一种基于3D打印构建用于修复重建颅颌面的方法与流程

一种基于3d打印构建用于修复重建颅颌面的方法
技术领域
1.本发明涉及3d打印技术领域，具体说是一种基于3d打印构建用于修复重建颅颌面的方法。


背景技术：

2.随着我军单兵作战军事实战化训练和演练的增多，颅颌面骨骨折病例也随之增加。颌面部解剖结构较复杂，骨块形状不规则，骨折后骨块移位复杂多变，对颜面部外形影响明显，对患者的心理带来不良影响。由于解剖结构的复杂性，使该部位的骨折复位存在很大困难，因此既要恢复良好的解剖结构，又要最大限度地改善面形及功能是临床医生努力的目标。
3.随着技术和材料的不断发展, 生物3d打印技术在医学领域中的应用从制造无生命的模型、纯材料支架跨越到有生命的细胞、组织甚至器官的仿生构建,使其在临床及再生医学领域中的应用具有巨大潜力。与传统制造技术相比, 生物3d打印技术能够精确控制细胞、生物材料以及生长因子的空间分布, 解决多细胞、多材料的高精度、高仿生打印, 有望满足对精细细胞组装方式、组织微环境的精准模拟以及细胞.材料集成后的功能保持等复杂要求,为实现组织和器官的重建提供了必要的物质手段和工具。
4.现有的人工颌面骨修补材料主要是以钛网和聚醚醚酮材料为主, 基于3d个性化制造的植入物植入体内后,具有良好的生物相容性、与缺损部位形状精准匹配等优势, 在临床上得到广泛应用。但是钛金属和聚醚醚酮材料都不具有降解特性, 无法满足骨再生需求；以往3d打印所采用的材料存在生物不相容性和生物不安全性的缺点，导致其不能很好大量应用于临床；因此，如何克服上述存在的技术问题和缺陷成为重点需要解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的发明目的在于克服背景技术中所描述的缺陷，从而实现一种基于3d打印构建用于修复重建颅颌面的方法。
6.为实现上述发明目的，本发明的技术方案是：一种基于3d打印构建用于修复重建颅颌面的方法，包括以下步骤：（1）自体骨基质（auto
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bm）研磨首先，把每个自体骨基质（auto
‑
bm）粉碎成0.5
×
0.5 cm
2 碎片，将其碎片放置冷冻干燥箱种，在
‑
80℃下冻干24小时；之后，把自体骨基质（auto
‑
bm）放入研磨缸，液氮预冷10min，然后用振动研磨机研磨成颗粒；液氮预冷有助于防止颗粒在室温下磨削时，由于过热，导致的一些损耗生物活性成分，还可以减少研磨后颗粒表面形貌不规则，表面粗糙的现象；避免后续打印过程打印出的自体骨质地不均匀，质量不高。
7.自体骨基质（auto
‑
bm）具有生物相容性、生物安全性和骨再生能力，使用既方便又安全。
8.（2）bm料浆的制备
将聚乙二醇己内酯 (pcl)和冰乙酸(gaa)按重量比为2:3放置在锥形瓶中，被缓慢加热至90℃，在pcl完全溶解后，形成pcl墨水；pcl墨水在室温下被完全冷却1小时，此后，将auto
‑
bm颗粒与pcl墨水按重量比为3:5混合在一起合成bm浆料；pcl油墨的配置一般采用二氯甲烷的混合物(dcm)和1,4
‑
二恶烷作为溶剂配制pcl油墨，混合后可轻易打印。然而，当微米大小的bm颗粒和pcl油墨混合后，再打印，则导致喷嘴经常堵塞。因此，本发明改进了pcl墨水的制备，使其混合后可轻易打印，不堵塞喷嘴，确保打印过程的流畅程度，减小打印后的误差。
9.（3）3d打印多层次3d打印自体骨（3dp
‑
auto
‑
bone）首先进行颌面部三维重建ct，将该三维重建ct数据输入3d打印机，采用堆砌技术打印，历时4h，获得1:1面颅骨模型；在模型上分析骨折情况，记录在模型上可以观察的骨折数量; 与正常侧对比，测量明显错位部位断端的最大移位距离，数据差别不超过1mm。建立受损或缺失的3d模型；之后将步骤（2）中的bm浆料注入3d打印机，形成3d打印自体骨（3dp
‑
auto
‑
bone）；采用此种方法打印出的3d打印自体骨（3dp
‑
auto
‑
bone）具有形状特异性、材料特异性，用于真正的患者特异性修复；（4）骨髓提取骨髓间充质干细胞（bmscs）在大腿上部切口1cm，在股骨顶部开一个孔，用肝素冲洗的注射器抽取骨髓4ml；将肝素抗凝收集的骨髓悬液与d
‑
hanks液按体积比为1:1进行稀释，将稀释后的骨髓悬液和分离液按体积比为2:1加入离心管，将离心管放置离心机中，1800 转/分钟，离心 15 分钟，收集富含有核细胞的界面层细胞；之后用d
‑
hanks液清洗界面层细胞 1 遍，并调整细胞浓度为 1
×
105/ml，接种于培养基中，在37℃，含5% co2的环境中培养，传代至传代3 (p3)；（5）3d打印自体骨（3dp
‑
auto
‑
bone）结合骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞（bmscs）的p3自动繁衍达到80%，悬浮于新鲜完全培养液（ccm）中，量取250毫升，浓度为4
×
10
6 /毫升的bmscs悬液添加到每个预亲水的3dp
‑
auto
‑
bone上孔超低附着板，在37℃、5% co
2 的环境中培养2h；之后，每48 h加入新鲜完全培养液（ccm） 1 ml，刷新一次；同时将bmscs以同样的方式播种在3dp
‑
auto
‑
bone中，培养2周后制成多层定制骨植入物植入机体。
10.进一步地，步骤（2）中的聚乙二醇己内酯 (pcl)和冰乙酸(gaa)按重量和体积比为16:23进行配置。
11.进一步地，步骤（2）中的auto
‑
bm颗粒与pcl墨水按重量和体积比为3：4进行配置。
12.进一步地，步骤（4）中的培养基包含有dmem
‑
lg、1％青 链 霉 素 双 抗 溶 液 (penicillin
‑
streptomycin)、5ng/ml 成 纤 维 细 胞 生 长 因子 (bfgf)、10％ fbs( 胎牛血清 )。
13.进一步地，骨髓间充质干细胞（bmscs）在步骤（4）的培养过程和步骤（5）在3dp
‑
auto
‑
bone中的种植均采用25gy的伽玛辐射灭菌。
14.本发明的基于3d打印构建用于修复重建颅颌面的方法的有益效果：1.本发明的基于3d打印构建用于修复重建颅颌面的方法，本发明采用自体骨基质(auto
‑
bm)和自体细胞制备的3d打印自体骨（3dp
‑
auto
‑
bone）具有天生的生物相容性、生物安全性和骨再生能力，为成骨提供良好的生物活性，在种植体中，auto
‑
bmscs可以在体外自发分化为成骨细胞，不需要额外的诱导成骨因子，在关键尺寸颅骨缺损的体内模型，植入物
bmscs 贴壁生长的特点，培养 2
‑
3天后可见 bmscs 基本贴壁，因此在原代培养末期即可以获得均一性较好的 bmscs。之后用d
‑
hanks液清洗界面层细胞 1 遍，并调整细胞浓度为 1
×
105/ml，接种于25cm
2 的培养瓶，培养基包含有dmem
‑
lg、1％青 链 霉 素 双 抗 溶 液 (penicillin
‑
streptomycin)、5ng/ml 成 纤 维 细 胞 生 长 因子 (bfgf)、10％ fbs( 胎牛血清 )，在37℃，含5% co2的环境中培养，传代至传代3 (p3)；（5）3d打印自体骨（3dp
‑
auto
‑
bone）结合骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞（bmscs）的p3自动繁衍达到80%，悬浮于新鲜完全培养液（ccm）中，量取250毫升，浓度为4
×
10
6 /毫升的bmscs悬液添加到每个预亲水的3dp
‑
auto
‑
bone上孔超低附着板，在37℃、5% co
2 的环境中培养2h；之后，每48 h加入新鲜完全培养液（ccm） 1 ml，刷新一次；同时将bmscs以同样的方式播种在3dp
‑
auto
‑
bone中，培养2周后制成多层定制骨植入物植入机体。骨髓间充质干细胞（bmscs）在步骤（4）的培养过程和步骤（5）在3dp
‑
auto
‑
bone中的种植均采用25gy的伽玛辐射灭菌。
23.实施例2一种基于3d打印构建用于修复重建颅颌面的方法，包括以下步骤：（1）自体骨基质（auto
‑
bm）研磨首先，把每个自体骨基质（auto
‑
bm）粉碎成0.5
×
0.5 cm
2 碎片，将其碎片放置冷冻干燥箱种，在
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80℃下冻干24小时；之后，把自体骨基质（auto
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bm）放入研磨缸，液氮预冷10min，然后用振动研磨机研磨成颗粒；振动研磨机为北京研磨仪器公司生产，型号为研磨机gt200。
24.（2）bm料浆的制备将聚乙二醇己内酯 (pcl)和冰乙酸(gaa)按重量和体积比为16:23进行配置，并放置在锥形瓶中，被缓慢加热至90℃，在加热过程中，不断搅拌，促使聚乙二醇己内酯 (pcl)溶解。在pcl完全溶解后，形成pcl墨水；之后，pcl墨水在室温下被完全冷却1小时，此后，将auto
‑
bm颗粒与pcl墨水按重量和体积比为3：4进行配置，混合在一起合成bm浆料，常温保存。
25.（3）3d打印多层次3d打印自体骨（3dp
‑
auto
‑
bone）首先进行颌面部三维重建ct，将该三维重建ct数据输入3d打印机，采用堆砌技术打印，历时4h，获得1:1面颅骨模型；在模型上分析骨折情况，记录在模型上可以观察的骨折数量; 与正常侧对比，测量明显错位部位断端的最大移位距离，数据差别不超过1mm。建立受损或缺失的3d模型；之后将步骤（2）中的bm浆料注入3d打印机，形成3d打印自体骨（3dp
‑
auto
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bone）；打印机为美国3d systems 公司的3d sytems 打印机。
26.（4）骨髓提取骨髓间充质干细胞（bmscs）在大腿上部切口1cm，在股骨顶部开一个孔，用肝素冲洗的注射器抽取骨髓4ml；将肝素抗凝收集的骨髓悬液与d
‑
hanks液按体积比为1:1进行稀释，取15ml 离心管加入 5ml密度为 1.077 的淋巴细胞分离液，10ml 稀释后骨髓悬液缓慢加在ficoll 分离液上，将离心管放置离心机中，采用密度梯度离心法，在1800 转/分钟，离心 15 分钟，经过梯度离心后，将大部分红细胞、脂肪细胞、血小板等去除，收集富含有核细胞的界面层细胞。再根据 bmscs 贴壁生长的特点，培养 2
‑
3天后可见 bmscs 基本贴壁，因此在原代培养末期即可以获得均一性较好的 bmscs。之后用d
‑
hanks液清洗界面层细胞 1 遍，并调整细胞浓度为 1
×
105/ml，接种于25cm
2 的培养瓶，培养基包含有dmem
‑
lg、1％青 链 霉 素 双 抗 溶 液 (penicillin
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streptomycin)、5ng/ml 成 纤 维 细 胞 生 长 因子 (bfgf)、10％ fbs( 胎牛血清 )，在37℃，含5% co2的环境中培养，传代至传代3 (p3)；（5）3d打印自体骨（3dp
‑
auto
‑
bone）结合骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞（bmscs）的p3自动繁衍达到80%，悬浮于新鲜完全培养液（ccm）中，量取250毫升，浓度为4
×
10
6 /毫升的bmscs悬液添加到每个预亲水的3dp
‑
auto
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bone上孔超低附着板，在37℃、5% co
2 的环境中培养2h；之后，每48 h加入新鲜完全培养液（ccm） 1 ml，刷新一次；同时将bmscs以同样的方式播种在3dp
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auto
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bone中，培养2周后制成多层定制骨植入物植入机体。骨髓间充质干细胞（bmscs）在步骤（4）的培养过程和步骤（5）在3dp
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auto
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bone中的种植均采用25gy的伽玛辐射灭菌。
27.除非另作定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本技术说明书以及权利要求书中如使用“一个”或者“一”等类似词语也不必然表示数量限制。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。“连接”或者“相连”等类似词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电性的连接，不管是直接的还是间接的。
28.上文中参照优选的实施例详细描述了本发明的示范性实施方式，然而本领域技术人员可理解的是，在不背离本发明理念的前提下，可以对上述具体实施例做出多种变型和改型，且可以对本发明提出的各技术特征、结构进行多种组合，而不超出本发明的保护范围。