提高姜黄素溶解度的方法及其组合物和医疗器械与流程

1.本发明涉及一种提高物质亲水性的方法，尤其涉及一种提高姜黄素溶解度的方法，以及含有姜黄素的组合物，以利于姜黄素的给药。


背景技术：

2.姜黄素(化学式：c
21
h
20
o6，(1e，6e)
‑
1，7
‑
双(4
‑
羟基
‑3‑
甲氧基苯基)
‑
1，6
‑
庚二烯
‑
3，5
‑
二酮)已被确定为姜黄的主要药理化合物，该化合物已展示出很多有益的药理特性，比如：抗氧化、抗肿瘤、抗艾滋病毒和抗菌等作用。然而，姜黄素系疏水分子，难溶于水性介质，在有机溶剂中见光易分解，而且已有研究也表明姜黄素系统性给药后吸收性较差，容易被机体快速清除，这都导致了姜黄素的在实际临床应用时的生物利用度极低，而限制了姜黄素的医学应用。
3.已有诸多的增溶技术被应用于姜黄素，比如：固体分散技术、环糊精的包合技术、与peg偶联的前药技术、乳化技术和脂质体技术等(中国调味品[j]，2012，7，89～92)。
[0004]
但这些技术均从药物开发的角度着手，限制了姜黄素在临床中针对不同靶组织的应用范围。


技术实现要素：

[0005]
本发明的一个目的在于提供一种提高姜黄素溶解度的方法，提高姜黄素在含水介质中的浓度，利于姜黄素的吸收利用。
[0006]
本发明的另一个目的在于提供一种组合物，以此作为载体应用于姜黄素的装载，利于姜黄素在各种靶组织中的应用。
[0007]
本发明的再一个目的在于提供一种医疗器械，覆于组织表面后，能释放姜黄素，发挥药理作用，比如：抗菌、抗氧化和抗肿瘤。
[0008]
一种提高姜黄素溶解度的方法，将活性成分姜黄素与辅料混合后，再经静电纺丝形成纤维膜，并将姜黄素分散于纤维膜内。
[0009]
辅料作为姜黄素分散的载体，并能适用于静电纺丝工艺，通常采用有机高分子、溶胶凝胶物质，或者高分子和无机复合材料，具体的如：明胶、改性明胶、聚乙二醇和聚乳酸等为利于姜黄素的长效缓释，以及在含水介质中浓度的提高，优先选择的辅料具有交联特性，比如：外交联、内交联或自交联，具体的材料如：光敏明胶。
[0010]
另一种提高姜黄素溶解度的方法，将活性成分姜黄素与溶胶凝胶物质混合后，再经静电纺丝形成纤维膜，并将姜黄素分散于纤维膜内。
[0011]
另一种提高姜黄素溶解度的方法，将活性成分姜黄素与光敏凝胶混合后，再经静电纺丝形成纤维膜，并将姜黄素分散于纤维膜内。
[0012]
另一种提高姜黄素溶解度的方法，将活性成分姜黄素与甲基丙烯酰胺改性明胶混合后，再经静电纺丝形成纤维膜，并将姜黄素分散于纤维膜内。
[0013]
另一种提高姜黄素溶解度的方法，将活性成分姜黄素与甲基丙烯酰胺改性明胶与
有机溶剂中溶解，获得静电纺丝液，于静电纺丝设备中制取纤维膜，并除去制得的纤维膜中残余有机溶剂；
[0014]
接着，将制得的纤维膜置于含有光引发剂的溶液(如：6w/v％irgacure 2959聚乙二醇二甲醚(mw＝500)溶液)中浸泡后，再将纤维膜置于光照下，实施交联反应；
[0015]
交联反应后，将纤维膜干燥，获得静电纺丝姜黄素纤维膜。
[0016]
适合的有机溶剂如：但不限于三氟乙醇、三氟乙酸和乙酸等。
[0017]
静电纺丝采用10～20kv，尤其是15kv直流电压，进给速度1.0ml/h～1.6ml/h，尤其是1.2ml/h。
[0018]
本发明还提供一种提高姜黄素溶解度的组合物，包括姜黄素和甲基丙烯酰胺改性明胶。其中，姜黄素为活性成分，甲基丙烯酰胺改性明胶作为姜黄素的载体，适用于静电纺丝工艺。
[0019]
另一种提高姜黄素溶解度的组合物，由静电纺丝制成的纤维膜，包括姜黄素和甲基丙烯酰胺改性明胶，其中，姜黄素为活性成分，甲基丙烯酰胺改性明胶作为姜黄素的载体。
[0020]
经验证，本发明制得的静电纺丝姜黄素纤维膜，其能持续释放姜黄素大于140小时，且含水介质中测得的姜黄素浓度至少达到53.1488μg/ml，相比于单纯姜黄素在水中浓度是0.412045μg/ml(几乎不溶于水)溶解度得到显著增加，且生物利用度亦明显提高，有利于缩短创面修复的时间。
[0021]
本发明提供的方法制成的静电纺丝姜黄素纳米纤维膜，作为医疗器械覆于靶组织上，能够利于姜黄素对靶组织实施抗菌、抗氧化和抗肿瘤等临床应用。
附图说明
[0022]
图1为本发明制得的静电纺丝姜黄素纳米纤维膜的sem图像；
[0023]
图2为本发明制得的静电纺丝姜黄素纳米纤维膜的体外释放曲线；
[0024]
图3为ldh法检测本发明制得的静电纺丝姜黄素纳米纤维膜的细胞毒性；
[0025]
图4为wst检测静电纺丝姜黄素纳米纤维膜的细胞毒性；
[0026]
图5为荧光显微镜拍摄显示细胞毒性情况；
[0027]
图6为姜黄素体内药代动力学结果图；
[0028]
图7为姜黄素体内药代动力学auc结果图；
[0029]
图8为创面愈合率结果图；
[0030]
图9为组织学he染色结果图。
具体实施方式
[0031]
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
[0032]
实施例1姜黄素纤维膜的制取和表征
[0033]
将1g甲基丙烯酰胺改性明胶(gelma，购自苏州永沁泉智能设备有限公司)和0.1g
姜黄素(sigma
‑
aldrich)溶解在10ml三氟乙醇中，然后将溶液以500rpm搅拌3小时并超声脱气20分钟，使得姜黄素和gelma完全溶解于三氟乙醇中，获得纺丝液。在静电纺丝过程中，将纺丝液放入20ml注射器中，注射器距离铝箔包裹铜板10cm，带有20号喷嘴。注射泵(cole parmer，美国)的进给速度设置为1.2ml/h，直流电压为15kv。制备的样品经真空干燥以除去残余有机溶剂，获得纳米纤维膜。
[0034]
然后进行交联，交联过程如下：首先制备6w/v％irgacure 2959聚乙二醇二甲醚(mw＝500)溶液，然后将制备的纳米纤维膜浸泡其中5分钟，然后将浸泡后的纳米纤维膜在紫外灯(omnicure s100，80％强度模式)下曝光1分钟，以激活交联反应。最后，用pbs缓冲液冲洗3分钟，然后在冷冻干燥机中干燥48小时，获得静电纺丝姜黄素纳米纤维膜。
[0035]
对本实施例中获得的静电纺丝姜黄素纳米纤维膜，通过扫描电子显微镜(sem，jsm
‑
5600lv，jeol，japan)在5kv的加速电压下观察了纳米纤维膜的形貌。平均纳米纤维尺寸和孔径是通过使用imagej软件(nih，美国)在典型的sem图像上进行的至少30次测量来确定的。如图1所示，典型的sem图像显示交联(右)和非交联(左)纳米纤维都显示出光滑的纤维基质。此外，姜黄素负载的纳米纤维(右栏)没有任何可见的聚集体存在，这表明通过静电纺丝形成了姜黄素纳米固体分散体，而没有相分离。
[0036]
对本实施例中获得的静电纺丝姜黄素纳米纤维膜，用x射线衍射仪(d/max
‑
2550pc，日本rigaku)记录了cu
‑
kα在5
°‑
65
°
范围内的x射线衍射图。纯姜黄素晶体的x射线衍射谱显示出许多显著的峰；而分子取向和聚合物排列无序的非晶态明胶的x射线衍射谱完全没有衍射峰；然而，当通过静电纺丝将姜黄素纳米化为明胶纳米纤维时，姜黄素完全转化为非晶态，其原始离散峰从共混纳米纤维膜的光谱中消失。
[0037]
对本实施例中获得的静电纺丝姜黄素纳米纤维膜的官能团通过衰减全反射
‑
傅立叶变换红外光谱(atr
‑
ftir，nexus 670thermo nicolet，usa)进行分析，使用覆盖500
‑
4500cm
‑1的kgr颗粒红外范围，分辨率为2cm
‑1。纯姜黄素的红外光谱在3302cm
‑1、1643cm
‑1、1540cm
‑1和1241cm
‑1处出现了典型的吸收峰。姜黄素纳米纤维膜的ftir图谱显示，姜黄素和明胶的特征峰(1510cm
‑1)和(3302cm
‑1或1643cm
‑1)。值得注意的是，姜黄素的特征o
‑
h吸收峰(3507cm
‑1)在姜黄素纳米纤维膜光谱中消失，而其芳香特征(1282cm
‑1)明显，表明姜黄素成功地进入明胶纳米纤维中，并且姜黄素与明胶之间可能存在相互作用。
[0038]
实施例2姜黄素释放和浓度试验
[0039]
在37℃下，在10ml磷酸盐缓冲液(pbs，ph 7.4)中检查制取静电纺丝姜黄素纳米纤维膜(cur
‑
gelma nm)的生姜黄素的体外溶出度，以及含水介质中的浓度。在预定的时间间隔内，每次取500μl进行检测，并用等体积的pbs代替，以保持恒定的体积。使用荧光分光光度计(fluoromax
‑
3，horiba)分析样品。每个样品的释放曲线分三次进行。绘制特定时间段内溶解药物的平均值与时间(小时，h)的关系。姜黄素体外控释。如图2所示，由于缓释过程中姜黄素水溶液中的浓度是动态变化的，根据缓释曲线换算出了一个时间浓度(曲线)。以144h为例，采用gelma凝胶的姜黄素在水中测得的浓度是53.1488μg/ml。此时，姜黄素(curcumin)检测到姜黄素浓度是0.412045μg/ml，几乎不溶于水。
[0040]
实施例3细胞毒性检测
[0041]
人成纤维细胞系hs
‑
27(crl
‑
1634
tm
)在37℃和5％co2条件下，在添加10％fbs的dmem中培养。每周更换培养基2～3次，细胞汇合达到80％时按1∶4的比例传代。在37℃
下用pbs洗涤细胞并用0.25％胰蛋白酶edta溶液分离细胞，然后用培养基更新并重新接种到新的培养瓶中。
[0042]
细胞毒性检测(ldh和wst
‑
1试验)
[0043]
采用改良的iso10993
‑
5标准试验方法，用hs
‑
27细胞评价纳米纤维膜的细胞毒性。6cm2的不同纳米纤维膜(有/无姜黄素)在37
±
1℃无血清的1ml dmem中浸泡72
±
2小时，以获得样品提取物。然后，将样品提取物与适量培养基(dmem加10％fcs)混合制备纳米纤维膜条件培养基(conditioned medium，cm)，进行细胞毒性试验。将hs
‑
27s以5
×
103个细胞/孔的密度接种到96孔板上。细胞接种24小时后，替换成纳米纤维膜条件培养基。以等量dmem与培养基混合作为对照。ldh(乳酸脱氢酶)和wst
‑
1(水溶性四氮唑
‑
1)检测按照制造商的说明每隔一天进行一次(德国罗氏公司)，数据由mithras lb940微孔板阅读器(德国berthold technologies)收集。如图3和图4所示，实验结果表明姜黄素纳米纤维膜条件培养基连续培养7天仍与无姜黄素的纳米纤维膜条件培养基(cm gelma)以及dmem培养基对照组(dmem)没有明显区别，表明姜黄素纳米纤维膜条件培养基(cm cur
‑
gelma)对于正常体细胞没有明显毒性。
[0044]
将hs
‑
27s以1
×
105个细胞/孔的密度接种到一个6孔板中。细胞接种后24h，用有/无姜黄素纳米纤维膜条件培养基或0.5ng/μl嘌呤霉素(puromycin，阳性对照)培养基代替上清液。细胞在37℃和5％二氧化碳下培养5天。对于基于荧光的双色细胞活/死分析，每隔一天将钙黄绿素am(绿色，ex/em＝494/517nm)和乙炔同二聚体
‑
1(红色，ex/em＝528/617nm)添加到培养基中(德国invitrogen)。图像通过荧光显微镜拍摄，并通过axiovision软件(德国卡尔蔡司)进行分析。如图5所示，hs
‑
27细胞用姜黄素或不加姜黄素的条件培养液处理5天后，几乎没有死细胞(显示红色荧光)，而有大量活细胞(显示绿色荧光)，表明姜黄素纳米纤维膜对细胞没有毒性且不影响细胞的增值。
[0045]
实施例4体内药代动力学(pk)测试
[0046]
总共48只雄性c57bl/6小鼠随机分为两组(每组n＝24)，每个药代动力学时间点分配3只小鼠。所有受试小鼠在实验过程中都需要禁食一夜(12小时)，以避免食物影响cur的吸收。以25mg/kg的剂量向每组口服姜黄素(cur)或cur
‑
gelatin(gelma)纳米纤维膜。用5％异氟醚麻醉小鼠，并在指定的时间点(给药前和0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时和12小时)通过眶后从每只老鼠取血。收集的血液用抗凝剂k2
‑
edta处理，在4℃下以5000rpm离心10分钟以分离血浆。血浆样品在分析前避光并储存在
‑
80℃。在分析之前，将血浆样品与等体积的甲醇混合，然后在4℃下以12,000rpn/min的速度离心10分钟。小心取出上清液进行lc
‑
ms/ms分析。最后使用外标法计算血浆药物浓度，准确度在90％～110％范围内。
[0047]
在本实施例中，在口服游离cur或负载cur的纳米纤维膜后，随着时间的推移检测到小鼠血浆中的cur。pk数据详见图6和图7所示中。血浆中总姜黄素的浓度在给药后60分钟升至最高水平(124ng/ml)，此后逐渐下降。此外，峰值浓度(cmax)和负载cur的纳米纤维垫的曲线下面积(auc)与游离cur相比增加了11倍和10倍，有助于提高cur纳米固体分散体的生物利用度。
[0048]
实施例5创面的应用
[0049]
清洁级spf sd雄性大鼠24只，体重160
±
20g，用3％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注
射麻醉。电推剔除大鼠背部下段毛发至两侧腋中线，碘伏消毒。每只大鼠于背部正中做直径lcm圆形切口，切除全层皮肤造成缺损。将模型大鼠分为空白对照组(control，不给药)、试验对照组(gelma，无姜黄素纳米纤维膜)和试验组(cur
‑
gelma，载姜黄素纳米纤维膜)3组，每组8只大鼠。各组大鼠采用常规敷料包扎，正常隔日换药并拍照记录创面大小至创面愈合(记录造模后至创面愈合所用时间)，大鼠实施安乐死。无菌条件下采集愈合组织标放入4％甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋后连续切片，切片厚度3μm，常规he染色。
[0050]
创面愈合率的计算公式：创面愈合率＝(治疗后创面面积/原始创面面积)
×
100％
[0051]
根据图8的实验结果可以看出，造模后第7日开始，实验组大鼠创面愈合率显著显高于空白对照组(p＜0.001)及实验对照组(第15天时p＜0.01，其余时间点均为p＜0.001)。
[0052]
与此同时，组织学检查(he染色)显示(参见图9)实验组大鼠愈合组织的上皮化程度及胶原数量、成熟度均显著优于空白对照组及实验对照组。这说明本实施例的载姜黄素纳米纤维膜可以有效地快速促进创面愈合并提高愈合组织的质量。
[0053]
通过以上实验验证得出，本发明中的载姜黄素纳米纤维膜可以局部缓释姜黄素，从而有效发挥姜黄素创面调节的作用，从而促进皮肤组织修复和愈合。