一种紫叶丹胶囊的检测方法与流程

：
1.本发明涉及一种中药成药的检测方法，特别涉及一种紫叶丹胶囊的检测方法，所述方法采用高效液相色谱法。


背景技术：

2.紫叶丹胶囊，为一种已经上市的中成药，配方为：叶下珠2100g，云芝800g，丹参200g，紫草200g，具有清肝解毒、活血化瘀之功效。用于慢性乙型病毒性肝炎辨证属湿热内蕴兼气虚血瘀型者。症见：脘腹胀满、胁肋疼痛、食欲不振、乏力口苦等。
3.原标准中各指标成分含量测定条件
[0004][0005]
现有检测方法操作复杂，不同组分需要分别测定，检测时间过长，在一定程度上延长了生产时间，增加每批生产时间及成本。
[0006]
本发明为此提供一种新的检测方法，可以同时快速、准确的测定紫叶丹胶囊中三种指标成分丹参酮ⅱa、柯里拉京、丹酚酸b的含量。


技术实现要素：

[0007]
本发明提供一种紫叶丹胶囊的检测方法，所述方法，包括以下步骤：
[0008]
步骤1，标准溶液的配制：
[0009]
取丹参酮ⅱa对照品适量，精密称定，加甲醇制成丹参酮ⅱa溶液；
[0010]
步骤2，供试品溶液的配制：
[0011]
取胶囊内容物，加入75％的甲醇提取，滤过，取续滤液；
[0012]
步骤3，测定：
[0013]
将标准溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算紫叶丹胶囊中丹参酮ⅱa、柯里拉京、丹酚酸b的含量。
[0014]
优选的，本发明的方法，步骤如下：
[0015]
步骤1，对照品溶液的制备取丹参酮ⅱa对照品适量，精密称定，加甲醇制成标准品
母液，然后加75％的甲醇稀释成每1ml含丹参酮ⅱa 0.008
‑
0.01mg的溶液，即得。
[0016]
步骤2，供试品溶液的制备取胶囊内容物，0.4
‑
0.6g，加入75％的甲醇溶解，称定重量，滤过，取续滤液。
[0017]
步骤3，测定法吸取对照品溶液与供试品溶液各5
‑
20μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图中的峰面积，计算丹参酮ⅱa、柯里拉京、丹酚酸b的含量。
[0018]
最优选的，本发明的方法，步骤如下：
[0019]
对照品溶液的制备取丹参酮ⅱa对照品适量，精密称定，加甲醇制成标准品母液，然后加75％的甲醇稀释成每1ml含丹参酮ⅱa 0.009mg的溶液，即得；
[0020]
供试品溶液的制备取装量差异项下的本品内容物，研细，混匀，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％的甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用75％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0021]
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，以丹参酮ⅱa对照品的峰面积为对照，分别计算丹参酮ⅱa、柯里拉京、丹酚酸b的含量。
[0022]
上述方法中的高效液相色谱条件如下：
[0023]
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相a，以0.3％甲酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为254nm。理论板数按丹参酮ⅱa峰计算应不低于3000。
[0024][0025][0026]
其中，根据色谱图中的峰面积，计算丹参酮ⅱa，柯里拉京、丹酚酸b的含量。
[0027]
计算方法如下：
[0028][0029]
[0030][0031]
本发明的检测方法，是经过筛选获得的，筛选过程如下：
[0032]
1仪器与试药
[0033]
startorius bsa224s电子天平(万分之一)，tp
‑
215d电子天平(十万分之一)，agilent 1260hplc；，甲醇为色谱纯，水为超纯水。
[0034]
2色谱条件
[0035]
色谱柱：kromasil c18色谱柱(4.6
×
250mm，5μm)，流速：1.0ml/min，检测波长：254nm
[0036]
2.1流动相的选择
[0037]
参考国家食品药品监督管理局标准紫叶丹胶囊ybz00532011中样品的制备方法，取本品内容物，研细，取约0.5g，和阴性样品(除丹参以外的相同处方量的其他各味药材，模拟工艺制成的样品)，同样制备供试品和阴性样品溶液，用甲醇
‑
0.3％甲酸作为流动相进样分析，所得液相色谱图中的柯里拉京，丹酚酸b与流动相丹参酮ⅱa峰能达到基线分离。
[0038]
结论：(1)在此流动相条件下，柯里拉京、丹酚酸b与丹参酮ⅱa峰均可基线分离；
[0039]
(2)在确定的流动相系统下，阴性样品与空白溶剂在柯里拉京、丹酚酸b与丹参酮ⅱa出峰位置无干扰。
[0040]
2.2测定波长的选择
[0041]
取浓度为0.06654mg/ml的柯里拉京，0.13369mg/ml的丹酚酸b，0.01731mg/ml的丹参酮ⅱa对照品溶液，用甲醇
‑
0.3％甲酸的流动相梯度洗脱，在200nm～400nm范围内进行波长扫描。对照品和样品都在254nm波长处有稳定吸收，综合3个对照品的色谱吸收，故选择254nm做为测定波长。
[0042]
3标准溶液的配制
[0043]
取丹参酮ⅱa对照品适量，精密称定，加甲醇制成标准品母液，再加75％的甲醇(体积比为75％的甲醇水溶液)制成每1ml含0.009mg的溶液，即得。
[0044]
4供试品溶液的配制
[0045]
取装量差异项下的本品内容物，研细，混匀，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％的甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用75％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0046]
5提取溶剂的选择
[0047]
参考国家食品药品监督管理局标准紫叶丹胶囊ybz00532011中样品的制备方法，含量测定的提取溶剂分别是50％甲醇和75％的甲醇，因此分别采用50％甲醇、75％的甲醇、甲醇作为提取溶剂，考察提取效果。取本品内容物，研细，混匀，取约0.5g，6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，
①
其中两份精密加入50％甲醇；
②
两份精密加入75％的甲醇；
③
两份精密加入甲醇，6份分别称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，测定，结果见表1。
[0048]
表1三种溶剂提取所得结果
[0049][0050][0051]
结论：由上述结果可知，75％的甲醇与50％甲醇提取柯里拉京、丹酚酸b接近，明显高于甲醇提取；但50％甲醇提取丹参酮iia含量很低，因此选择75％的甲醇作为提取溶剂。
[0052]
6提取溶剂用量的考察
[0053]
取本品内容物，研细，混匀，取约0.5g，6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，
①
其中两份精密加入75％的甲醇25ml；
②
两份精密加入75％的甲醇50ml；
③
两份精密加入75％的甲醇100ml，6份分别称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用75％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，测定，即得。结果见表2。
[0054]
表2溶剂用量的考察结果
[0055][0056]
结论：由上述结果可知，甲醇50ml已基本提取完全，因此采取加入50ml 75％的甲醇超声提取。
[0057]
7稳定性试验
[0058]
取对照品溶液，按上述色谱条件每隔一定时间测定其峰面积，每次进样10μl，考察对照品溶液在室温放置下的稳定性，计算相对标准偏差，结果见表3。
[0059]
表3稳定性试验结果
[0060]
[0061][0062]
结果表明，柯里拉京对照品、丹酚酸b对照品、丹参酮ⅱa对照品室温放置24小时内稳定。
[0063]
8精密度试验
[0064]
精密吸取混合对照品溶液，连续进样6次，每次10μl，测定峰面积，结果见表4。
[0065]
表4精密度试验结果
[0066][0067]
结果表明，本色谱条件下的仪器精密度良好。
[0068]
9重复性试验
[0069]
精密称取胶囊内容物(批号：210101)6份，按上述拟定的方法制成供试品溶液，对6份样品进行含量测定，进样量10μl，结果见表5。
[0070]
表5紫叶丹胶囊重复性试验结果
[0071]
[0072][0073]
结果表明，本方法三种成分的rsd均小于3％，重现性良好。
[0074]
10加样回收率试验
[0075]
取已知柯里拉京含量、丹酚酸b含量、丹参酮ⅱa含量的胶囊(批号：210101)6份，分别精密加入一定量的柯里拉京含量、丹酚酸b含量、丹参酮ⅱa对照品，按上述拟定的方法制成供试品溶液，对6份样品进行含量测定，进样量10μl，计算回收率，结果见表6
‑
8。
[0076][0077][0078][0079]
表6柯里拉京回收率试验结果
[0080][0081]
结果表明，本法的回收率在99.69～100.55％，平均为100.13％，rsd为0.30％，符合相关要求。
[0082]
表7丹酚酸b回收率试验结果
[0083][0084]
结果表明，本法的回收率在98.39～100.84％，平均为99.27％，rsd为0.95％，符合相关要求。
[0085]
表8丹参酮ⅱa回收率试验结果
[0086][0087]
结果表明，本法的回收率在98.54～100.77％，平均为99.59％，rsd为0.73％，符合相关要求。
[0088]
11相对校正因子计算
[0089]
照含量测定项下的方法，分别考察不同品牌的c18色谱柱(kromasil c18、welch c18、dikma c18、安捷伦c18)及不同品牌液相(安捷伦、岛津)所测得的线性回归方程。记录各条件下色谱图。结果见表9。
[0090]
表9各待测组分在不同仪器和不同色谱柱上的相对校正因子
[0091][0092]
结论：柯里拉京、丹酚酸b相对校正因子差异较小，rsd分别为2.57％、4.57％，该方法符合不同仪器和色谱柱，耐用性强。可以得出，一测多评法可用作检测紫叶丹胶囊中柯里拉京、丹酚酸b、丹参酮ⅱa含量，方法简便、快捷、准确、可靠。
[0093]
12待测成分色谱峰的定性
[0094]
照含量测定项下的方法，分别考察不同厂家、不同型号的c18色谱柱。结果见10。
[0095]
表10各待测组分在不同仪器和不同色谱柱上的保留时间差
[0096][0097][0098]
上述结果表明：柯里拉京、丹酚酸b保留时间差差异较小，rsd分别为1.20％、2.62％，该方法符合不同仪器和色谱柱，耐用性强。可以得出，三种成分相对位置比较稳定。
因此，在丹参酮ⅱa保留时间的前提下，可以准确定位柯里拉京、丹酚酸b色谱峰。
[0099]
13紫叶丹胶囊一测多评法与常规外标法测定结果比较研究
[0100]
取样品，按上述方法测定，计算含量。样品测定结果见表11。
[0101]
表11一测多评法与常规外标法测定紫叶丹胶囊中成分的含量
[0102][0103]
本发明在上述检测方法的基础上，进一步研究了指纹图谱测定方法，为此，本发明进一步提供紫叶丹胶囊指纹图谱测定方法，所述方法，步骤如下：
[0104]
步骤1，供试品溶液制备：
[0105]
取紫叶丹胶囊内容物，0.4
‑
0.6g，加入75％的甲醇使有效成份溶解，过滤，取续滤液，
[0106]
步骤2，色谱图的测定：
[0107]
取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图。
[0108]
步骤3，比对：
[0109]
将步骤2得到的色谱图和标准对照指纹图谱进行比对，若相似则判断供试品为合格产品。
[0110]
优选的，所述方法，步骤如下：
[0111]
步骤1，供试品溶液制备：
[0112]
取紫叶丹胶囊内容物，研细，称取0.5g，置锥形瓶中，精密量取75％的甲醇50ml，超声处理30min，过滤，取续滤液，备用
[0113]
步骤2，色谱图的测定：
[0114]
取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，检测波长：254nm，记录色谱图；步骤3，比对：
[0115]
将步骤2得到的色谱图和标准对照指纹图谱进行比对，若相似则判断供试品为合格产品。
[0116]
其中，指纹图谱测定方法的高效液相色谱条件如下：
[0117]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲
醇为流动相a，以0.3％磷酸水为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱。(色谱柱：welch 100
‑5‑
c18 4.6
×
250mm 5μm)，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml。检测波长：254nm，进样：10μl，
[0118]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)02080103070154060305050359010501000512080602080
[0119]
紫叶丹胶囊指纹图谱测定方法中，所述标准对照指纹图谱，建立方法如下：
[0120]
步骤1，
[0121]
取多批次合格的紫叶丹胶囊内容物，研细，称取0.4
‑
0.6g，加入75％的甲醇溶解有效成分，过滤，取续滤液，备用；
[0122]
优选的，取5
‑
50批次合格的紫叶丹胶囊内容物，研细，称取0.4
‑
0.6g，置锥形瓶中，精密量取75％的甲醇50ml，超声处理30min，过滤，取续滤液，备用；
[0123]
步骤2，
[0124]
将多批次步骤1的续滤液分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
[0125]
步骤3，
[0126]
对得到的多批次色谱图，选择稳定性好，吸收强，特征明显的色谱峰作为共有峰进行标定，确定了15个共有峰，经计算机拟合，得到标准对照指纹图谱。其中，色谱条件如下：
[0127]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相a，以0.3％磷酸水为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱。(色谱柱：welch 100
‑5‑
c18 4.6
×
250mm 5μm)，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml。检测波长：254nm，进样量：10μl，
[0128]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)02080103070154060305050359010501000512080602080
[0129]
本发明考察了建立的方法用于指纹图谱测定的精密度，结果如下：
[0130]
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)进行相似度评价，结果是：指纹图相似度计算结果均为1.000，表明该方法准确可靠。
[0131]
本发明考察了建立的方法的重复性，结果如下：
[0132]
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)进行相似度评价，结果是：指纹图谱相似度计算结果均大于0.997，表明该方法重复性良好。
[0133]
本发明考察了供试品溶液的稳定性，结果如下：
[0134]
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)进行相似度评价，结果是：指纹图谱相似度计算结果均大于0.999，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
附图说明：
[0135]
图1：紫叶丹胶囊指纹图谱的检测结果
[0136]
图2：紫叶丹胶囊精密度指纹图谱
[0137]
图3：紫叶丹胶囊重复性试验指纹图谱
[0138]
图4：紫叶丹胶囊稳定性试验指纹图谱
[0139]
图5：7批紫叶丹胶囊样品的指纹图谱
具体实施方式：
[0140]
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制：
[0141]
实施例1：紫叶丹胶囊hplc指纹图谱检测方法
[0142]
1、仪器及材料：
[0143]
紫叶丹胶囊(北京汉典制药有限公司，批号：210101)
[0144]
甲醇(色谱纯，honeywell，lot no：uc3g1h)
[0145]
磷酸(ar，天津福晨化学试剂有限公司，批号：20180420)
[0146]
电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，bsa224s)
[0147]
超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，kq500de)
[0148]
高效液相色谱仪(agilent 1260infinity，hplc
‑
2，vwd)
[0149]
色谱柱(welch 100
‑5‑
c 18，250
×
4.6mm，5μm)
[0150]
2、实验过程：
[0151]
供试品溶液制备：取210101批紫叶丹胶囊内容物，研细，称取0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密量取75％的甲醇50ml，超声处理30min，过滤，取续滤液，备用。
[0152]
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相a，以0.3％磷酸水为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱。(色谱柱：welch 100
‑5‑
c18 4.6
×
250mm 5μm)，柱温为30℃；检测波长：254nm；流速为每分钟1.0ml。
[0153][0154][0155]
3、测定：进样量：10μl，照高效液相色谱法测定，记录色谱图，如图1。
[0156]
4、比对：
[0157]
将得到的色谱图图1和标准对照指纹图谱图5进行比对，两者相似度为95％，结论为：供试品为合格产品。
[0158]
实施例2：
[0159]
1精密度试验
[0160]
取同一批号紫叶丹胶囊(批号：210101)的供试品，按照拟定的提取方法制备样品溶液，取10μl注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，经指纹图谱相似度软件计算，测得的色谱图谱相似度计算结果均为1.000(以s1为参照，图2所示)，表明该方法准确可靠。
[0161]
2重复性试验
[0162]
同一批号紫叶丹胶囊(批号：210101)的供试品6份，按照拟定的提取方法制备样品溶液，各取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，经指纹图谱相似度软件计算，测得的色谱图谱相似度计算结果均大于0.997(以s1为参照，图3所示)，表明测定方法的重现性好。
[0163]
3稳定性试验
[0164]
同一批号紫叶丹胶囊(批号：210101)的供试品，分别在0h、3h、6h、9h、12h、24h共6个时间点进行检测，6次测定结果经指纹图谱相似度软件计算，测得的色谱指纹图谱的相似度满足相似度不小于0.999(如图4所示)；表明在24h内供试品溶液的成分是稳定的。
[0165]
实施例3：紫叶丹胶囊标准指纹图谱建立方法
[0166]
1、仪器及材料：
[0167]
紫叶丹胶囊(北京汉典制药有限公司，批号：190401、190402、190701、190901、191201、200401、210101)
[0168]
甲醇(色谱纯，honeywell，lot no：uc3g1h)
[0169]
磷酸(ar，天津福晨化学试剂有限公司，批号：20180420)
[0170]
电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，bsa224s)
[0171]
超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，kq500de)
[0172]
高效液相色谱仪(agilent 1260infinity，hplc
‑
2，vwd)
[0173]
色谱柱(welch 100
‑5‑
c 18，250
×
4.6mm，5μm)
[0174]
2、实验过程：
[0175]
供试品溶液制备：取7批紫叶丹胶囊内容物，研细，称取0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密量取75％的甲醇50ml，超声处理30min，过滤，取续滤液，备用。
[0176] 批号称样量1(g)称样量2(g)s11904010.52270.5183s21904020.51620.5178s31907010.51750.5153s41909010.53500.5276s51912010.52580.5214s62004010.53630.5319s72101010.52060.5188
[0177]
色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相a，以0.3％磷酸水为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱。(色谱柱：welch 100
‑5‑
c18 4.6
×
250mm 5μm)，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml。
[0178]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)02080103070154060305050359010501000512080602080
[0179]
检测波长：254nm
[0180]
进样量：10μl，记录色谱图。
[0181]
3、结果：
[0182]
将得到的s1
‑
s7图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)进行相似度评价，以s1图谱作为参照，采用平均数法，时间窗宽度为0.1min，经多点校正后mark峰谱匹配，生成对照指纹图谱，选择稳定性好，吸收强，特征明显的色谱峰作为共有峰进行标定，确定了15个共有峰，7批紫叶丹胶囊指纹图谱见图5.
[0183]
实施例4：一测多评方法
[0184]
步骤如下：
[0185]
步骤1，标准溶液的配制：取丹参酮ⅱa对照品适量，加甲醇制成标准品母液，再加75％的甲醇制成每1ml含0.009mg的标准溶液，即得；
[0186]
步骤2，供试品溶液的配制：取胶囊内容物，研细，混匀，取0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入75％的甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用75％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0187]
步骤3，测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱
仪，测定，以丹参酮ⅱa对照品的峰面积为对照，分别计算丹参酮ⅱa、柯里拉京、丹酚酸b的含量；
[0188]
其中，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：kromasil c18 4.6
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250mm 5μm)；以甲醇为流动相a，以0.3％甲酸水溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml，检测波长：254nm，进样：10μl
[0189][0190][0191]
实施例5：
[0192]
实施例1，实施例3或实施例4中的对照品溶液的制备，方法如下：丹参酮ⅱa对照品,加入75％的甲醇制成每1ml含丹参酮ⅱa 0.008或0.01mg的溶液。
[0193]
供试品溶液的制备，方法如下：取胶囊内容物0.4或0.6g，加入75％的甲醇溶解，称定重量，滤过，续滤液为供试品溶液。
[0194]
测定法，方法如下：吸取对照品溶液与供试品溶液各5或20μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图。
[0195]
其他操作步骤不变。