一种抑制酶促褐变的组合物及其方法与流程

1.本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种抑制酶促褐变的组合物及其方法。


背景技术：

2.牛油果(学名：persea americana mill)，也称作为鳄梨，另外也叫做油梨、酪梨等，是一种很受大众喜爱的热带水果。牛油果果肉营养价值很高，富含丰富的脂肪、矿物质、多种维生素和其他营养物质等。但牛油果采摘后生理代谢旺盛，在储藏及加工的过程中，很容易发生褐变及变质，极大的降低了牛油果的感官品质和营养价值。
3.许多研究表明，果实中的多酚氧化酶(polyphenol oxidase，ppo) 是果实发生酶促褐变、导致果实腐败变质的主要成分，并对果蔬的储运及其加工副产品的色泽、品质及风味等产生不良影响。ppo的活性受温度、ph值、底物浓度及作用时间等诸多因素影响，并且不同植物组织中各种因素对其ppo活性的影响各不相同。因此，对不同理化因素及主要酶促褐变抑制方法对牛油果中ppo活性的影响进行研究，对牛油果采摘后储藏、保鲜、运输以及牛油果副产品的生产加工具有重要的参考及应用价值。
4.目前，在对果蔬酶促褐变抑制剂的研究中，化学抑制剂抗坏血酸、肉桂酸、l
‑
半胱氨酸及柠檬酸用于防褐变食品添加剂的使用较为常见。不同种类的抑制剂对不同果蔬中ppo活性的抑制具有一定的种属特异性，且不同抑制剂对ppo活性的抑制机理各不相同。如抗坏血酸能与果蔬中的酚类底物邻苯二酚氧化产生的邻苯二醌反应，生成邻二酸和脱氢抗坏血酸，从而阻止醌类中间产物进一步聚合形成黑色素，进而起到褐变抑制作用。肉桂酸是果蔬中天然存在的有机酸，与 ppo的酚类底物类似，可竞争性与果蔬中的ppo结合，从而一定程度上减少酚类底物与ppo反应生成褐变产物。柠檬酸的褐变抑制机理与抗坏血酸相似，可以清除酶促褐变中产生酚类和醌类物质，进而有效地降低褐变程度。l
‑
半胱氨酸含有的特殊基团可以结合ppo活性中心的铜，或者取代组氨酸残基，通过对ppo活性中心的结构性修饰使酶活性降低，从而使褐变程度降低。
5.近年来，超声处理作为一种非热加工手段已经在食品行业中广泛应用。朱传合等研究表明，超声处理对酶促褐变底物、产物并没有影响，且在并没有改变ppo的最适温度、ph值的条件下能够显著抑制 ppo的酶活力。赵跃萍等人分别研究证明，合适的超声处理可以改善西芹、新鲜豆角、高鸭梨、樱桃番茄、“大久保”桃、“八月脆”桃、鲜切芹菜、草莓、葡萄、橙汁、鲜切苹果、马铃薯等产品的感官品质，控制相关产品的酶促褐变。
6.为了控制牛油果汁在生产实践及保藏运输等过程中发生酶促褐变，拟在单因素试验的基础上，通过正交试验开发出一种抑制牛油果酶促褐变的复合抑制方法，有助于最大程度降低牛油果汁在加工储运过程中的酶促褐变，更好地保持产品的感官品质，减少营养流失，延长货架期。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种抑制牛油果汁酶促褐变的方法，以钝化酶活性，有效
抑制牛油果汁在生产、储运过程中发生酶促褐变。
8.在一个实施方案中，本发明涉及一种牛油果汁酶促褐变的复合抑制方法，具体包括以下步骤：
9.1)将牛油果去皮切块，榨汁并进行渣汁分离，收集牛油果汁；
10.2)向牛油果汁中加入质量百分比0.075％
‑
0.125％抗坏血酸、质量百分比0.03％
‑
0.045％l
‑
半胱氨酸、ph 3.0
‑
8.0的磷酸盐缓冲液，并以45w/cm2的超声波功率密度超声处理35
‑
45min；停止超声波处理后取出牛油果汁，置于4℃环境下保存。
11.优选的，所述步骤2)所述的抗坏血酸的质量百分比为0.1％；所述的l
‑
半胱氨酸的质量百分比为0.0375％；所述的磷酸盐缓冲液的 ph为7.0；所述的超声波处理时间为40min。
12.在一个实施方案中，本发明涉及一种牛油果汁，其包含质量百分比0.075％
‑
0.125％抗坏血酸、质量百分比0.03％
‑
0.045％l
‑
半胱氨酸、 ph 3.0
‑
8.0的磷酸盐缓冲液。
13.优先的，所述牛油果汁中抗坏血酸的质量百分比为0.1％；l
‑
半胱氨酸的质量百分比为0.0375％。
14.在一个实施方案中，本发明涉及一种牛油果汁，其由牛油果汁，质量百分比为0.1％的抗坏血酸、质量百分比为0.0375％的l
‑
半胱氨酸，以及ph 7.0的磷酸盐缓冲液组成。
15.在一个实施方案中，本发明涉及牛油果汁酶促褐变的复合抑制方法在制备牛油果汁中的用途。
16.本发明采用新型的非热加工方法，即超声波技术协同不同抑制因素来抑制牛油果汁酶促褐变。该技术有以下优点：
17.1)本发明可以在相对较低的温度下钝化酶活性，抑制酶促褐变，并且避免了热加工处理对牛油果汁理化性质的影响，从而更好的保持牛油果汁的营养成分和感官品质。
18.2)在该技术中，超声波和抗坏血酸、l
‑
半胱氨酸协同作用，一方面，超声波产生的机械效应/温热效应/理化效应可以有效的钝化褐变相关酶的酶活性；另一方面，抗坏血酸和l
‑
半胱氨酸在超声波的促溶作用下，更多的溶解于牛油果汁中，更加充分地包埋褐变相关底物和褐变色素产物，从而更加有效地防止褐变发生，降低褐变程度。
19.3)本发明还可以推广应用于其他果蔬汁的褐变防控。
附图说明
[0020][0021]
图1是牛油果汁提取液中ppo最适检测波长的结果图；
[0022]
图2是牛油果汁提取液中ppo最适反应温度的结果图；
[0023]
图3是牛油果汁提取液中ppo在不同ph条件下的活性；
[0024]
图4是不同浓度抗坏血酸对牛油果汁中ppo活性的影响结果图；
[0025]
图5是不同浓度l
‑
半胱氨酸对牛油果汁中ppo活性的影响结果图；
[0026]
图6是不同超声时长对牛油果汁中ppo活性的影响结果图；
[0027]
图7本发明实验设计流程图
具体实施方式
[0028]
为了更好的理解本发明的技术方案，以下通过具体实施例对本发明进行详细说明。
[0029]
实例1 ppo的提取
[0030]
1.1实验方法
[0031]
牛油果洗净去核，称取牛油果果肉100g，加入250ml ph 6.5的磷酸盐缓冲液，榨汁并进行渣汁分离，收集牛油果汁。放入高速冷冻离心机6000r/min离心15min，吸取上清液为粗酶液。
[0032]
实施例2 ppo最适检测波长的测定
[0033]
2.1实验方法
[0034]
吸取1ml粗酶液，2ml ph6.5的磷酸盐缓冲液以及1ml0.02mol/l邻苯二酚作为反应体系，其中对照体系为3ml ph6.5的磷酸盐缓冲液以及1ml粗酶液，将其放置于30℃恒温水浴锅中充分反应10min后，以对照体系为参比，将反应液置于紫外分光光度计中，在350～490nm的波长范围内每间隔10nm进行扫描，得到的最大吸收峰波长，即为最适波长。从表1中可以看出，ppo最适检测波长为 410nm。
[0035]
2.2实验结果
[0036]
表1 ppo最适检测波长
[0037]
波长(nm)350360370380390400410420吸光度值0.6650.7250.7600.8090.8560.8930.9000.875波长(nm)430440450460470480490 吸光度值0.8290.7650.6960.6080.5310.4580.400 [0038] 实施例3ppo最适反应温度的测定
[0039]
3.1实验方法
[0040]
吸取1ml粗酶液，3ml ph 6.5的磷酸盐缓冲液以及1ml 0.02mol/l邻苯二酚作为反应体系，其中对照体系为4ml ph 6.5的磷酸盐缓冲液以及1ml粗酶液，将其分别置于4℃、10℃、 20℃、25℃、30℃、40℃、50℃的温度下反应10min。以对照体系为参比，在410nm下测定反应体系的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，温度为横坐标，建立坐标系绘制相应的曲线，得到牛油果ppo最适反应温度。从表2中可以看出，ppo最适反应温度为 4℃。
[0041]
3.2实验结果
[0042]
表2 ppo最适反应温度
[0043]
温度(℃)41020253035404550吸光度值1.1050.6770.3240.3860.4530.5010.5310.6040.490
[0044]
实施例4 ppo最佳反应ph的测定
[0045]
4.1实验方法
[0046]
分别配制ph为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸盐缓冲液。吸取1ml粗酶液，3ml ph不同的磷酸盐缓冲液以及1ml 0.02mol/l邻苯二酚作为反应体系，其中对照体系为4ml 对应相同ph磷酸盐缓冲液以及1ml粗酶液。将其置于30℃恒温水浴中反应10min后，以对照体系为参比，在410nm下测定反应体系的吸光度值。以ph为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立坐标轴绘制相应的曲线，得到牛油果ppo最佳反应ph。从表3中可以看出，ppo最佳反
应ph为4.0。
[0047]
4.2实验结果
[0048]
表3 ppo最佳反应ph
[0049]
ph3.03.54.04.55.06.07.08.0吸光度值0.7111.2061.3521.2021.1220.8350.8750.826
[0050]
实施例5不同抑制剂对ppo活性的影响
[0051]
5.1实验方法
[0052]
吸取1ml粗酶液，依次加入1ml浓度都为0.1％的肉桂酸、柠檬酸、l
‑
半胱氨酸、抗坏血酸，加入2ml ph 6.5的磷酸盐缓冲液以及1ml 0.02mol/l邻苯二酚，其中对照体系为1ml粗酶液， 1ml相对应浓度的肉桂酸、柠檬酸、l
‑
半胱氨酸、抗坏血酸以及 3ml ph 6.5的磷酸盐缓冲液。将其置于30℃的恒温水浴中反应 10min。以对照体系为参比，在410nm下测定反应体系的吸光度值。对比不同抑制剂对ppo活性的抑制效果。从表4中可以看出，l
‑
半胱氨酸、抗坏血酸对于ppo活性的抑制效果明显优于肉桂酸、柠檬酸。
[0053]
5.2实验结果
[0054]
表4不同抑制剂对ppo活性的影响
[0055]
抑制剂l
‑
半胱氨酸抗坏血酸柠檬酸肉桂酸吸光度值0.3320.1700.6530.872
[0056]
实施例6不同抗坏血酸浓度对ppo活性的影响
[0057]
6.1实验方法
[0058]
吸取1ml粗酶液，加入1ml浓度依次为0.025％、0.0375％、 0.05％、0.1％、0.2％、0.3％的抗坏血酸，振荡摇匀，再加入2mlph 6.5的磷酸盐缓冲液以及1ml 0.02mol/l邻苯二酚作为反应体系，其中对照体系为1ml粗酶液，1ml相对应浓度的抗坏血酸以及3ml ph为6.5的磷酸盐缓冲液，将其置于30℃水浴中充分反应 10min。以对照体系为参比，在410nm下测定反应体系的吸光度值。以抗坏血酸的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制曲线，得到最佳的抗坏血酸抑制浓度。从表5中可以看出，0.1％
‑
0.3％的抗坏血酸抑制酶促褐变效果差别不大，0.3％的抗坏血酸对ppo活性抑制最强。
[0059]
6.2实验结果
[0060]
表5不同浓度抗坏血酸对ppo浓度的影响
[0061]
浓度(％)0.0250.03750.050.10.20.3吸光度值0.2980.6820.4240.1480.1670.047
[0062]
实施例7不同l
‑
半胱氨酸浓度对ppo活性的影响
[0063]
7.1实验方法
[0064]
吸取1ml粗酶液，加入1ml浓度依次为0.025％、0.0375％、 0.05％、0.1％、0.2％、0.3％的l
‑
半胱氨酸(加入少量盐酸以助溶解)，再加入2ml ph 6.5的磷酸盐缓冲液，1ml 0.02mol/l邻苯二酚为反应体系，其中对照体系为1ml粗酶液，相对应浓度的l
‑
半胱氨酸以及3ml磷酸盐缓冲液。将其置于30℃水浴中充分反应10min。以对照体系为参比，在410nm下测定反应体系的吸光度值。以l
‑
半胱氨酸的浓度为横坐标，ppo相对活性纵坐标绘制曲线，得到最佳的l
‑
半胱氨酸抑制浓度。从表6可以看出，0.0375％的l
‑
半胱氨酸对ppo活性抑制
最强。
[0065]
7.2实验结果
[0066]
表6不同浓度l
‑
半胱氨酸对ppo活性的影响
[0067]
浓度(％)00.0250.03750.050.10.20.3吸光度值0.4600.1270.0920.1240.0960.1250.127
[0068]
实施例8不同超声时长对ppo活性的影响
[0069]
8.1实验方法
[0070]
分别将粗酶液超声处理0min，10min，20min，30min， 40min，50min，60min。吸取1ml粗酶液，2ml ph 6.5的磷酸盐缓冲液以及1ml 0.02mol/l邻苯二酚作为反应体系，其中对照体系为1ml粗酶液，3ml ph 6.5的磷酸盐缓冲液。将其置于30℃的水浴锅内反应10min后，以对照体系为参比，在410nm下测定反应体系的吸光度值。以处理时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制曲线。从表7可以看出，50min的超声处理效果最优，40
‑
60min 的超声处理效果差异不明显。
[0071]
8.2实验结果
[0072]
表7不同超声处理时间对ppo活性的影响
[0073]
时间(min)0102030405060吸光度值1.0060.8420.8130.8030.7110.6930.700
[0074]
实施例9超声处理时间、ph、抗坏血酸、l
‑
半胱氨酸的正交实验分析
[0075]
9.1实验方法
[0076]
按照表8，将粗酶液超声处理不同的时间，吸取1ml粗酶液，2ml ph不同的磷酸盐缓冲液，1ml浓度不同的抗坏血酸， 1ml浓度不同的l
‑
半胱氨酸、1ml 0.02mol/l邻苯二酚为反应体系，其中对照体系为1ml粗酶液，3ml相对应ph的磷酸盐缓冲液，1ml相对应浓度的抗坏血酸，1ml相对应浓度的l
‑
半胱氨酸。将其置于30℃的恒温水浴锅内反应10分钟，以对照体系为参比，测定不同处理的样品在410nm下的吸光度值。
[0077]
表8正交实验参数设置
[0078][0079]
9.2正交实验结果
[0080]
正交实验结果如表9所示。
[0081]
表9正交实验结果
[0082][0083]
如表9所示，正交试验所得的优化方案为超声时间40min，ph 为7.0，抗坏血酸浓度为0.1％，l
‑
半胱氨酸的浓度为0.0375％。
[0084]
实施例10正交实验优化方案效果验证
[0085]
10.1实验方法
[0086]
(1)实验组
[0087]
吸取1ml粗酶液，2ml ph 7.0的磷酸盐缓冲液，1ml浓度为0.1％的抗坏血酸，1ml浓度为0.0375％的l
‑
半胱氨酸，超声处理40min 后，分别存放0
‑
4小时和1
‑
7天，再加入1ml 0.02mol/l邻苯二酚作为反应体系；以不加邻苯二酚、加入1mlph7.0的磷酸盐缓冲液的反应体系作为空白对照。将其置于30℃水浴中充分反应10min，以空白对照作参比，测定不同处理样品在410nm下的吸光度值。
[0088]
(2)对照组
[0089]
将未经超声处理的粗酶液分别存放0
‑
4小时和1
‑
7天，吸取1ml 粗酶液，加入4ml ph6.5的磷酸盐缓冲液以及1ml 0.02mol/l的邻苯二酚作为反应体系；加入5ml ph6.5的磷酸盐缓冲液作为空白对照。将其置于30℃水浴中充分反应10min，以空白对照作参比，测定不同处理样品在410nm下的吸光度值。
[0090]
10.2实验结果
[0091]
表10正交实验验证(存放0
‑
4小时)
[0092]
时间(min)306090120150180210240实验组吸光度0.0900.1170.0990.1510.0580.0850.0500.018对照组吸光度1.0861.3651.2841.4721.5651.3931.2231.397抑制率(％)91.7691.4792.3390.0096.2993.9095.9198.75
[0093] 表11正交实验验证(存放1
‑
7天)
[0094]
时间(d)1234567实验组吸光度0.0911.4161.0000.8060.9680.4610.470对照组吸光度14.526.228.222.825.014.115.6抑制率(％)99.3794.5996.4596.4696.1296.7296.99
[0095]
从表10、表11可以看出，本发明可以有效防止牛油果汁酶促褐变，改善牛油果汁的色泽品质，且与单一酶促褐变影响因素相比，复合抑制方法中的四种因素之间存在协同作用，即复合抑制方法对牛油果汁酶促褐变的抑制率显著高于单一影响因素对牛油果汁的褐变抑制率。
[0096]
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。