一种基于crispr系统的分子侧向层析检测方法及检测试纸条
技术领域
1.本发明涉及分子检测技术领域，具体领域为一种基于crispr系统的分子侧向层析检测方法及检测试纸条。
背景技术：
2.crispr分子检测是2017年由博德研究所张锋团队首先开发出来的新型分子检测技术，主要原理是利用cas蛋白接触并结合靶向片段后，本身的无差别反式切割功能被激活，会切割附近一切核酸序列的特点，通过检测探针序列被切割情况从而判断靶向片段是否存在的一种检测方法(gootenberg,jonathan,s,et al.nucleic acid detection with crispr
‑
cas13a/c2c2.[j].science,2017.)。
[0003]
2019年，张锋团队将crispr方法和侧向层析试纸结合起来推出了sherlock技术(kellner m j,koob j g,gootenberg j s,et al.sherlock:nucleic acid detection with crispr nucleases[j].nature protocols,2019,14(10))。该方法在系统中引入了一段在两端分别标记生物素(biotin)和荧光素(fam)的探针序列。采用的侧向层析试纸条可以检测同时含有biotin和fam的序列：在近端的条带处包被有可结合biotin的亲和素(sa)，在胶体金上标记有抗fam抗体，另外远端还有一条条带，包被有可与抗fam抗体结合的二抗。这是一种夹心法的试纸条，当样品中存在同时含有biotin和fam的序列时，会在近端的条带处形成sa
‑
biotin
‑
探针
‑
fam
‑
抗fam抗体
‑
胶体金复合物，从而显色。
[0004]
张锋团队将该夹心法试纸条用竞争法方式使用。样本为阴性时，crispr系统未激活，探针完整，同时标记有生物素(biotin)和荧光素(fam)的探针序列不会被切割，所以，胶体金全部被试纸条近端的sa条带处通过夹心法被完全捕获，不会到达试纸条远端的线。
[0005]
当样本为阳性时，两端分别标记有生物素(biotin)和荧光素(fam)的探针序列被切断，近端条带处不能形成sa
‑
biotin
‑
探针
‑
fam
‑
抗fam抗体
‑
胶体金复合物，胶体金越过近端条带到达远端条带显色，呈现为阳性结果。
[0006]
在张锋团队开发的方法中，这种夹心法试纸条采用竞争法方式判读：当远端条带显色时候为阳性，远端条带不显色时候为阴性，这个远端条带是常规夹心法试纸条中的质控线。
[0007]
2019年之后所有将crispr系统和试纸条结合的检测方法(比如stopcovid、stopcovid2、holmesv2)都采用同样的试纸条和判读方式。
[0008]
在中国发明专利申请cn112708660a中，采用了将同样的探针固定到各种材质的微球载体上，在cas蛋白反应的液相体系中加入微球，等反应结束之后分离微球，然后仍旧采用这种试纸条进行判读。
[0009]
这种方式存在严重的弊端，夹心法试纸条很难保证所有胶体金都被近端条带捕获，这一点可以从常规夹心法试纸条强阳性时，仍然会有远端的质控线条带看出。从sherlockv2、stopcovid、stopcovid2、holmesv2等技术的原始文献图片中也能看到，文献中显示阴性试纸条远端条带处都存在较弱显色。对此，本技术发明人团队也曾采用文献中同
一来源的试纸条尝试过，阴性时候远端条带确实存在，也就是，存在较弱的假阳性。更严重的，如果体系中未加入探针，则直接出现远端线，也就是出现强烈假阳。针对较弱假阳，本技术发明人团队设计的一个可行的改进方法是改变判读方式，即规定远端条带比近端条带显色弱为阴性，但这样会极大的降低体系灵敏度，而且比色法判读提高了对使用者的要求。
[0010]
另外，现有的这种竞争法的方式，难以开发多指标联合检测。
技术实现要素：
[0011]
为了解决现有技术中的上述两种弊端，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、无假阳性的基于crispr系统的分子侧向层析检测方法及检测试纸条，并可以实现基于cripsr系统的多指标联合可视化检测。
[0012]
为实现上述目的，本发明具体提供如下技术方案：
[0013]
一种基于crispr系统的分子侧向层析检测方法，所述方法包括：
[0014]
标记探针的切割，所述标记探针含有连接在一起的核酸探针和标记物，当所述核酸探针接触到激活后的cas蛋白，则所述核酸探针被切割；
[0015]
标记物的释放：所述标记探针固定设置于侧向层析试纸，当所述核酸探针被切割，所述标记物从固定处释放；
[0016]
标记物的检测：所述侧向层析试纸采用夹心法或捕获法方式检测被释放的标记物，从而实现待检测分子的检测。
[0017]
进一步的，所述核酸探针可被激活后的cas蛋白或工程化的微小cas蛋白切割。
[0018]
进一步的，所述核酸探针为双链dna序列、单链dna序列、单链rna序列和双链rna序列中的任意一种或多种。
[0019]
进一步的，所述标记探针固定设置于所述侧向层析试纸上；优选的，所述标记探针固定设置于固相载体上；更优选的，所述标记探针固定设置于磁微粒上。
[0020]
进一步的，所述标记物包含有不少于两个抗原决定簇。
[0021]
进一步的，所述cas蛋白设置于所述侧向层析试纸上，所述侧向层析试纸设置有不少于两个，每个所述侧向层析试纸上的cas蛋白包含有不同的引导序列。
[0022]
当采用捕获法时，所述标记物为有色染料或有色微球标记的分子，该分子可被侧向层析试纸捕获。
[0023]
一种基于crispr系统的分子侧向层析检测试纸条，包括侧向层析试纸，所述侧向层析试纸设置有cas蛋白，所述cas蛋白设置有可靶向待检测分子的引导序列，所述试纸条还包括固定的标记探针，所述标记探针包含相连的核酸探针和标记物。
[0024]
进一步的，所述标记物由有色或无色微球或胶体金组成，所述微球上包含不少于一个抗原决定簇。
[0025]
进一步的，所述微球上包含抗体或抗原，可通过捕获法进行检测。
[0026]
进一步的，所述侧向层析试纸依次设置有样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫；
[0027]
所述cas蛋白设置于所述样品垫上；
[0028]
所述标记探针固定设置于所述样品垫上；
[0029]
所述结合垫上设置有第一抗标记物抗体
‑
标记载体复合物；
[0030]
所述nc膜上设置有检测线，所述检测线包被有标记物捕获物。
[0031]
进一步的，所述样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫依次粘贴于所述背板上。
[0032]
进一步的，所述结合垫、nc膜和吸水垫依次粘贴于所述背板上，所述样品垫单独设置。
[0033]
进一步的，所述核酸探针的一端与所述样品垫固定结合，所述核酸探针的另一端偶联所述标记物。
[0034]
进一步的，所述核酸探针设置有亲和素标记，所述样品垫化学偶联有链霉亲和素，所述标记探针通过生物素
‑
亲和素系统固定于所述样品垫上。
[0035]
进一步的，所述标记探针一端有生物素标记，含有一段可被cas蛋白切割的区域，另一端含有另一个小分子标记，并被该小分子的抗体结合，该小分子的抗体含有两种或以上不同的小分子标记；所述样品垫上化学偶联有链霉亲和素，所述标记探针通过生物素
‑
亲和素系统固定于所述样品垫上。
[0036]
或者，所述标记探针一端有生物素标记，含有一段可被cas蛋白切割的序列，另一端偶联分子含有至少两个抗原决定簇；所述样品垫上化学偶联有链霉亲和素，所述标记探针通过生物素
‑
亲和素系统固定于所述样品垫上。
[0037]
进一步，所述标记探针通过化学偶联方式固定于所述样品垫上。
[0038]
进一步的，所述标记探针与磁微粒偶联得到磁微粒
‑
核酸探针
‑
标记物复合物，所述磁微粒
‑
标记探针设置于所述样品垫上。
[0039]
更进一步的，所述样品垫的背部设置有磁铁。
[0040]
进一步的，所述磁微粒为链霉亲和素磁微粒，所述标记探针设置有生物素标记，所述磁微粒与所述标记探针通过生物素
‑
亲和素系统连接。
[0041]
进一步的，所述标记探针通过第一标记探针和第二标记探针混合得到，所述第一标记探针一端有生物素标记，另一端有另一小分子标记，标记物区域通过互补和含有另一个小分子标记的序列互补结合。
[0042]
进一步的，所述标记物为含有不少于两个抗原决定簇的大分子，所述第一抗标记物抗体和第二抗标记物抗体为抗所述标记物不同抗原决定簇的抗体。
[0043]
进一步的，所述标记物为两种不同小分子物质，所述第一抗标记物抗体和第二抗标记物抗体分别为抗两种小分子物质的抗体。
[0044]
进一步的，所述标记物为有色染料标记的分子，所述标记物捕获物为针对该分子的抗体。
[0045]
进一步的，所述标记物上含有色微球，微球上含有抗体，所述标记物捕获物可被该抗体捕获；有色微球包括但不限于胶体金、胶体碳、红色乳胶微球。
[0046]
进一步的，所述检测试纸条包含有不少于两个侧向层析试纸，每个所述侧向层析试纸上的cas蛋白包含有不同的引导序列。
[0047]
进一步的，所述cas蛋白包括第一cas蛋白和第二cas蛋白，所述第一cas蛋白为包含可靶向新型冠状病毒orf1ab基因引导序列的cas12蛋白，所述第二cas蛋白为包含有可靶向人黏膜蛋白muc5a引导序列的cas12蛋白。
[0048]
进一步的，所述侧向层析试纸设置有不少于两种cas蛋白，所述侧向层析试纸上设置有不少于两种标记探针，所述cas蛋白的种类与所述标记探针的种类数量相同，所述不同的标记探针上设置有不同的核酸探针，所述不同的标记探针上设置有不同的标记物。
[0049]
进一步的，所述侧向层析试纸设置有不少于两类cas蛋白，所述侧向层析试纸上设置有不少于两类标记探针，所述不同的标记探针上设置有不同的核酸探针，所述不同的标记探针上设置有不同的标记物。
[0050]
进一步的，所述标记载体括胶体金、乳胶微球、胶体碳、磁微球或荧光微球中的一种或多种。
[0051]
在捕获法方案中，所述侧向层析试纸依次设置有样品垫、nc膜和吸水垫；
[0052]
所述cas蛋白设置于所述样品垫上；
[0053]
所述标记探针固定设置于所述样品垫上；
[0054]
所述nc膜上设置有检测线，所述检测线包被有可捕获标记物的分子。
[0055]
本发明的检测原理：通过在侧向层析试纸上设置固定的标记探针和cas蛋白，来实现基于crispr系统的分子侧向层析可视化检测，标记探针含有连接在一起的核酸探针和标记物，cas蛋白包含可靶向待检测分子的引导序列，当检测样本中含有待检测分子，cas蛋白中的引导序列识别到待检测分子，cas蛋白被激活，然后切割标记探针中的核酸探针，从而使原本固定在侧向层析试纸的标记探针中的标记物被释放，侧向层析试纸上还设置有可以夹心法或捕获法检测标记物的系统，从而实现标记物的检测，进而实现待检测分子的侧向层析可视化检测。
[0056]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0057]
(1)特异性高：本发明通过在侧向层析试纸上设置固定的标记探针，实现只有检测样本中存在待检测物质，标记探针才被切割，标记物质才被释放并检测，极大的提高了检测的特异性，避免了现有技术中近端条带捕获不完全或未加入探针而导致假阳性的问题。
[0058]
(2)操作方便：本发明通过在试纸条的样品垫上设置标记探针和cas蛋白，可以去掉现有技术中扩增结束后添加cas蛋白和探针，以及吹打混合均匀这一步骤。试纸条的样品垫为多孔结构，本身就呈现为分布式均匀反应。
[0059]
(3)加快cas蛋白识别目标分子的速度：主要基于两方面的原因，一方面由于cas蛋白和探针都是固相状态，不会像加入液体体系之后导致样本中目标分子的浓度变低；另一方面，通过调整样品垫配方降低cas蛋白的释放速度，可以让cas蛋白接触到更多的样本或样本扩增产物，相当于提高目标分子的表观浓度，更快达到cas蛋白识别目标分子的数量或浓度要求。
[0060]
(4)本发明可进行单管多联检，通过设置多个侧向层析试纸，且每个侧向层析试纸上的cas蛋白包含有不同的引导序列，同一管内的反应产物可以通过多个侧向层析试纸条实现多个指标的同时检测。
[0061]
(5)本发明可以实现单试纸条单管多联检。通过在试纸上设置反式切割不同类别探针序列和对应的不同种类且含不同引导序列cas蛋白实现单条单管多联检。例如将反式切割的单链rna的cas13和反式切割dna序列的cas12，以及分别对应的不同探针。
具体实施方式
[0062]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范
围。
[0063]
实施例1标记探针侧向层析试纸条
[0064]
侧向层析试纸在底板上依次设置有样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫；所述样品垫处设置有cas12蛋白和固定的标记探针。所述cas12蛋白包含可靶向新型冠状病毒orf1ab基因的引导序列，所述标记探针为含有fam和地高辛两种小分子标记物的核酸序列，为方便探针固定，在探针标记的固定端标记生物素；所述结合垫上设置有抗fam抗体
‑
红色乳胶微球复合物；所述nc膜上设置有检测线、质控线，所述检测线包被有抗地高辛抗体，所述质控线包被羊抗鼠抗体。
[0065]
本实施例标记探针侧向层析试纸条的制备方法：
[0066]
(1)设计两个序列：t(生物素标记)tttttttttccttccttctctc(fam)、g(地高辛标记)agagaaggaagg，委托商业化引物合成公司进行合成，将两者等摩尔比例混合反应10min之后备用。
[0067]
(2)样品垫制备：通过化学方法将链霉亲和素偶联固定到样品垫，之后将合成的标记探针喷涂到样品垫上，反应30分钟之后用含0.5％bsa和5％蔗糖的pbs溶液清洗样品垫三次，将未结合的标记探针清洗掉，之后在样品垫处理液中加入含靶向靶向新型冠状病毒orf1ab基因的引导序列的cas12蛋白，样品垫用处理液处理后于40摄氏度烘干2小时。
[0068]
(3)结合垫制备：将抗fam抗体用红色乳胶微球进行标记后喷涂结合垫：红色乳胶微球采用edc\nhs活化后，加入抗fam鼠单抗，37℃烘箱中反应1小时，加入bsa和甘氨酸混合物对乳胶微球进行封闭，离心复溶后喷涂于结合垫上，40℃烘干2h；
[0069]
(4)nc膜包被：采用1xpbs 0.5％蔗糖作为溶剂，分别配制0.5mg/ml的抗地高辛抗体和0.5mg/ml的羊抗鼠抗体作为检测线包被工作液、质控线包被工作液，将nc膜贴到pvc底板上，然后采用喷金划膜仪器将上述配制的包被工作液划在nc膜上，35℃烘干12小时，得到包被nc膜；
[0070]
(5)组装切条：将裁好的吸水纸、结合垫、样品垫依次重叠，黏贴于包被nc膜上，得到大板；采用切条机，将得到的大板切成3mm的宽度，得到侧向层析试纸条。
[0071]
本实施例侧向层析试纸条的使用方法：待测样本通过免提取方式进行裂解，然后通过pcr或者lamp、rpa等方式进行扩增之后，插入本试纸条，反应5分钟之后判断结果。通过检测线和质控线的显色情况，来判断样本中是否含有新型冠状病毒orf1ab基因。
[0072]
实施例2标记探针侧向层析试纸条
[0073]
侧向层析试纸在底板上依次设置有样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫；所述样品垫处设置有cas12蛋白和固定的标记探针。所述cas12蛋白设置有可靶向人黏膜蛋白muc5a的引导序列，所述标记探针为标记dnp和tamra两种小分子标记物的核酸序列，为方便探针固定，在探针的一端标记了生物素；所述结合垫上设置有抗dnp抗体
‑
红色乳胶微球复合物,igy抗体
‑
红色乳胶微球复合物；所述nc膜上设置有检测线、质控线，所述检测线包被有抗trmra抗体，所述质控线包被有兔抗鸡igy抗体。
[0074]
本实施例标记探针侧向层析试纸条的制备方法：
[0075]
(1)合成标记探针，将标记探针序列t(生物素标记)tttttttttcccccccccccc(fam标记)送引物合成供应商合成。将fam抗体用dnp和tamra做标记之后与标记探针混合备用。
[0076]
(2)样品垫制备：通过化学方法将链霉亲和素偶联固定到样品垫，之后将合成的标
记探针喷涂到样品垫上，反应30分钟之后用含0.5％bsa和5％蔗糖的pbs溶液清洗样品垫三次，将未结合的标记探针清洗掉，之后在样品垫处理液中加入含靶向靶向人黏膜蛋白muc5a基因引导序列的cas12蛋白，用样品垫处理液处理后于40摄氏度烘干2小时。
[0077]
(3)结合垫制备：将抗dnp抗体和鸡igy用红色乳胶微球进行混合标记后喷涂结合垫：红色乳胶微球采用edc\nhs活化后，分别加入抗dnp抗体、鸡igy，37℃烘箱中反应1小时，加入bsa和甘氨酸混合物对乳胶微球进行封闭，离心复溶后喷涂于结合垫上。40℃烘干2小时。
[0078]
(4)nc膜包被：采用1xpbs 0.5％蔗糖作为溶剂，分别配制0.5mg/ml的抗tamra抗体和0.5mg/ml的兔抗鸡igy抗体作为检测线包被工作液、质控线包被工作液，将nc膜贴到pvc底板上，然后采用喷金划膜仪器将上述配制的包被工作液划在nc膜上，35℃烘干12小时，得到包被nc膜。
[0079]
(5)组装切条：将裁好的吸水纸、结合垫、样品垫依次重叠，黏贴于包被nc膜上，得到大板；采用切条机，将得到的大板切成3mm的宽度，得到侧向层析试纸条。
[0080]
本实施例侧向层析试纸条的使用方法：待测样本通过免提取方式进行裂解，然后通过pcr或者lamp、rpa等方式进行扩增之后，插入本试纸条，反应5分钟之后判断结果。通过检测线和质控线的显色情况，来判断样本中是否含有人黏膜蛋白muc5a序列。
[0081]
本实施例对fam抗体进行小分子标记，也可以采用两株针对该fam抗体的单抗对fam抗体进行夹心法检测。
[0082]
实施例3标记探针侧向层析试纸条
[0083]
侧向层析试纸在底板上依次设置有样品垫、nc膜和吸水垫；所述样品垫处设置有cas12蛋白和固定的标记探针。所述cas12蛋白设置有可靶向人黏膜蛋白muc5a的引导序列，所述标记探针为胶体金标记的抗trmra抗体，为方便探针固定，在探针的一端标记了生物素；所述nc膜上设置有检测线、质控线，所述检测线包被有trmra
‑
bsa全抗原，所述质控线包被有兔抗鸡igy抗体。
[0084]
本实施例标记探针侧向层析试纸条的制备方法：
[0085]
(1)合成标记探针，将标记探针序列t(生物素标记)tttttttttccccccccc(
‑
sh)c(
‑
sh)c(
‑
sh)c(
‑
sh)送引物合成供应商合成。将探针加入到pvp稳定的20nm胶体金溶液中，之后加入抗trmra抗体进行标记，封闭、离心复溶后备用。
[0086]
(2)样品垫制备：通过化学方法将链霉亲和素偶联固定到样品垫，之后将合成的标记探针喷涂到样品垫上，反应30分钟之后用含0.5％bsa和5％蔗糖的pbs溶液清洗样品垫三次，将未结合的标记探针清洗掉，之后在样品垫处理液中加入含靶向靶向人黏膜蛋白muc5a基因引导序列的cas12蛋白，用样品垫处理液处理后于40摄氏度烘干2小时。
[0087]
(3)结合垫制备：将鸡igy用胶体金标记后喷涂结合垫，40℃烘干2小时。
[0088]
(4)nc膜包被：采用1xpbs 0.5％蔗糖作为溶剂，分别配制0.5mg/ml的tamra
‑
bsa全抗原和0.5mg/ml的兔抗鸡igy抗体作为检测线包被工作液、质控线包被工作液，将nc膜贴到pvc底板上，然后采用喷金划膜仪器将上述配制的包被工作液划在nc膜上，35℃烘干12小时，得到包被nc膜。
[0089]
(5)组装切条：将裁好的吸水纸、结合垫、样品垫依次重叠，黏贴于包被nc膜上，得到大板；采用切条机，将得到的大板切成3mm的宽度，得到侧向层析试纸条。
[0090]
本实施例侧向层析试纸条的使用方法：待测样本通过免提取方式进行裂解，然后通过pcr或者lamp、rpa等方式进行扩增之后，插入本试纸条，反应5分钟之后判断结果，如果样本中含有人黏膜蛋白muc5a序列，则标记有抗tamra的抗体被释放，到达检测线处与tamra
‑
bsa全抗原结合而被捕获。通过检测线和质控线的显色情况，来判断样本中是否含有人黏膜蛋白muc5a序列。
[0091]
实施例4磁微粒标记探针侧向层析试纸条
[0092]
侧向层析试纸在底板上依次设置有样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫；所述样品垫处设置有cas12蛋白和标记于磁微粒的标记探针，底板底部背面粘贴有片状磁条。所述cas12蛋白设置有可靶向新型冠状病毒orf1ab基因的引导序列，所述标记探针为含有fam和地高辛两种小分子标记的核酸序列；所述结合垫上设置有抗fam抗体
‑
红色乳胶微球复合物；所述nc膜上设置有检测线、质控线，所述检测线包被有抗地高辛抗体，所述质控线包被有羊抗鼠抗体。通过磁微粒和磁条，达到将标记探针固定于样品垫位置的功能。
[0093]
本实施例标记探针侧向层析试纸条的制备方法：
[0094]
(1)合成标记探针，合成两个序列：t(生物素标记)tttttttttccttccttctctc(fam标记)、g(地高辛标记)agagaaggaagg，将两者等摩尔比例混合反应10min之后备用。
[0095]
(2)样品垫制备：通过商品化方法将链霉亲和素偶联到磁微粒上，复溶后将合成的标记探针与磁珠反应，使探针通过亲和素结合到磁珠上，之后将磁珠清洗三次以去除未结合的标记探针。样品垫用含两种cas蛋白的处理液处理，并将磁珠喷涂于样品垫上。
[0096]
(3)结合垫制备：将fam抗体用红色乳胶微球进行标记后喷涂结合垫：红色乳胶微球采用edc\nhs活化后，加入抗fam鼠单抗，37℃烘箱中反应1小时，加入bsa和甘氨酸混合物对乳胶微球进行封闭，离心复溶后喷涂于结合垫上。40℃烘干2h；
[0097]
(4)nc膜包被：采用1xpbs 0.5％蔗糖作为溶剂，分别配制0.5mg/ml的地高辛抗体和0.5mg/ml的羊抗鼠抗体作为检测线包被工作液、质控线包被工作液，将nc膜贴到pvc底板上，然后采用喷金划膜仪器将上述配制的包被工作液划在nc膜上，35℃烘干12小时，得到包被nc膜；
[0098]
(5)组装切条：将裁好的吸水纸、结合垫、样品垫依次重叠，黏贴于包被nc膜上，在底板背部样品垫位置粘贴片状磁条，得到大板；采用切条机，将得到的大板切成3mm的宽度，得到侧向层析试纸条。
[0099]
本实施例侧向层析试纸条的使用方法：待测样本通过免提取方式进行裂解，然后通过pcr或者lamp、rpa等方式进行扩增之后，插入本试纸条，反应10分钟之后判断结果。通过检测线和质控线的显色情况，来判断样本中是否含有新型冠状病毒orf1ab基因。
[0100]
实施例5基于crispr系统的分子侧向层析多指标联合检测试纸
[0101]
试纸条包括两根侧向层析试纸，具体可以是实施例1和实施例2的两种试纸并排放置。通过实施例1的试纸检测判定样本中是否含有新型冠状病毒orf1ab基因，试纸条2作为内质控，确定人黏膜蛋白muc5a序列，而且对该序列进行了有效扩增。
[0102]
本实施例侧向层析试纸条的使用方法：待测的人鼻腔采集样本通过免提取方式进行裂解，然后通过pcr或者lamp、rpa等方式对新型冠状病毒orf1ab基因和人黏膜蛋白muc5a基因同时进行扩增。之后插入本并联试纸条，反应10分钟之后判断结果。实施例2的试纸条检测线必须为阳性，以此作为内质控，确定该次采样采集到了人黏膜成分，实施例1的试纸
条来判断样本中是否含有新型冠状病毒orf1ab基因。
[0103]
实施例6基于crispr系统的分子侧向层析检测试纸条
[0104]
本实施例采用新型冠状病毒肺炎防控方案(第八版)推荐的引物(seq id no：1
‑
2所示)对新型冠状病毒orf1ab基因进行扩增，添标采用假病毒的方式进行，之后采用本试纸条进行检测。
[0105]
(1)探针制备：通过将200nm的t(生物素标记)tttttttttccttccttctctc(fam标记)和200nm的g(地高辛标记)agagaaggaagg，混合反应10min之后备用。
[0106]
(2)含引导序列cas蛋白的制备：将10um浓度的引导序列gucuagaggacagaauuuuucaacgggugugccaauggccacuuuccagguggc aaagcccguugagcuucucaaaucugagaaguggcaccacuuaaaaacacagucu gu(seq id no：3所示)和10um浓度的aapcas12b蛋白混合后在30℃条件下反应30分钟，备用。aapcas12b蛋白购自吐露港生物科技有限公司。
[0107]
(3)样品垫制备：
[0108]
①
处理样品垫：将玻璃纤维垫清洗后在通风橱中先后用2％的3
‑
巯基丙基)三甲氧基硅烷和2mm的n
‑
γ
‑
马来酰亚胺基丁酰
‑
氧琥珀酰亚胺酯)处理。清洗后浸泡于100ng/ml的链霉亲和素溶液，清洗后置于37摄氏度烘箱烘干2h备用。
[0109]
②
将制备的探针和含引导序列的cas蛋白混合，并添加10
×
neb buffer 3.1，0.5％bsa和2％蔗糖，100mm牛胆酸，15mm mgso4和50u/ul的rna酶抑制剂和样品垫处理液，用此溶液喷涂步骤(1)中清洗的垫子。样品垫用处理液处理后于37摄氏度烘干2小时。
[0110]
(4)结合垫制备：红色乳胶微球采用edc\nhs活化后，加入抗fam鼠单抗，37℃烘箱中反应1小时，加入bsa和甘氨酸混合物对乳胶微球进行封闭，离心复溶后喷涂于结合垫上，40℃烘干2h；
[0111]
(5)nc膜包被：采用1xpbs 0.5％蔗糖作为溶剂，分别配制0.5mg/ml的抗地高辛抗体和0.5mg/ml的羊抗鼠抗体作为检测线包被工作液、质控线包被工作液，将nc膜贴到pvc底板上，然后采用喷金划膜仪器将上述配制的包被工作液划在nc膜上，35℃烘干12小时，得到包被nc膜；
[0112]
(6)组装切条：将裁好的吸水纸、结合垫、样品垫依次重叠，黏贴于包被nc膜上，得到大板；采用切条机，将得到的大板切成3mm的宽度，得到侧向层析试纸条。
[0113]
(7)将阴性鼻拭子样本和加入了新型冠状病毒orf1ab假病毒的样本分别采用raa试纸条进行恒温扩增。新型冠状病毒orf1ab假病毒购自上海复百澳生物，反应体系50ul。
[0114]
(8)试纸条反应：扩增完成之后，将试纸条样品垫端插入反应体系中反应20分钟。扩增产物通过毛细泳动到达样品垫，但并未到达结合垫和nc膜。
[0115]
(9)反应结束后，向管内加入50ul pbs，试纸条显色，通过显色情况判断结果。
[0116]
通过对10份添加不同浓度及未添加新型冠状病毒orf1ab假病毒的鼻拭子进行检测，表面本试纸条可检测出500拷贝/ml。
[0117]
从以上实验结果可以看出，本发明产品的特异性强、灵敏度高，操作简单便捷、检测速度快，且能够实现多指标的联合检测，能够较好的实现基于crispr系统的分子侧向层析可视化检测。
[0118]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换
和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
技术领域
1.本发明涉及分子检测技术领域，具体领域为一种基于crispr系统的分子侧向层析检测方法及检测试纸条。
背景技术：
2.crispr分子检测是2017年由博德研究所张锋团队首先开发出来的新型分子检测技术，主要原理是利用cas蛋白接触并结合靶向片段后，本身的无差别反式切割功能被激活，会切割附近一切核酸序列的特点，通过检测探针序列被切割情况从而判断靶向片段是否存在的一种检测方法(gootenberg,jonathan,s,et al.nucleic acid detection with crispr
‑
cas13a/c2c2.[j].science,2017.)。
[0003]
2019年，张锋团队将crispr方法和侧向层析试纸结合起来推出了sherlock技术(kellner m j,koob j g,gootenberg j s,et al.sherlock:nucleic acid detection with crispr nucleases[j].nature protocols,2019,14(10))。该方法在系统中引入了一段在两端分别标记生物素(biotin)和荧光素(fam)的探针序列。采用的侧向层析试纸条可以检测同时含有biotin和fam的序列：在近端的条带处包被有可结合biotin的亲和素(sa)，在胶体金上标记有抗fam抗体，另外远端还有一条条带，包被有可与抗fam抗体结合的二抗。这是一种夹心法的试纸条，当样品中存在同时含有biotin和fam的序列时，会在近端的条带处形成sa
‑
biotin
‑
探针
‑
fam
‑
抗fam抗体
‑
胶体金复合物，从而显色。
[0004]
张锋团队将该夹心法试纸条用竞争法方式使用。样本为阴性时，crispr系统未激活，探针完整，同时标记有生物素(biotin)和荧光素(fam)的探针序列不会被切割，所以，胶体金全部被试纸条近端的sa条带处通过夹心法被完全捕获，不会到达试纸条远端的线。
[0005]
当样本为阳性时，两端分别标记有生物素(biotin)和荧光素(fam)的探针序列被切断，近端条带处不能形成sa
‑
biotin
‑
探针
‑
fam
‑
抗fam抗体
‑
胶体金复合物，胶体金越过近端条带到达远端条带显色，呈现为阳性结果。
[0006]
在张锋团队开发的方法中，这种夹心法试纸条采用竞争法方式判读：当远端条带显色时候为阳性，远端条带不显色时候为阴性，这个远端条带是常规夹心法试纸条中的质控线。
[0007]
2019年之后所有将crispr系统和试纸条结合的检测方法(比如stopcovid、stopcovid2、holmesv2)都采用同样的试纸条和判读方式。
[0008]
在中国发明专利申请cn112708660a中，采用了将同样的探针固定到各种材质的微球载体上，在cas蛋白反应的液相体系中加入微球，等反应结束之后分离微球，然后仍旧采用这种试纸条进行判读。
[0009]
这种方式存在严重的弊端，夹心法试纸条很难保证所有胶体金都被近端条带捕获，这一点可以从常规夹心法试纸条强阳性时，仍然会有远端的质控线条带看出。从sherlockv2、stopcovid、stopcovid2、holmesv2等技术的原始文献图片中也能看到，文献中显示阴性试纸条远端条带处都存在较弱显色。对此，本技术发明人团队也曾采用文献中同
一来源的试纸条尝试过，阴性时候远端条带确实存在，也就是，存在较弱的假阳性。更严重的，如果体系中未加入探针，则直接出现远端线，也就是出现强烈假阳。针对较弱假阳，本技术发明人团队设计的一个可行的改进方法是改变判读方式，即规定远端条带比近端条带显色弱为阴性，但这样会极大的降低体系灵敏度，而且比色法判读提高了对使用者的要求。
[0010]
另外，现有的这种竞争法的方式，难以开发多指标联合检测。
技术实现要素：
[0011]
为了解决现有技术中的上述两种弊端，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、无假阳性的基于crispr系统的分子侧向层析检测方法及检测试纸条，并可以实现基于cripsr系统的多指标联合可视化检测。
[0012]
为实现上述目的，本发明具体提供如下技术方案：
[0013]
一种基于crispr系统的分子侧向层析检测方法，所述方法包括：
[0014]
标记探针的切割，所述标记探针含有连接在一起的核酸探针和标记物，当所述核酸探针接触到激活后的cas蛋白，则所述核酸探针被切割；
[0015]
标记物的释放：所述标记探针固定设置于侧向层析试纸，当所述核酸探针被切割，所述标记物从固定处释放；
[0016]
标记物的检测：所述侧向层析试纸采用夹心法或捕获法方式检测被释放的标记物，从而实现待检测分子的检测。
[0017]
进一步的，所述核酸探针可被激活后的cas蛋白或工程化的微小cas蛋白切割。
[0018]
进一步的，所述核酸探针为双链dna序列、单链dna序列、单链rna序列和双链rna序列中的任意一种或多种。
[0019]
进一步的，所述标记探针固定设置于所述侧向层析试纸上；优选的，所述标记探针固定设置于固相载体上；更优选的，所述标记探针固定设置于磁微粒上。
[0020]
进一步的，所述标记物包含有不少于两个抗原决定簇。
[0021]
进一步的，所述cas蛋白设置于所述侧向层析试纸上，所述侧向层析试纸设置有不少于两个，每个所述侧向层析试纸上的cas蛋白包含有不同的引导序列。
[0022]
当采用捕获法时，所述标记物为有色染料或有色微球标记的分子，该分子可被侧向层析试纸捕获。
[0023]
一种基于crispr系统的分子侧向层析检测试纸条，包括侧向层析试纸，所述侧向层析试纸设置有cas蛋白，所述cas蛋白设置有可靶向待检测分子的引导序列，所述试纸条还包括固定的标记探针，所述标记探针包含相连的核酸探针和标记物。
[0024]
进一步的，所述标记物由有色或无色微球或胶体金组成，所述微球上包含不少于一个抗原决定簇。
[0025]
进一步的，所述微球上包含抗体或抗原，可通过捕获法进行检测。
[0026]
进一步的，所述侧向层析试纸依次设置有样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫；
[0027]
所述cas蛋白设置于所述样品垫上；
[0028]
所述标记探针固定设置于所述样品垫上；
[0029]
所述结合垫上设置有第一抗标记物抗体
‑
标记载体复合物；
[0030]
所述nc膜上设置有检测线，所述检测线包被有标记物捕获物。
[0031]
进一步的，所述样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫依次粘贴于所述背板上。
[0032]
进一步的，所述结合垫、nc膜和吸水垫依次粘贴于所述背板上，所述样品垫单独设置。
[0033]
进一步的，所述核酸探针的一端与所述样品垫固定结合，所述核酸探针的另一端偶联所述标记物。
[0034]
进一步的，所述核酸探针设置有亲和素标记，所述样品垫化学偶联有链霉亲和素，所述标记探针通过生物素
‑
亲和素系统固定于所述样品垫上。
[0035]
进一步的，所述标记探针一端有生物素标记，含有一段可被cas蛋白切割的区域，另一端含有另一个小分子标记，并被该小分子的抗体结合，该小分子的抗体含有两种或以上不同的小分子标记；所述样品垫上化学偶联有链霉亲和素，所述标记探针通过生物素
‑
亲和素系统固定于所述样品垫上。
[0036]
或者，所述标记探针一端有生物素标记，含有一段可被cas蛋白切割的序列，另一端偶联分子含有至少两个抗原决定簇；所述样品垫上化学偶联有链霉亲和素，所述标记探针通过生物素
‑
亲和素系统固定于所述样品垫上。
[0037]
进一步，所述标记探针通过化学偶联方式固定于所述样品垫上。
[0038]
进一步的，所述标记探针与磁微粒偶联得到磁微粒
‑
核酸探针
‑
标记物复合物，所述磁微粒
‑
标记探针设置于所述样品垫上。
[0039]
更进一步的，所述样品垫的背部设置有磁铁。
[0040]
进一步的，所述磁微粒为链霉亲和素磁微粒，所述标记探针设置有生物素标记，所述磁微粒与所述标记探针通过生物素
‑
亲和素系统连接。
[0041]
进一步的，所述标记探针通过第一标记探针和第二标记探针混合得到，所述第一标记探针一端有生物素标记，另一端有另一小分子标记，标记物区域通过互补和含有另一个小分子标记的序列互补结合。
[0042]
进一步的，所述标记物为含有不少于两个抗原决定簇的大分子，所述第一抗标记物抗体和第二抗标记物抗体为抗所述标记物不同抗原决定簇的抗体。
[0043]
进一步的，所述标记物为两种不同小分子物质，所述第一抗标记物抗体和第二抗标记物抗体分别为抗两种小分子物质的抗体。
[0044]
进一步的，所述标记物为有色染料标记的分子，所述标记物捕获物为针对该分子的抗体。
[0045]
进一步的，所述标记物上含有色微球，微球上含有抗体，所述标记物捕获物可被该抗体捕获；有色微球包括但不限于胶体金、胶体碳、红色乳胶微球。
[0046]
进一步的，所述检测试纸条包含有不少于两个侧向层析试纸，每个所述侧向层析试纸上的cas蛋白包含有不同的引导序列。
[0047]
进一步的，所述cas蛋白包括第一cas蛋白和第二cas蛋白，所述第一cas蛋白为包含可靶向新型冠状病毒orf1ab基因引导序列的cas12蛋白，所述第二cas蛋白为包含有可靶向人黏膜蛋白muc5a引导序列的cas12蛋白。
[0048]
进一步的，所述侧向层析试纸设置有不少于两种cas蛋白，所述侧向层析试纸上设置有不少于两种标记探针，所述cas蛋白的种类与所述标记探针的种类数量相同，所述不同的标记探针上设置有不同的核酸探针，所述不同的标记探针上设置有不同的标记物。
[0049]
进一步的，所述侧向层析试纸设置有不少于两类cas蛋白，所述侧向层析试纸上设置有不少于两类标记探针，所述不同的标记探针上设置有不同的核酸探针，所述不同的标记探针上设置有不同的标记物。
[0050]
进一步的，所述标记载体括胶体金、乳胶微球、胶体碳、磁微球或荧光微球中的一种或多种。
[0051]
在捕获法方案中，所述侧向层析试纸依次设置有样品垫、nc膜和吸水垫；
[0052]
所述cas蛋白设置于所述样品垫上；
[0053]
所述标记探针固定设置于所述样品垫上；
[0054]
所述nc膜上设置有检测线，所述检测线包被有可捕获标记物的分子。
[0055]
本发明的检测原理：通过在侧向层析试纸上设置固定的标记探针和cas蛋白，来实现基于crispr系统的分子侧向层析可视化检测，标记探针含有连接在一起的核酸探针和标记物，cas蛋白包含可靶向待检测分子的引导序列，当检测样本中含有待检测分子，cas蛋白中的引导序列识别到待检测分子，cas蛋白被激活，然后切割标记探针中的核酸探针，从而使原本固定在侧向层析试纸的标记探针中的标记物被释放，侧向层析试纸上还设置有可以夹心法或捕获法检测标记物的系统，从而实现标记物的检测，进而实现待检测分子的侧向层析可视化检测。
[0056]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0057]
(1)特异性高：本发明通过在侧向层析试纸上设置固定的标记探针，实现只有检测样本中存在待检测物质，标记探针才被切割，标记物质才被释放并检测，极大的提高了检测的特异性，避免了现有技术中近端条带捕获不完全或未加入探针而导致假阳性的问题。
[0058]
(2)操作方便：本发明通过在试纸条的样品垫上设置标记探针和cas蛋白，可以去掉现有技术中扩增结束后添加cas蛋白和探针，以及吹打混合均匀这一步骤。试纸条的样品垫为多孔结构，本身就呈现为分布式均匀反应。
[0059]
(3)加快cas蛋白识别目标分子的速度：主要基于两方面的原因，一方面由于cas蛋白和探针都是固相状态，不会像加入液体体系之后导致样本中目标分子的浓度变低；另一方面，通过调整样品垫配方降低cas蛋白的释放速度，可以让cas蛋白接触到更多的样本或样本扩增产物，相当于提高目标分子的表观浓度，更快达到cas蛋白识别目标分子的数量或浓度要求。
[0060]
(4)本发明可进行单管多联检，通过设置多个侧向层析试纸，且每个侧向层析试纸上的cas蛋白包含有不同的引导序列，同一管内的反应产物可以通过多个侧向层析试纸条实现多个指标的同时检测。
[0061]
(5)本发明可以实现单试纸条单管多联检。通过在试纸上设置反式切割不同类别探针序列和对应的不同种类且含不同引导序列cas蛋白实现单条单管多联检。例如将反式切割的单链rna的cas13和反式切割dna序列的cas12，以及分别对应的不同探针。
具体实施方式
[0062]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范
围。
[0063]
实施例1标记探针侧向层析试纸条
[0064]
侧向层析试纸在底板上依次设置有样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫；所述样品垫处设置有cas12蛋白和固定的标记探针。所述cas12蛋白包含可靶向新型冠状病毒orf1ab基因的引导序列，所述标记探针为含有fam和地高辛两种小分子标记物的核酸序列，为方便探针固定，在探针标记的固定端标记生物素；所述结合垫上设置有抗fam抗体
‑
红色乳胶微球复合物；所述nc膜上设置有检测线、质控线，所述检测线包被有抗地高辛抗体，所述质控线包被羊抗鼠抗体。
[0065]
本实施例标记探针侧向层析试纸条的制备方法：
[0066]
(1)设计两个序列：t(生物素标记)tttttttttccttccttctctc(fam)、g(地高辛标记)agagaaggaagg，委托商业化引物合成公司进行合成，将两者等摩尔比例混合反应10min之后备用。
[0067]
(2)样品垫制备：通过化学方法将链霉亲和素偶联固定到样品垫，之后将合成的标记探针喷涂到样品垫上，反应30分钟之后用含0.5％bsa和5％蔗糖的pbs溶液清洗样品垫三次，将未结合的标记探针清洗掉，之后在样品垫处理液中加入含靶向靶向新型冠状病毒orf1ab基因的引导序列的cas12蛋白，样品垫用处理液处理后于40摄氏度烘干2小时。
[0068]
(3)结合垫制备：将抗fam抗体用红色乳胶微球进行标记后喷涂结合垫：红色乳胶微球采用edc\nhs活化后，加入抗fam鼠单抗，37℃烘箱中反应1小时，加入bsa和甘氨酸混合物对乳胶微球进行封闭，离心复溶后喷涂于结合垫上，40℃烘干2h；
[0069]
(4)nc膜包被：采用1xpbs 0.5％蔗糖作为溶剂，分别配制0.5mg/ml的抗地高辛抗体和0.5mg/ml的羊抗鼠抗体作为检测线包被工作液、质控线包被工作液，将nc膜贴到pvc底板上，然后采用喷金划膜仪器将上述配制的包被工作液划在nc膜上，35℃烘干12小时，得到包被nc膜；
[0070]
(5)组装切条：将裁好的吸水纸、结合垫、样品垫依次重叠，黏贴于包被nc膜上，得到大板；采用切条机，将得到的大板切成3mm的宽度，得到侧向层析试纸条。
[0071]
本实施例侧向层析试纸条的使用方法：待测样本通过免提取方式进行裂解，然后通过pcr或者lamp、rpa等方式进行扩增之后，插入本试纸条，反应5分钟之后判断结果。通过检测线和质控线的显色情况，来判断样本中是否含有新型冠状病毒orf1ab基因。
[0072]
实施例2标记探针侧向层析试纸条
[0073]
侧向层析试纸在底板上依次设置有样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫；所述样品垫处设置有cas12蛋白和固定的标记探针。所述cas12蛋白设置有可靶向人黏膜蛋白muc5a的引导序列，所述标记探针为标记dnp和tamra两种小分子标记物的核酸序列，为方便探针固定，在探针的一端标记了生物素；所述结合垫上设置有抗dnp抗体
‑
红色乳胶微球复合物,igy抗体
‑
红色乳胶微球复合物；所述nc膜上设置有检测线、质控线，所述检测线包被有抗trmra抗体，所述质控线包被有兔抗鸡igy抗体。
[0074]
本实施例标记探针侧向层析试纸条的制备方法：
[0075]
(1)合成标记探针，将标记探针序列t(生物素标记)tttttttttcccccccccccc(fam标记)送引物合成供应商合成。将fam抗体用dnp和tamra做标记之后与标记探针混合备用。
[0076]
(2)样品垫制备：通过化学方法将链霉亲和素偶联固定到样品垫，之后将合成的标
记探针喷涂到样品垫上，反应30分钟之后用含0.5％bsa和5％蔗糖的pbs溶液清洗样品垫三次，将未结合的标记探针清洗掉，之后在样品垫处理液中加入含靶向靶向人黏膜蛋白muc5a基因引导序列的cas12蛋白，用样品垫处理液处理后于40摄氏度烘干2小时。
[0077]
(3)结合垫制备：将抗dnp抗体和鸡igy用红色乳胶微球进行混合标记后喷涂结合垫：红色乳胶微球采用edc\nhs活化后，分别加入抗dnp抗体、鸡igy，37℃烘箱中反应1小时，加入bsa和甘氨酸混合物对乳胶微球进行封闭，离心复溶后喷涂于结合垫上。40℃烘干2小时。
[0078]
(4)nc膜包被：采用1xpbs 0.5％蔗糖作为溶剂，分别配制0.5mg/ml的抗tamra抗体和0.5mg/ml的兔抗鸡igy抗体作为检测线包被工作液、质控线包被工作液，将nc膜贴到pvc底板上，然后采用喷金划膜仪器将上述配制的包被工作液划在nc膜上，35℃烘干12小时，得到包被nc膜。
[0079]
(5)组装切条：将裁好的吸水纸、结合垫、样品垫依次重叠，黏贴于包被nc膜上，得到大板；采用切条机，将得到的大板切成3mm的宽度，得到侧向层析试纸条。
[0080]
本实施例侧向层析试纸条的使用方法：待测样本通过免提取方式进行裂解，然后通过pcr或者lamp、rpa等方式进行扩增之后，插入本试纸条，反应5分钟之后判断结果。通过检测线和质控线的显色情况，来判断样本中是否含有人黏膜蛋白muc5a序列。
[0081]
本实施例对fam抗体进行小分子标记，也可以采用两株针对该fam抗体的单抗对fam抗体进行夹心法检测。
[0082]
实施例3标记探针侧向层析试纸条
[0083]
侧向层析试纸在底板上依次设置有样品垫、nc膜和吸水垫；所述样品垫处设置有cas12蛋白和固定的标记探针。所述cas12蛋白设置有可靶向人黏膜蛋白muc5a的引导序列，所述标记探针为胶体金标记的抗trmra抗体，为方便探针固定，在探针的一端标记了生物素；所述nc膜上设置有检测线、质控线，所述检测线包被有trmra
‑
bsa全抗原，所述质控线包被有兔抗鸡igy抗体。
[0084]
本实施例标记探针侧向层析试纸条的制备方法：
[0085]
(1)合成标记探针，将标记探针序列t(生物素标记)tttttttttccccccccc(
‑
sh)c(
‑
sh)c(
‑
sh)c(
‑
sh)送引物合成供应商合成。将探针加入到pvp稳定的20nm胶体金溶液中，之后加入抗trmra抗体进行标记，封闭、离心复溶后备用。
[0086]
(2)样品垫制备：通过化学方法将链霉亲和素偶联固定到样品垫，之后将合成的标记探针喷涂到样品垫上，反应30分钟之后用含0.5％bsa和5％蔗糖的pbs溶液清洗样品垫三次，将未结合的标记探针清洗掉，之后在样品垫处理液中加入含靶向靶向人黏膜蛋白muc5a基因引导序列的cas12蛋白，用样品垫处理液处理后于40摄氏度烘干2小时。
[0087]
(3)结合垫制备：将鸡igy用胶体金标记后喷涂结合垫，40℃烘干2小时。
[0088]
(4)nc膜包被：采用1xpbs 0.5％蔗糖作为溶剂，分别配制0.5mg/ml的tamra
‑
bsa全抗原和0.5mg/ml的兔抗鸡igy抗体作为检测线包被工作液、质控线包被工作液，将nc膜贴到pvc底板上，然后采用喷金划膜仪器将上述配制的包被工作液划在nc膜上，35℃烘干12小时，得到包被nc膜。
[0089]
(5)组装切条：将裁好的吸水纸、结合垫、样品垫依次重叠，黏贴于包被nc膜上，得到大板；采用切条机，将得到的大板切成3mm的宽度，得到侧向层析试纸条。
[0090]
本实施例侧向层析试纸条的使用方法：待测样本通过免提取方式进行裂解，然后通过pcr或者lamp、rpa等方式进行扩增之后，插入本试纸条，反应5分钟之后判断结果，如果样本中含有人黏膜蛋白muc5a序列，则标记有抗tamra的抗体被释放，到达检测线处与tamra
‑
bsa全抗原结合而被捕获。通过检测线和质控线的显色情况，来判断样本中是否含有人黏膜蛋白muc5a序列。
[0091]
实施例4磁微粒标记探针侧向层析试纸条
[0092]
侧向层析试纸在底板上依次设置有样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫；所述样品垫处设置有cas12蛋白和标记于磁微粒的标记探针，底板底部背面粘贴有片状磁条。所述cas12蛋白设置有可靶向新型冠状病毒orf1ab基因的引导序列，所述标记探针为含有fam和地高辛两种小分子标记的核酸序列；所述结合垫上设置有抗fam抗体
‑
红色乳胶微球复合物；所述nc膜上设置有检测线、质控线，所述检测线包被有抗地高辛抗体，所述质控线包被有羊抗鼠抗体。通过磁微粒和磁条，达到将标记探针固定于样品垫位置的功能。
[0093]
本实施例标记探针侧向层析试纸条的制备方法：
[0094]
(1)合成标记探针，合成两个序列：t(生物素标记)tttttttttccttccttctctc(fam标记)、g(地高辛标记)agagaaggaagg，将两者等摩尔比例混合反应10min之后备用。
[0095]
(2)样品垫制备：通过商品化方法将链霉亲和素偶联到磁微粒上，复溶后将合成的标记探针与磁珠反应，使探针通过亲和素结合到磁珠上，之后将磁珠清洗三次以去除未结合的标记探针。样品垫用含两种cas蛋白的处理液处理，并将磁珠喷涂于样品垫上。
[0096]
(3)结合垫制备：将fam抗体用红色乳胶微球进行标记后喷涂结合垫：红色乳胶微球采用edc\nhs活化后，加入抗fam鼠单抗，37℃烘箱中反应1小时，加入bsa和甘氨酸混合物对乳胶微球进行封闭，离心复溶后喷涂于结合垫上。40℃烘干2h；
[0097]
(4)nc膜包被：采用1xpbs 0.5％蔗糖作为溶剂，分别配制0.5mg/ml的地高辛抗体和0.5mg/ml的羊抗鼠抗体作为检测线包被工作液、质控线包被工作液，将nc膜贴到pvc底板上，然后采用喷金划膜仪器将上述配制的包被工作液划在nc膜上，35℃烘干12小时，得到包被nc膜；
[0098]
(5)组装切条：将裁好的吸水纸、结合垫、样品垫依次重叠，黏贴于包被nc膜上，在底板背部样品垫位置粘贴片状磁条，得到大板；采用切条机，将得到的大板切成3mm的宽度，得到侧向层析试纸条。
[0099]
本实施例侧向层析试纸条的使用方法：待测样本通过免提取方式进行裂解，然后通过pcr或者lamp、rpa等方式进行扩增之后，插入本试纸条，反应10分钟之后判断结果。通过检测线和质控线的显色情况，来判断样本中是否含有新型冠状病毒orf1ab基因。
[0100]
实施例5基于crispr系统的分子侧向层析多指标联合检测试纸
[0101]
试纸条包括两根侧向层析试纸，具体可以是实施例1和实施例2的两种试纸并排放置。通过实施例1的试纸检测判定样本中是否含有新型冠状病毒orf1ab基因，试纸条2作为内质控，确定人黏膜蛋白muc5a序列，而且对该序列进行了有效扩增。
[0102]
本实施例侧向层析试纸条的使用方法：待测的人鼻腔采集样本通过免提取方式进行裂解，然后通过pcr或者lamp、rpa等方式对新型冠状病毒orf1ab基因和人黏膜蛋白muc5a基因同时进行扩增。之后插入本并联试纸条，反应10分钟之后判断结果。实施例2的试纸条检测线必须为阳性，以此作为内质控，确定该次采样采集到了人黏膜成分，实施例1的试纸
条来判断样本中是否含有新型冠状病毒orf1ab基因。
[0103]
实施例6基于crispr系统的分子侧向层析检测试纸条
[0104]
本实施例采用新型冠状病毒肺炎防控方案(第八版)推荐的引物(seq id no：1
‑
2所示)对新型冠状病毒orf1ab基因进行扩增，添标采用假病毒的方式进行，之后采用本试纸条进行检测。
[0105]
(1)探针制备：通过将200nm的t(生物素标记)tttttttttccttccttctctc(fam标记)和200nm的g(地高辛标记)agagaaggaagg，混合反应10min之后备用。
[0106]
(2)含引导序列cas蛋白的制备：将10um浓度的引导序列gucuagaggacagaauuuuucaacgggugugccaauggccacuuuccagguggc aaagcccguugagcuucucaaaucugagaaguggcaccacuuaaaaacacagucu gu(seq id no：3所示)和10um浓度的aapcas12b蛋白混合后在30℃条件下反应30分钟，备用。aapcas12b蛋白购自吐露港生物科技有限公司。
[0107]
(3)样品垫制备：
[0108]
①
处理样品垫：将玻璃纤维垫清洗后在通风橱中先后用2％的3
‑
巯基丙基)三甲氧基硅烷和2mm的n
‑
γ
‑
马来酰亚胺基丁酰
‑
氧琥珀酰亚胺酯)处理。清洗后浸泡于100ng/ml的链霉亲和素溶液，清洗后置于37摄氏度烘箱烘干2h备用。
[0109]
②
将制备的探针和含引导序列的cas蛋白混合，并添加10
×
neb buffer 3.1，0.5％bsa和2％蔗糖，100mm牛胆酸，15mm mgso4和50u/ul的rna酶抑制剂和样品垫处理液，用此溶液喷涂步骤(1)中清洗的垫子。样品垫用处理液处理后于37摄氏度烘干2小时。
[0110]
(4)结合垫制备：红色乳胶微球采用edc\nhs活化后，加入抗fam鼠单抗，37℃烘箱中反应1小时，加入bsa和甘氨酸混合物对乳胶微球进行封闭，离心复溶后喷涂于结合垫上，40℃烘干2h；
[0111]
(5)nc膜包被：采用1xpbs 0.5％蔗糖作为溶剂，分别配制0.5mg/ml的抗地高辛抗体和0.5mg/ml的羊抗鼠抗体作为检测线包被工作液、质控线包被工作液，将nc膜贴到pvc底板上，然后采用喷金划膜仪器将上述配制的包被工作液划在nc膜上，35℃烘干12小时，得到包被nc膜；
[0112]
(6)组装切条：将裁好的吸水纸、结合垫、样品垫依次重叠，黏贴于包被nc膜上，得到大板；采用切条机，将得到的大板切成3mm的宽度，得到侧向层析试纸条。
[0113]
(7)将阴性鼻拭子样本和加入了新型冠状病毒orf1ab假病毒的样本分别采用raa试纸条进行恒温扩增。新型冠状病毒orf1ab假病毒购自上海复百澳生物，反应体系50ul。
[0114]
(8)试纸条反应：扩增完成之后，将试纸条样品垫端插入反应体系中反应20分钟。扩增产物通过毛细泳动到达样品垫，但并未到达结合垫和nc膜。
[0115]
(9)反应结束后，向管内加入50ul pbs，试纸条显色，通过显色情况判断结果。
[0116]
通过对10份添加不同浓度及未添加新型冠状病毒orf1ab假病毒的鼻拭子进行检测，表面本试纸条可检测出500拷贝/ml。
[0117]
从以上实验结果可以看出，本发明产品的特异性强、灵敏度高，操作简单便捷、检测速度快，且能够实现多指标的联合检测，能够较好的实现基于crispr系统的分子侧向层析可视化检测。
[0118]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换
和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
