一种脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法与流程

1.本发明涉及农药检测领域，尤其涉及一种脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法。


背景技术：

2.新烟碱类杀虫剂是一种新型高效、安全、选择型好且对哺乳动物低毒性的广谱杀虫剂，该类杀虫剂的靶标为烟碱型突触后膜乙酰胆碱受体，主要作用于昆虫中枢神经系统。自上世纪90年代开发以来，全世界140个国家广泛使用新烟碱类杀虫剂，目前占全球农药市场的25％以上。基于其优越的杀虫性能及选择性毒性，该类杀虫剂不仅广泛应用于农业生产，而且在家居生活中也有大量的应用，如草坪、家庭花园维护管理、牲畜和宠物除虫等。新烟碱杀虫剂全球范围的应用，已导致其残留于多种环境样品中，如土壤、室内灰尘、水体环境和食品等，人体尿液和血液中也有新烟碱类杀虫剂及其代谢产物残留的报道，检出率高达63
‑
100％。流行病学报道指出，新烟碱类杀虫剂人体长期暴露可能诱发先天性心脏病、无脑畸形和自闭症等疾病。
3.目前，现有技术中公开的新烟碱及其代谢产物的检测数量有限(6～8)，操作较为繁琐，定量准确性有待进一步提高。基于新烟碱杀虫剂的标靶受体性质，该类物质极有可能进入脑部影响神经系统，动物实验已验证高浓度啶虫脒、噻虫胺暴露可导致其残留于脑部组织中。为了准确定性、定量新烟碱类杀虫剂在人体脑脊液中的残留，急需一种简单便捷的新烟碱类杀虫剂在脑脊液中的检测方法。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提出了一种脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，以解决或部分解决现有技术中存在的技术问题。
5.第一方面，本发明提供了一种脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，包括以下步骤：
6.向脑脊液中加入稳定同位素标记的内标物后再与甲酸水溶液混合得到混合液；
7.将混合液通过固相萃取小柱，然后使用甲醇洗脱，再将洗脱液使用甲醇水溶液进行复溶；
8.对复溶后的溶液进行高效液相三重四级杆串联质谱法检测。
9.优选的是，所述的脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，高效液相三重四级杆串联质谱法检测条件为：选用waters acquity beh c18为高效液相色谱柱，所述高效液相色谱柱的长度为100mm、内径为2.1mm、填料颗粒直径为1.7μm；采用正负离子模式收集数据，串联质谱条件采用电喷雾电离，正离子模式检测条件为：碰撞气10psi，气帘气35psi，离子喷雾电压4000v，离子源温度650℃，离子源气体1和2均为70psi；负离子模式检测条件为：碰撞气8psi，气帘气30psi，离子喷雾电压
‑
4500v，离子源温度600℃，离子源气体1和2分别为70psi和50psi。
10.优选的是，所述的脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，采用梯度洗脱程序进行洗脱，梯度洗脱程序具体为：
11.时刻0min：采用体积比为5:95的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
12.时刻0.6min：采用体积比为5:95的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
13.时刻4min：采用体积比为99:1的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
14.时刻5min：采用体积比为99:1的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
15.时刻5.5min：采用体积比为5:95的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
16.时刻6.5min：采用体积比为5:95的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min。
17.优选的是，所述的脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，所述甲酸水溶液的体积浓度为0.003～0.008％。
18.优选的是，所述的脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，所述新烟碱类杀虫剂及其代谢物包括啶虫脒、去甲基啶虫脒、吡虫啉、5
‑
羟基吡虫啉、烯烃吡虫啉、噻虫嗪、n
‑
去甲基噻虫嗪、噻虫啉、噻虫啉酰胺、烯啶虫胺、噻虫胺、氟啶虫酰胺、氯噻啉、氟啶虫胺腈和6
‑
氯烟酸。
19.优选的是，所述的脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，啶虫脒、去甲基啶虫脒、吡虫啉、5
‑
羟基吡虫啉、噻虫嗪、n
‑
去甲基噻虫嗪、噻虫啉、噻虫啉酰胺、烯啶虫胺、噻虫胺、氟啶虫酰胺和氯噻啉采用正离子模式采集数据；烯烃吡虫啉、氟啶虫胺腈和6
‑
氯烟酸采用负离子模式采集数据。
20.优选的是，所述的脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，向脑脊液中加入稳定同位素标记的内标物后再与甲酸水溶液混合得到混合液具体为：向250～300μl的脑脊液中加入30～45ng的稳定同位素标记的内标物再与1～2ml体积浓度为1～3％的甲酸水溶液混合得到混合液。
21.优选的是，所述的脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，所述稳定同位素标记的内标物包括
13
c3‑
15
n2‑
烯啶虫胺，
13
c4‑
15
n
‑
噻虫嗪，d4‑
吡虫啉，
13
c6‑
啶虫脒，
13
c6‑
噻虫啉，
13
c4‑
15
n
‑
噻虫胺，
18
o
‑
15
n
‑
氟啶虫酰胺，d4‑
n
‑
去甲基噻虫嗪，
13
c6‑
噻虫啉酰胺，d4‑
氯噻啉，
13
c2‑
15
n
‑
去甲基啶虫脒，
13
c6‑6‑
氯烟酸，d3‑
13
c2‑
15
n2‑
氟啶虫胺腈，
13
c
‑
15
n2‑
烯烃吡虫啉，
13
c
‑
15
n2‑5‑
羟基吡虫啉的混合物。
22.优选的是，所述的脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，将混合液通过固相萃取小柱，然后使用甲醇洗脱，再将洗脱液使用甲醇水溶液进行复溶具体为：
23.将甲醇、氢氧化铵混合后，得到活化液，再利用活化液对固相萃取小柱进行活化；
24.用水淋洗活化后的固相萃取小柱，然后再将混合液通过固相萃取小柱；
25.将甲醇、甲酸与水混合后冲洗固相萃取小柱，负压干燥后，使用甲醇洗脱，将洗脱液氮气吹干，再用甲醇水溶液进行复溶。
26.优选的是，所述的脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，甲醇与氢氧化铵的体积比为(15～20):1；甲醇、甲酸与水的体积比为(4.5～5.5):(0.5～1.5):(42～46)。
27.本发明的一种脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法相对于现有技术具有以下有益效果：
28.(1)本发明的脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，采用高效、重复性好的固相萃取方法结合高效液相色谱三重四级杆串联质谱技术测定脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢物，利用同位素标记物方法，实现对样品中新烟碱类杀虫剂及其代谢物定性、定量测定，检测方法灵敏度高，数据可靠；
29.(2)本发明的脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，对脑脊液中15种新烟碱及其代谢产物的加标回收率可控制在80～120％范围内，质控基质为人体脑脊液，证明本方法用于检测脑脊液中15种新烟碱及其代谢产物的准确度高，数据可靠。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1为本发明实施例1中采用正离子模式采集数据的12种新烟碱类化合物的色谱图；
32.图2为本发明实施例1中采用负离子模式采集数据的3种新烟碱类化合物的色谱图。
具体实施方式
33.下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
34.本技术实施例提供了一种脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，包括以下步骤：
35.s1、向脑脊液中加入稳定同位素标记的内标物后再与甲酸水溶液混合得到混合液；
36.s2、将混合液通过固相萃取小柱，然后使用甲醇洗脱，再将洗脱液使用甲醇水溶液进行复溶；
37.s3、对复溶后的溶液进行高效液相三重四级杆串联质谱法检测。
38.在一些实施例中，脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，高效液相三重四级杆串联质谱法检测条件为：选用waters acquity beh c18为高效液相色谱柱，所述高效液相色谱柱的长度为100mm、内径为2.1mm、填料颗粒直径为1.7μm；采用正负离子模式收集数据，串联质谱条件采用电喷雾电离，正离子模式检测条件为：碰撞气10psi，气帘气
35psi，离子喷雾电压4000v，离子源温度650℃，离子源气体1和2均为70psi；负离子模式检测条件为：碰撞气8psi，气帘气30psi，离子喷雾电压
‑
4500v，离子源温度600℃，离子源气体1和2分别为70psi和50psi。
39.在一些实施例中，采用梯度洗脱程序进行洗脱，梯度洗脱程序具体为：
40.时刻0min：采用体积比为5:95的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
41.时刻0.6min：采用体积比为5:95的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
42.时刻4min：采用体积比为99:1的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
43.时刻5min：采用体积比为99:1的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
44.时刻5.5min：采用体积比为5:95的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
45.时刻6.5min：采用体积比为5:95的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min
46.在一些实施例中，流动相中所用的甲酸水溶液的体积浓度为0.003～0.008％。
47.在一些实施例中，新烟碱类杀虫剂及其代谢物包括啶虫脒、去甲基啶虫脒、吡虫啉、5
‑
羟基吡虫啉、烯烃吡虫啉、噻虫嗪、n
‑
去甲基噻虫嗪、噻虫啉、噻虫啉酰胺、烯啶虫胺、噻虫胺、氟啶虫酰胺、氯噻啉、氟啶虫胺腈和6
‑
氯烟酸。
48.在一些实施例中，啶虫脒、去甲基啶虫脒、吡虫啉、5
‑
羟基吡虫啉、噻虫嗪、n
‑
去甲基噻虫嗪、噻虫啉、噻虫啉酰胺、烯啶虫胺、噻虫胺、氟啶虫酰胺和氯噻啉采用正离子模式采集数据。
49.在一些实施例中，烯烃吡虫啉、氟啶虫胺腈和6
‑
氯烟酸采用负离子模式采集数据。
50.在一些实施例中，稳定同位素标记的内标物为
13
c3‑
15
n2‑
烯啶虫胺，
13
c4‑
15
n
‑
噻虫嗪，d4‑
吡虫啉，
13
c6‑
啶虫脒，
13
c6‑
噻虫啉，
13
c4‑
15
n
‑
噻虫胺，
18
o
‑
15
n
‑
氟啶虫酰胺，d4‑
n
‑
去甲基噻虫嗪，
13
c6‑
噻虫啉酰胺，d4‑
氯噻啉，
13
c2‑
15
n
‑
去甲基啶虫脒，
13
c6‑6‑
氯烟酸，d3‑
13
c2‑
15
n2‑
氟啶虫胺腈，
13
c
‑
15
n2‑
烯烃吡虫啉，
13
c
‑
15
n2‑5‑
羟基吡虫啉的混合物。即该稳定同位素标记的内标物由上述15种物质组成。
51.在一些实施例中，向脑脊液中加入稳定同位素标记的内标物后再与甲酸水溶液混合得到混合液具体为：向250～300μl的脑脊液中加入30～45ng的15种稳定同位素标记的内标物再与1～2ml体积浓度为1～3％的甲酸水溶液混合得到混合液。
52.需要说明的是，在实际检测过程中，内标物中每种具体物质的加入量均为2.5ng。
53.在一些实施例中，将混合液通过固相萃取小柱，然后使用甲醇洗脱，再将洗脱液使用甲醇水溶液进行复溶具体为：
54.将甲醇、氢氧化铵混合后，得到活化液，再利用活化液对固相萃取小柱进行活化；
55.用水淋洗活化后的固相萃取小柱，然后再将混合液通过固相萃取小柱；
56.将甲醇、甲酸、水混合后冲洗固相萃取小柱，负压干燥后，使用甲醇洗脱，将洗脱液氮气吹干，再用甲醇水溶液进行复溶。
57.在一些实施例中，甲醇与氢氧化铵的体积比为(15～20):1；其中，所用的氢氧化铵的体积浓度为28～30％；甲醇、甲酸、水的体积比为(4.5～5.5):(0.5～1.5):(42～46)。
58.本发明的脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，采用高效、重复性好的固相萃取方法结合高效液相色谱三重四级杆串联质谱技术测定脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢物，利用同位素标记物方法，实现对样品中新烟碱类杀虫剂及其代谢物定性、定量测定，检测方法灵敏度高，数据可靠；本发明的检测方法，对样品的前处理过程快速简便，可实现批量化处理，工作效率高；本发明的检测方法可以对9种新烟碱类杀虫剂及其6种代谢产物进行同步测定，大大提高了检测效率。
59.具体的，所用的固相萃取小柱为bond elut plexa 3cc,60mg(agilent,ma,usa)。
60.以下进一步以具体实施例说明本技术的脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法。
61.以下实施例中使用的液相仪器为日本岛津公司1290infinity ii超高效液相色谱系统，质谱仪器为美国absciex公司6500型号的电喷雾三重四极杆质谱仪，色谱柱选用waters acquity beh c18高效液相色谱柱，其长度为100mm，内径为2.1mm，填料颗粒直径为1.7μm，固相萃取小柱为bond elut plexa 3cc,60mg(agilent,ma,usa)。
62.实施例1
63.本技术实施例提供了一种脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，包括以下步骤：
64.s1、脑脊液取样后应保存于
‑
80℃冰箱中；
65.s2、在250μl脑脊液样品中加入稳定同位素标记的内标物并与1.5ml体积浓度为2％的甲酸水溶液混合得到混合液；
66.s3、将体积比为19：1的甲醇、氢氧化铵溶液(体积浓度30％)混合得到活化液；将3ml的活化液活化固相萃取小柱，然后使用水淋洗固相萃取小柱，再将混合液通过固相萃取小柱；使用2ml体积比为5:1:44甲醇、甲酸、水的混合溶液冲洗固相萃取小柱，负压干燥1min，用3ml甲醇洗脱目标物，将洗脱液用氮气吹干，再用250μl体积比为1：3的甲醇、水组成的溶液进行复溶；
67.s4、对复溶后的溶液进行高效液相三重四级杆串联质谱法检测，具体为：
68.采用正负离子模式收集数据，串联质谱条件采用电喷雾电离，正离子模式(esi )检测12种新烟碱物质，正离子模式检测条件为：碰撞气10psi，气帘气35psi，离子喷雾电压4000v，离子源温度650℃，离子源气体1和2均为70psi；负离子模式(esi
‑
)检测3种新烟碱物质，负离子模式检测条件为：碰撞气8psi，气帘气30psi，离子喷雾电压
‑
4500v，离子源温度600℃，离子源气体1和2分别为70psi和50psi；
69.进样量为3μl，15种化合物的梯度洗脱程序如下：
70.时刻0min：采用体积比为5:95的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
71.时刻0.6min：采用体积比为5:95的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
72.时刻4min：采用体积比为99:1的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
73.时刻5min：采用体积比为99:1的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
74.时刻5.5min：采用体积比为5:95的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min；
75.时刻6.5min：采用体积比为5:95的乙腈和甲酸水溶液组成的混合液做流动相，流速为0.35ml/min。
76.其中，流动相中甲酸水溶液的体积浓度为0.005％；稳定同位素标记的内标物为
13
c3‑
15
n2‑
烯啶虫胺，
13
c4‑
15
n
‑
噻虫嗪，d4‑
吡虫啉，
13
c6‑
啶虫脒，
13
c6‑
噻虫啉，
13
c4‑
15
n
‑
噻虫胺，
18
o
‑
15
n
‑
氟啶虫酰胺，d4‑
n
‑
去甲基噻虫嗪，
13
c6‑
噻虫啉酰胺，d4‑
氯噻啉，
13
c2‑
15
n
‑
去甲基啶虫脒，
13
c6‑6‑
氯烟酸，d3‑
13
c2‑
15
n2‑
氟啶虫胺腈，
13
c
‑
15
n2‑
烯烃吡虫啉，
13
c
‑
15
n2‑5‑
羟基吡虫啉组成的混合物，其中内标物中每种组分的加入量均为2.5ng。
77.实施例1中的脑脊液中新烟碱类杀虫剂及其代谢产物的检测方法，检测的化合物中英文名称及其简写及质谱精确质量数如下表1中所示。
78.表1
‑
不同化合物的中英文名称及其简写及质谱精确质量数
79.中文名英文名简称q1/q3(m/z)啶虫脒acetamipridace222.8/126去甲基啶虫脒n
‑
desmethyl
‑
acetamipridn
‑
dm
‑
ace209/126吡虫啉imidaclopridimi256/2095
‑
羟基吡虫啉5
‑
hydroxy
‑
imidacloprid5
‑
oh
‑
imi272/225烯烃吡虫啉olefin
‑
imidaclpridof
‑
imi251.97/205噻虫嗪thiamethoxamthx291.8/211.1n
‑
去甲基噻虫嗪n
‑
desmethyl thiamethoxamn
‑
dmt278/132噻虫啉thiaclopridthi253/126噻虫啉酰胺thiacloprid
‑
amideta271.1/126.1烯啶虫胺nitenpyramnit271.1/126噻虫胺clothianidinclo250/169.1氟啶虫酰胺flonicamidflo230/203氯噻啉imidaclothizimz262/181氟啶虫胺腈sulfoxaflorsuf275.9/2136
‑
氯烟酸6
‑
chloronicotinic acid6
‑
cn155.9/111.9
80.按照实施例1中的检测方法，采用正离子模式采集数据的12种新烟碱类化合物的色谱图，如图1所示。采用负离子模式采集数据的3种新烟碱类化合物的色谱图，如图2所示。
81.图1和图2是18种新烟碱杀虫剂及其代谢产物的正负离子模式色谱图。图1中呋虫胺(din)的保留时间为2.57min，呋虫胺(din)的2种降解产物din
‑
u和din
‑
g的保留时间为2.65min、2.57min；nit的保留时间为2.9min，thx保留时间为3.13min，5
‑
oh
‑
imi的保留时间为3.16min，flo的保留时间为3.20min，ta的保留时间为3.24min，n
‑
dm
‑
ace的保留时间为3.28min，clo的保留时间为3.29min，imi的保留时间为3.36min，ace的保留时间为3.42min，imz的保留时间为3.42min，n
‑
dmt的保留时间为3.44min，thi的保留时间为3.58min。图2中of
‑
imi的保留时间为3.11min，6
‑
cn的保留时间为3.24min，suf的保留时间为3.63min。但基
于呋虫胺(din)及其2种降解产物控回收率不在80
‑
120％之间，因此该方法排除呋虫胺及其2种降解产物的检测。质控合格的15种烟碱杀虫剂及其代谢产物色谱峰的保留时间与同位素标准品保留时间基本一致，相差不超过
±
2％，使用质谱多反应检测技术，有针对地选择数据进行质谱信号采集、碰撞诱导，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰。采用本发明方法对脑脊液种新烟碱检测的结果准确可靠、精确度高。
82.表2为采用实施例1中的检测方法，不同化合物的加标回收率和相对标准偏差。具体的，于脑脊液样本中加标3个浓度梯度，分别为1ng/ml，10ng/ml和20ng/ml，加标物质为本技术中所有15种新烟碱及其代谢产物的外标物质。
83.表2
‑
不同化合物的加标回收率和相对标准偏差
[0084][0085][0086]
由表2数据可证明，采用本发明的检测方法，对脑脊液中15种新烟碱及其代谢产物的加标回收率可控制在80～120％范围内，质控基质为人体脑脊液，证明本方法用于检测脑脊液中15种新烟碱及其代谢产物的准确度高，数据可靠。
[0087]
上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。