一种含配体缀合物NOTA-PSMA-Cy7的68Ga标记靶向试剂盒及其应用的制作方法

一种含配体缀合物nota
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psma
‑
cy7的68ga标记靶向试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于核医学技术领域，具体涉及一种含配体缀合物nota
‑
psma
‑
cy7的68ga标记靶向试剂盒及其应用。


背景技术：

2.前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，其已成为男性第二大常见癌症，发病率和死亡率仅次于肺癌。由于前列腺癌本身生长缓慢，处于早期的前列腺癌患者可以通过根治性手术或者根治性放疗等方式，达到良好的治疗效果，甚至得以治愈。前列腺癌手术要点是切除前列腺和精囊，而后进行排尿通路重建，并根据患者危险分层和淋巴转移情况，决定是否对病变部位淋巴组织及周围的脂肪、肌肉、神经、血管等进行切除。所以在手术的过程中，是存在病灶组织未被完全切除的可能的，因此前列腺癌肿瘤特异性示踪分子对于该病的治疗具有重要的意义。
3.前列腺特异性膜抗原（psma）在前列腺癌细胞中高度表达，在前列腺癌转移灶的细胞中也具有特异性的高度表达，因此靶向psma的前列腺癌分子探针被设计并得以一定的应用。而正电子发射计算机断层显像（pet）在临床诊断上应用越来越广泛，正电子核素68ga得益于它的优良核素性质，也得到了一定的应用。但目前，68ga标记药物的应用长期受制于锗镓发生器的68ga漏穿及淋洗液不纯等问题。而且68ga pet/ct sstr显像在仍有一些缺陷，突出的问题之一是对肿瘤组织的检出率低。
4.因此，目前就需要研发一种能够对前列腺癌病灶组织示踪性或显像性好且检出率高的试剂或者产品，以提高前列腺癌的治疗效果而减少肿瘤复发的风险。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种含配体缀合物nota
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psma
‑
cy7的68ga标记靶向试剂盒及其应用。所述配体缀合物具有荧光显像和pet显像双功能，不仅能够直接用于合成前列腺癌荧光显像剂，还能够制成试剂盒而用来合成前列腺癌pet显像剂，且显像清晰。
6.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：本发明提供了一种配体缀合物nota
‑
psma
‑
cy7，所述配体缀合物nota
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psma
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cy7的结构为glu
‑
urea
‑
lys
‑
naphte
‑
peg
‑
ser
‑
ser
‑ꢀ
nota
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cy7，其中glu为谷氨酸，urea为尿素，lys为赖氨酸，naphte为萘基，peg为聚乙二醇，ser为丝氨酸，cy7为荧光染料，nota为双功能螯合剂。
7.进一步的，所述配体缀合物nota
‑
psma
‑
cy7的结构式为：
。
8.本发明还提供了一种包含所述的配体缀合物nota
‑
psma
‑
cy7的68ga标记靶向试剂盒，所述试剂盒包括组合物试剂瓶、溶剂瓶a、溶剂瓶b和溶剂瓶c；所述组合物试剂瓶中包括nota
‑
psma
‑
cy7溶液和龙胆酸溶液。
9.进一步的，在组合物试剂瓶中，所述nota
‑
psma
‑
cy7溶液和所述龙胆酸溶液的摩尔比为1:2500~4500。
10.进一步的，在组合物试剂瓶中，所述nota
‑
psma
‑
cy7溶液的体积为20μl
ꢀ‑
120μl，所述龙胆酸溶液的体积为300μl
‑
1000 μl。
11.进一步的，所述组合物试剂瓶的制备方法为：（1）利用无菌水配制1μmol/ml
ꢀ‑
5 μmol/ml的nota
‑
psma
‑
cy7溶液；（2）利用无菌水配制300 μmol/ml
‑
500μmol/ml的龙胆酸溶液；（3）取配制好的nota
‑
psma
‑
cy7溶液和龙胆酸溶液充分混合后，经冷冻干燥后，分装入瓶，充入惰性气体加以保护，得到组合物试剂瓶。
12.优选的，所述组合物试剂瓶的制备方法为：（1）利用无菌水配制1μmol/ml的nota
‑
psma
‑
cy7溶液；（2）利用无菌水配制300 μmol/ml的龙胆酸溶液；（3）取配制好的nota
‑
psma
‑
cy7溶液20μl和龙胆酸溶液300 μl充分混合后，经冷冻干燥后，分装入瓶，充入惰性气体加以保护，得到组合物试剂瓶。
13.进一步的，所述惰性气体包括氦气、氩气和氮气。
14.进一步的，所述溶剂瓶a的组分为醋酸/醋酸钠溶液；所述溶剂瓶b的组分为50%乙醇生理盐水溶液；所述溶剂瓶c的组分为生理盐水溶液。
15.优选的，所述溶剂瓶a的组分为0.3 mol/l醋酸/醋酸钠溶液，1 ml/瓶；所述溶剂瓶b的组分为50%乙醇生理盐水溶液，1 ml/瓶；所述溶剂瓶c的组分为0.9%氯化钠溶液，5 ml/瓶。
16.本发明还提供了所述的配体缀合物nota
‑
psma
‑
cy7在用于制备前列腺癌荧光显像剂中的应用。
17.进一步的，所述nota
‑
psma
‑
cy7的使用方法为：将1 μmol/ml nota
‑
psma
‑
cy7溶液20μl与300 μmol/ml龙胆酸溶液300 μl混合均匀后，使用1ml的0.9%氯化钠溶液稀释后，经静脉注射使用来显示前列腺癌及其病灶组织。
18.优选的，所述nota
‑
psma
‑
cy7的用量为50μg。
19.本发明还提供了所述的68ga标记靶向试剂盒在用于合成前列腺癌显像剂中的应用。
20.进一步的，利用所述试剂盒合成前列腺癌显像剂的步骤为：在无菌条件下，用无菌注射器将溶剂瓶a内的溶液全部抽出后注入组合物试剂瓶中，充分震荡摇匀，再注入与溶剂瓶a中溶液体积比为1:1
‑
2的含68ga的氯化镓溶液，充分混匀后，经80℃
‑
110℃加热10min
‑
20min后，用分离柱分离纯化反应液，再用无菌水清洗分离柱，清洗后，在分离柱上连接无菌滤膜，再将无菌滤膜插入到无菌瓶中，分别使用溶剂瓶b中和溶剂瓶c中的溶液洗脱出目标产物，得到前列腺癌显像剂。
21.本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：1、本发明制备得到的配体缀合物nota
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pmsa
‑
cy7是具有荧光显像、正电子pec
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ct显像的双功能分子，可以直接使用作为荧光显像剂来显示前列腺癌组织的位置和大小。
22.2、利用配体缀合物nota
‑
pmsa
‑
cy7制备得到的68ga标记靶向试剂盒各组分明确且纯度高，且使用步骤简单，能够用于合成前列腺癌显像剂，且显像效果清晰。
23.3、所述的配体缀合物nota
‑
pmsa
‑
cy7和68ga标记靶向试剂盒不仅在前列腺癌显示剂的制备中具有很好的应用价值，并且在前列腺癌手术导航中也同样具有极好的应用价值，能够提示手术过程中，肿瘤组织的剥离是否完全，以减少肿瘤复发的风险，因此两者对手术有较大指导意义。
附图说明
24.图1为68ga
‑
nota
‑
psma
‑
cy7的质控检测结果，其中a为紫外谱图；b为radio
‑
hplc放射性谱图；c为radio
‑
itlc放射性谱图。
25.图2为68ga
‑
nota
‑
psma
‑
cy7的荷瘤鼠pet扫描图。
26.图3为荷瘤鼠注射nota
‑
psma
‑
cy7后的肿瘤荧光显像结果图，其中a为实验a组，b为实验b组。
27.图4为荷瘤鼠解剖后肿瘤组织图。
28.图5为b组荷瘤鼠手术后的肿瘤荧光显像结果图。
29.图6为b组荷瘤鼠手术剥离的肿瘤的显像结果。
具体实施方式
30.结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
31.下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
32.实施例1本发明的试剂盒包括：组合物试剂瓶、溶剂瓶a、溶剂瓶b、溶剂瓶c，具体如下：1、组合物试剂瓶中的组分包括：nota
‑
psma
‑
cy7溶液和龙胆酸溶液，具体的制备方法为：（1）以灭菌注射用水为溶剂，配制1 μmol/ml nota
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psma
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cy7溶液；（2）以灭菌注射用水为溶剂，配制300 μmol/ml 龙胆酸溶液；
（3）取配制的nota
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psma
‑
cy7溶液 20μl，龙胆酸溶液300 μl，充分混合后，冷冻干燥后装入分装瓶中，充入惰性气体氦气进行保护，得到组合物试剂瓶。
33.上述试剂需经过灭菌处理后方可使用，且以上操作步骤也需在无菌条件下操作，热原含量要控制在临床用药规定范围内。另外，惰性气体还可以选择氩气和氮气，并且在组合物试剂瓶中，nota
‑
psma
‑
cy7溶液与龙胆酸溶液的摩尔比需保持在1：2500
‑
4500之间。
34.其中，nota
‑
psma
‑
cy为配体缀合物，具体为特异性前列腺癌显像剂前体，制备方法如下：以螯合剂2
‑
s
‑
(4
‑
氨基苯)
‑
1,4,7三氮杂环壬烷
‑
1,4,7
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三乙酸（nota）为偶联基团对化合物glu
‑
urea
‑
lys
‑
naphte
‑
peg
‑
ser
‑
ser
‑
cy7（简称psma
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cy7）进行化学修饰，得到可用于放射性标记的配体缀合物nota
‑
psma
‑
cy7，结构为：glu
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urea
‑
lys
‑
naphte
‑
peg
‑
ser
‑
ser
‑ꢀ
nota
‑
cy7，结构式如下：。
35.在配体缀合物nota
‑
psma
‑
cy7中，glu为谷氨酸，urea为尿素，lys为赖氨酸，naphte为萘基，peg为聚乙二醇，ser为丝氨酸，cy7为荧光染料，nota为双功能螯合剂。
36.2、溶剂瓶a的组分为醋酸/醋酸钠溶液；制备方法为：以灭菌注射用水为溶剂，配制0.3 mol/l醋酸/醋酸钠缓冲溶液（ph 4.5），分装为1 ml/瓶，即得溶剂瓶a。
37.3、溶剂瓶b的组分为50%乙醇生理盐水溶液；制备方法为：取0.9%氯化钠（生理盐水）注射液为溶剂，与无水乙醇共同配制50%（v/v）乙醇生理盐水溶液，分装1ml/瓶，即得溶剂瓶b。
38.4、溶剂瓶c的组分为生理盐水溶液，只需取市售的0.9%氯化钠溶液，分装为5 ml/瓶，即得溶剂瓶c。
39.实施例2利用实施例1制备的试剂盒来合成前列腺癌显像剂，具体步骤如下：在无菌条件下，用无菌注射器将溶剂瓶a内的溶液全部抽出后注入组合物试剂瓶中，充分震荡摇匀，再注入经锗镓发生器淋洗获得的68ga
‑
氯化镓溶液0.37gbq
‑
1.11gbq（1ml），充分混匀后，经80
‑
110℃加热10min后，用sep
‑
pak c18 column light分离柱分离纯化反应液，然后用无菌水再次清洗分离柱（洗脱未反应的
68
ga镓离子），清洗后，在分离柱上连接一个0.2μm无菌滤膜，再将无菌滤膜经无菌针头插入到无菌瓶中，该无菌瓶为最终产品瓶，分别使用溶剂瓶b中和溶剂瓶c中的溶液将吸附在分离柱上的68ga
‑
nota
‑
psma
‑
cy7洗脱
进无菌瓶中，即得到前列腺癌显像剂68ga
‑
nota
‑
psma
‑
cy7。
40.在试剂盒中，溶剂瓶b的作用是洗脱显像剂，溶剂瓶c的作用是调节显像剂68ga
‑
nota
‑
psma
‑
cy中的乙醇浓度，其中乙醇浓度要控制在10%以下，满足临床用药要求。
41.所述前列腺癌显像剂68ga
‑
nota
‑
psma
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cy7的结构式如下：，其反应构成式如下：实施例3对实施例2制备的前列腺癌显像剂68ga
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nota
‑
psma
‑
cy7进行质控及使用效果检测。
42.1、68ga标记后质控检测68ga
‑
nota
‑
psma
‑
cy7配体缀合物hplc分析方法：使用gemini c18 5um 110a 150
×
4.6mm色谱柱；流速：1ml/min；紫外检测波长：220nm；流动相：a 水（含0.1%tfa）、b 乙腈（含0.1%tfa），梯度洗脱方法：0
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15min（b）20%
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50%，15
‑
20min（b）50%
‑
20%。
43.结果如图1a和1b所示，经hplc分析显示配体缀合物68ga
‑
nota
‑
psma
‑
cy7的化学纯度大于99%（紫外峰保留时间：6.847min）；经radio
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hplc分析显示68ga标记的配体缀合物放射性化学纯度大于99%（放射性峰保留时间：7.133min）。
44.2、放射性瞬时薄层色谱法（radio
‑
itlc）检测因68ga核素半衰期极短仅68min，68ga
‑
nota
‑
psma
‑
cy7标记完成后需要尽快给药，减少衰变损失，需要能够快速进行的质控检测方法，故进一步开发了放射性瞬时薄层色谱法，该方法质控仅需要2分钟即可完成，方法实施如下：载体为itlc
‑
sg玻璃纤维色谱纸，展开剂为0.5m柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液（ph=5）。取玻璃纤维纸，用移液枪移取样品轻轻点在玻璃纤维纸距离底部1.5 cm处，放入提前加入
500 μl 0.5m柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液（ph=5）试管中，展开到距离色谱纸顶部2.5 cm处取出晾干，将晾干后的色谱纸放置到radio
‑
itlc扫描仪上进行检测，即可获得radio
‑
itlc放射性谱图。
45.结果见图1c，在0.5m柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液（ph=5）体系下，产物的rf值在0
‑
0.4之间，游离镓[68ga] rf=1.2
‑
1.6，说明68ga标记产物68ga
‑
nota
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psma
‑
cy7的放射性化学纯度大于99%，未见游离镓[68ga]离子。
[0046]
3、荷瘤鼠pet扫描实验从江苏凯基生物购买lncap荷瘤鼠（前列腺癌模型鼠），肿瘤接种在裸鼠右前肢处。
[0047]
用胰岛素针将上述标记好的68ga
‑
nota
‑
pmsa
‑
cy7分装为50 μci/支，进行lncap荷瘤鼠尾静脉注射给药，分别于注射给药后1h、2h、3h进行小动物pet扫描，扫描过程中对荷瘤鼠进行异氟烷持续麻醉，每时间点静态全身扫描10min/床位，扫描能窗：350
‑
650 kev，扫描完成后对采集数据进行图像重建，重建算法为：osem3d/map。
[0048]
获得显像图如图2所示，图中可见68ga
‑
nota
‑
pmsa
‑
cy7肿瘤摄取部位（白色虚线内）。
[0049]
由上述说明，由实施例1所述的试剂盒制备得到的前列腺癌显像剂68ga
‑
nota
‑
psma
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cy7纯度高且对前列腺癌具有明显的显像作用。
[0050]
实施例4利用实施例1制备的试剂盒来合成前列腺癌荧光显像剂并进行荧光扫描显像，具体步骤如下：在无菌条件下，用无菌注射器抽取1ml溶剂瓶c中的生理盐水溶液加入到组合物试剂瓶中，充分摇匀后即得前列腺癌荧光显像剂。
[0051]
取4只前列腺癌模型鼠（lncap荷瘤鼠），肿瘤接种在裸鼠右前肢处，随机分为a组和b组，每组2只。用胰岛素针抽取上述荧光显像剂，按nota
‑
psma
‑
cy7质量，a组尾静脉注射5μg/只，b组尾静脉注射50μg/只。
[0052]
a、b两组分别于注射后1h在近红外荧光扫描成像仪上扫描，a组扫描图像见图3a，b组扫描图像见图3b，由两图对比分析，由于a组给药剂量较少，肿瘤摄取药物绝对量少，未能达到成像仪最佳成像效果；b组给药剂量较为适合，可见明确的肿瘤摄取。
[0053]
为进一步明确肿瘤对nota
‑
psma
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cy7的摄取，将b组两只小鼠处死后通过手术将肿瘤取下，肿瘤手术见图4，再次对b组小鼠进行扫描，扫描图像见图5，可见原肿瘤高摄取部位摄取信号消失，仅有部分肿瘤残留组织呈现摄取。进而将b组两只小鼠手术取下的肿瘤单独进行荧光成像扫描，扫描图像见图6，可见肿瘤上的高摄取荧光信号，进而明确肿瘤的高摄取。
[0054]
通过上述实验，明显可知nota
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psma
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cy7在前列腺癌手术导航中的应用价值，nota
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psma
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cy7为前列腺癌肿瘤特异性示踪分子，其仅在肿瘤细胞有高摄取而正常组织中没有摄取，故在本实施例中，经诊断为高摄取的肿瘤组织经手术后剥离除去绝大部分肿瘤组织后，小鼠原肿瘤部位还有少量荧光信号，则说明该手术还未将肿瘤组织去除干净，需进一步手术切除，以减少肿瘤复发的风险，因此nota
‑
psma
‑
cy7对手术有较大指导意义。
[0055]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施
例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。