椒素半抗原
‑
载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。
7.所述辣椒素半抗原
‑
载体蛋白偶联物由辣椒素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，所述辣椒素半抗原是将辣椒素与多聚甲醛进行反应得到的，其分子结构式为：
[0008][0009]
所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。
[0010]
所述底板可为pvc底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
[0011]
本发明还提供了一种制备上述试纸条的方法，其包括以下步骤：
[0012]
1)制备喷涂有辣椒素单克隆抗体
‑
胶体金标记物的结合物释放垫；
[0013]
2)制备具有包被有辣椒素半抗原
‑
载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
[0014]
3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
[0015]
具体地说，步骤包括：
[0016]
1)将辣椒素与多聚甲醛进行反应，制备辣椒素半抗原；
[0017]
2)将辣椒素半抗原与载体蛋白偶联，制备辣椒素半抗原
‑
载体蛋白偶联物；
[0018]
3)用辣椒素半抗原
‑
载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌辣椒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0019]
4)提取小鼠igg免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
[0020]
5)分别将辣椒素半抗原
‑
载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(t)和质控线(c)上；
[0021]
6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
[0022]
7)将制备的辣椒素单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到辣椒素单克隆抗体
‑
胶体金标记物；
[0023]
8)将辣椒素单克隆抗体
‑
胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘干2h后取出，置于干燥环境中保存备用；
[0024]
9)将样品吸收垫用含1％牛血清白蛋白、ph为7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用；
[0025]
10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖。最后切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，4～30℃条件下保存12个月。结合物释放垫的1/3被样品吸收垫覆盖可以延长检测结果观察时间，使样品吸收垫将检测液体充分吸收并与金标抗体充分反应，从而减少误差。
[0026]
本发明还提供了一种应用上述试纸条对辣椒及其制品进行辣度分级的方法，它包括以下步骤：
[0027]
(1)样品前处理；
[0028]
(2)用试纸条进行检测；
[0029]
(3)分析检测结果。
[0030]
本发明的辣椒及其制品辣度分级试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将辣椒素单克隆抗体
‑
胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的辣椒素在流动过程中与结合物释放垫上的辣椒素单克隆抗体
‑
胶体金标记物结合，形成辣椒素
‑
抗体
‑
胶体金标记物。样本中的辣椒素与反应膜检测线上的辣椒素半抗原
‑
载体蛋白偶联物竞争结合辣椒素单克隆抗体
‑
胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来定性判断待测样品液中辣椒素含量，或通过胶体金读数仪定量读取待测样品液中辣椒素含量，并根据仪器内置公式换算成辣度给出辣椒及其制品辣度分级的判断。
[0031]
检测时，样品经处理后滴入样品吸收垫，当辣椒素在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体
‑
胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的辣椒素半抗原
‑
载体蛋白偶联物结合，在检测线(t)和质控线(c)上各出现一条红色条带，且t线显色比c线显色深或与c线显色一致；如果辣椒素在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体
‑
胶体金标记物会与辣椒素全部结合，从而在t线处因为竞争反应不会与辣椒素半抗原
‑
载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带或比c线显色浅。如图2所示。
[0032]
阴性：当质控线(c)显示出红色条带，检测线(t)同时也显示出红色条带，且(t)线颜色接近或深于(c)线时，判为阴性。
[0033]
阳性：当质控线(c)显示出红色条带，而检测线(t)不显色或(t)线颜色浅于(c)线时，判为阳性。
[0034]
无效：当质控线(c)不显示出红色条带，则无论检测线(t)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。
[0035]
本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、不受检测设备限制、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸条对辣椒及其制品进行辣度分级的方法，简便、快速、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。
附图说明
[0036]
图1为试纸条剖面结构示意图，图中：1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6、质控线；7、底板；
[0037]
图2为试纸条目测结果判定图；
[0038]
图3为试纸条定量检测标准曲线图；
[0039]
图4为辣椒素半抗原合成图。
具体实施方式
[0040]
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入发明的保护范围。
[0041]
实施例1 辣椒及其制品辣度分级试纸条的制备
[0042]
该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
[0043]
1)制备喷涂有辣椒素单克隆抗体
‑
胶体金标记物的结合物释放垫；
[0044]
2)制备具有包被有辣椒素半抗原
‑
载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗
体的质控线的反应膜；
[0045]
3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
[0046]
下面分步详细叙述：
[0047]
1、辣椒素半抗原的合成(合成路线见附图4)
[0048]
取辣椒素3.05g，加干多聚甲醛1.8g，与mgo纳米晶0.4g充分混匀，将得到的混合物暴露在650w的微波辐照下；用薄层色谱(tlc)对反应进行监测，反应结束后，在反应混合液中加入3mol/l的硫酸50ml，50℃下加热15min，冷却至室温，加水60ml，用二氯甲烷(2
×
50ml)萃取产物。有机相用无水硫酸钠20g干燥，蒸干，得到粗品，上硅胶柱，用石油醚和乙酸乙酯体积比为1∶5的混合溶液洗脱分离纯化，得到醛基辣椒素1.7g，即为辣椒素半抗原。
[0049]
2、免疫原的制备
[0050]
取牛血清白蛋白(bsa)50mg，加0.1mol/l cb9.5 6ml溶解，得到a液；取辣椒素半抗原12.4mg，加1ml甲醇溶解，逐滴滴加到a液中，4℃反应过夜，加硼氢化钠2mg，搅拌1h，用0.02mol/l pbs缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，得到辣椒素
‑
bsa偶联物，即为免疫原。
[0051]
3、包被原的制备
[0052]
取卵清蛋白(ova)50mg，加0.1mol/l cb9.5 6ml溶解，得到a液；取辣椒素半抗原8.45mg，加1ml甲醇溶解，逐滴滴加到a液中，4℃反应过夜，加硼氢化钠2mg，搅拌1h，用0.02mol/l pbs缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，得到辣椒素
‑
ova偶联物，即为包被原。
[0053]
4、辣椒素单克隆抗体的制备
[0054]
(1)动物免疫
[0055]
将步骤2得到的免疫原注入balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。
[0056]
(2)细胞融合和克隆化
[0057]
取免疫balb/c小鼠脾细胞，按8∶1(数量配比)比例与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0058]
(3)细胞冻存和复苏
[0059]
将杂交瘤细胞用冻存液制成1
×
106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0060]
(4)单克隆抗体的制备与纯化
[0061]
增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸
‑
饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，
‑
20℃保存。
[0062]
所述细胞培养基为向rpmi1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量分数)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量分数)；所述细胞培养基的ph为7.4。
[0063]
(5)单克隆抗体效价的测定
[0064]
用间接竞争elisa法测定抗体的效价为1∶(64000～120000)。
[0065]
间接竞争elisa方法：用步骤3制备的包被原包被酶标板，加入辣椒素标准品溶液和单克隆抗体工作液，4℃反应30min，倒出孔内液体，用pbst洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸
拍干；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体，25℃反应30min，取出重复洗板步骤；加入底物显色液，25℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。
[0066]
5、羊抗鼠抗抗体的制备
[0067]
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
[0068]
6、辣椒素单克隆抗体
‑
胶体金标记物的制备
[0069]
(1)胶体金的制备
[0070]
用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入1.5ml 1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，在日光下观察颜色为酒红色。
[0071]
(2)辣椒素单克隆抗体
‑
胶体金标记物的制备
[0072]
在磁力搅拌下，用0.2mol/l碳酸钾溶液调节胶体金的ph值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入5～50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述辣椒素单克隆抗体，继续搅拌混匀30min；静置10min后加入10％bsa，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％，静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。
[0073]
复溶缓冲液：含bsa的质量分数为0.1％～0.5％、蔗糖的质量分数2％～4％、ph 7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液。
[0074]
7、结合物释放垫的制备
[0075]
将结合物释放垫浸泡于含0.5％bsa、5％蔗糖、ph 7.4的0.02mol/l磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿2h，37℃烘干备用。用bio dot划膜仪将制备好的辣椒素单克隆抗体
‑
胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01ml辣椒素单克隆抗体
‑
胶体金标记物后，置于37℃环境(湿度＜20％)中2h后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。
[0076]
8、样品吸收垫的制备
[0077]
将样品吸收垫用含1％bsa、ph为7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用。
[0078]
9、反应膜的制备
[0079]
将辣椒素半抗原
‑
ova偶联物包被在反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。
[0080]
包被过程：用0.01mol/l、ph 7.2的磷酸缓冲液将辣椒素半抗原
‑
ova偶联物稀释到1mg/ml，用bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(t线)，包被量为1.0μl/cm；用0.01mol/l、ph 7.2的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(c线)，包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥16h，备用。
[0081]
10、试纸条的组装
[0082]
根据附图1所示试纸条剖面结构，将样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜
(3)、吸水垫(4)依次按顺序粘贴在pvc底板(7)上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与pvc底板的始端对齐，吸水垫的末端与pvc底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线(5)和质控线(6)，检测线(t线)和质控线(c线)均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，4～30℃的环境中贮存，有效期12个月。
[0083]
实施例2 样品中辣椒素的检测及辣度分级
[0084]
1、样品前处理
[0085]
称取1g匀浆好的样本，加入2ml甲醇，4000r/min离心10min，取上清100μl加入到900μl 0.02mol/l pbs缓冲液中，混匀，待测。
[0086]
2、用试纸条检测
[0087]
用微量移液器吸取待测样本液50～100μl垂直滴于加样孔中；液体流动开始计时，反应10min，判定结果。
[0088]
3、分析检测结果
[0089]
(1)定性判定
[0090]
阴性(一)：t线显色比c线显色深或与c线显色一致，表示样品中辣椒素类物质浓度低于检测限，如图2a、2b。
[0091]
阳性( )：t线显色比c线显色浅或t线不显色，表示样品中辣椒素类物质浓度等于或高于检测限，如图2c、2d。
[0092]
无效：未出现c线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效，如图2e、2f。
[0093]
(2)定量检测
[0094]
①
取辣椒素类物质浓度分别为0、0.2、0.6、1.8、5.4、16.2mg/l的标准品溶液各50～100μl垂直滴于加样孔中，液体流动开始计时，反应10min，即刻用胶体金分析仪检测得到各试纸条上检测线(t)和质控线(c)处的显色强度值，由此获得各试纸条检测线显色强度与质控线显色强度的比值(t/c)。
[0095]
②
以辣椒素类物质浓度为横坐标，各浓度相应的t/c值为纵坐标，用log
‑
logit直线回归拟合得到t/c值与辣椒素类物质浓度的关系曲线，如图3。该方法的有效检测范围为0.2～16.2mg/l。
[0096]
③
取待测样本液50～100μl垂直滴于加样孔中，液体流动开始计时，反应10min，即刻用胶体金分析仪检测其t/c值，并根据仪器内置的t/c值与辣椒素类物质浓度的关系曲线得到样本中的辣椒素类物质含量(若检测结果超出曲线范围，可对待测样本液进行适当稀释后再次检测)；还可根据公式：辣度(
°
)＝10.369
×
ln(辣椒素类物质含量g/kg) 65.264，计算得到辣椒及其制品的辣度，并按照表1给出分级判定。
[0097]
表1辣度分级
[0098]
辣度等级辣度范围(
°
)微辣9～29低辣30～39中辣40～49
高辣50～59特辣60～69暴辣≥70
[0099]
实施例3 样品检测实例
[0100]
1、特异性实验
[0101]
按照实施例2中步骤3(2)定量检测方法，分别测定辣椒素、二氢辣椒素、降二氢辣椒素系列浓度标准品溶液的t/c值，绘制标准曲线。以各曲线0标准品t/c值50％处的质量浓度(ic
50
)按下式计算交叉反应率，结果见表2。
[0102][0103]
式中：
[0104]
s
i
——交叉反应率，％；
[0105]
y——辣椒素标曲线的ic
50
值；
[0106]
z——其他辣椒素类物质标准曲线的ic
50
值。
[0107]
表2交叉反应测定结果
[0108]
标准品ic
50
/(mg/l)交叉反应率/％辣椒素0.416100二氢辣椒素0.75954.8降二氢辣椒素1.20034.7
[0109]
由表2可知，本发明的试纸条对二氢辣椒素、降二氢辣椒素均存在一定的交叉反应，可用于测定辣椒及其制品中的辣椒素类物质总量。
[0110]
2、仪器比对实验
[0111]
随机抽取8份不同品种的辣椒，分别用本发明的试纸条和gb/t 21266
‑
2007中的高效液相色谱法进行测定，结果见表3。
[0112]
表3仪器比对测定结果
[0113][0114][0115]
由表3可知，本发明的试纸条对辣椒及其制品中辣椒素类物质的测定结果与高效液相色谱法测定结果无显著性差异(p＜0.05)，可用于大批量辣椒及其制品中辣椒素类物质的现场快速检测及辣度分级。