用于吸引和破坏特定生物元件的微流控芯片的制作方法

1.本技术涉及能够吸引和破坏特定生物元件的微流装置领域。更确切地，本技术涉及一种能够在体内(in vivo)吸引和破坏特定生物元件(例如原核或真核细胞)的微流控芯片。


背景技术：

2.在法国，每年确诊约400000例新增癌症病例，其中约150000例死亡。
3.根据癌症发生的组织不同，存在不同类型的癌症。以癌细胞的局部群集为特征的实体瘤与血细胞肿瘤不同，血细胞肿瘤通过癌细胞在骨髓或血液中的循环而扩散。血细胞肿瘤，也称为造血癌，是影响血液或淋巴器官的癌症，如白血病和淋巴瘤。
4.关于实体瘤，这种癌与腺癌不同，它是由上皮组织产生的癌症。肉瘤与实体瘤也有所不同，其为出现在所谓的支撑组织中的癌细胞，例如骨上的骨肉瘤、脂肪中的脂肪肉瘤和肌肉中的肌肉瘤。
5.在男性和女性中，实体癌占癌症总数的90％，其中前列腺癌、肺癌和结肠直肠癌为男性中的三种最常见癌症，乳腺癌、结肠直肠癌和肺癌为女性中的三种最常见癌症。尽管在1980到2012年间，男性的癌症死亡率每年降低了1.5％，女性的癌症死亡率每年降低了1％(归一化的比率)，但是仍然需要有效的解决方案来治疗和预防这些实体瘤及其并发症。
6.迄今为止，外科手术是实体瘤的主要治疗方式之一，涉及在可能的情况下切除整个肿瘤，同时可能还切除肿瘤周围的组织，称为切除边缘。当肿瘤为高度局限性肿瘤时，手术可以作为单一的治疗方法，特别是当肿瘤处于早期阶段时，但其通常也与诸如放射疗法(其也是一种局部治疗方法)和/或诸如化疗等医学治疗(其为潜在地作用于体内所有癌细胞的全身治疗方法)或其他治疗方法组合。
7.通过局部外科手术治疗实体瘤的优势是在可能的情况下能够去除整个肿瘤，并且保留未受癌细胞影响的器官和解剖结构。它还避免了放射疗法导致的副作用，诸如烧伤或放疗诱发型癌症的发生，以及化疗导致的副作用，诸如皮肤反应、恶心、呕吐、腹泻、肌肉疼痛、疲劳、脱发以及化疗诱发型癌症。
8.为了降低复发率，切除区域包括肿瘤周围的健康组织区域，该区域即为切除边缘。在这个阶段，必须考虑几种情况。在第一种情况下，原发性肿瘤的肿瘤细胞包括在切除区域中，并且会复发。在第二种情况下，一些肿瘤细胞位于切除区域之外，可能位于切除区域原位或距其一定距离处，因此可能在切除区域原位或距其一定距离处发生复发，从而形成转移，即，扩散至距受初始肿瘤影响的器官一定距离处的癌细胞的继发性集落，其是与实体瘤所位于的器官不同的器官中的所谓“转移”癌的来源。
9.因此，有必要在切除实体肿瘤之后尽可能地防止局部复发和转移癌的风险。
10.化疗可在局部外科手术切除肿瘤后使用，其被称为“辅助化疗”，用于防止复发和/或转移癌的形成。然而，如上所述，许多副作用与该药物治疗相关。在与化疗的使用相关的最显著的副作用之中，可特别地参考化疗诱发型癌症，从定义上看，这种癌症是用针对首次
恶性肿瘤的细胞毒药物治疗患者后产生的新肿瘤，该肿瘤由后者引起；还可以参考癌细胞对化疗产生耐药性的风险，这些问题均强烈地限制了消除所述细胞的可能性。
11.因此，到目前为止，还未找到有效消除实体瘤切除之后的剩余癌细胞，以预防和/或降低局部复发和/或发生转移癌的风险且无中短期药物副作用的有效解决方案。
12.为了回应这些需求，本发明提出了一种微流控芯片，其用于吸引和破坏特定的生物元件，特别是真核细胞，例如癌细胞。所述芯片特别适合植入人体内的实体瘤切除区域，以便在体内吸引和破坏剩余的癌细胞。
13.在现有技术中已经描述了在癌症治疗领域中使用的微流体装置。可特别地参考wo2018/089989a1，其描述了一种体外癌症治疗装置，该装置通过对诸如血液等生物流体进行特异于所靶向的癌细胞类型的电磁辐射，并且能够破坏该类型的癌细胞来治疗癌症。
14.还可参考文献us2018111124a1，其描述了一种微流体装置，该装置包括一个或多个微流体通道和一个或多个无线双极电极阵列，该电极阵列通过对生物样品施加40khz交变电场来实现高通量地捕获导电离子溶液中循环的肿瘤细胞。由此捕获的细胞可用于诊断癌症或评估癌症治疗的效果。
15.尚无现有技术文献描述或暗示过这样的微流控芯片：其用于在切除实体瘤之后，优选在体内吸引和破坏癌细胞，从而预防和/或降低局部复发和/或发生转移癌的风险。
16.更一般地，尚无现有技术文献描述或暗示过这样的微流控芯片，其用于优选在体内吸引和破坏特定的生物元件，所述微流控芯片包括：含有基质的贮存器，该基质包含能够吸引生物元件的化学引诱物化合物；至少一个微通道网络，该微通道网络将贮存器和芯片的外部环境连通；以及至少一个电极，该电极能够产生破坏所述生物元件的电场。


技术实现要素：

17.本发明涉及一种用于吸引和破坏特定生物元件的微流控芯片，所述芯片包括：
18.‑
贮存器(1)，其由包含能够吸引所述生物元件的化学引诱物化合物的基质组成；
19.‑
至少一个微通道网络(2)，其布置在所述贮存器(1)和所述芯片的外部环境(3)之间，并且允许所述化学引诱物化合物传递到所述环境，并允许存在于所述环境中的所述生物元件传递到所述贮存器(1)；
20.‑
至少一个电极(4)，其布置在所述贮存器(1)和所述微通道网络(2)之间或布置在与所述微通道网络(2)相同的位置处，所述电极(4)能够产生电场，使得所述生物元件在向所述贮存器(1)传递的过程中被破坏。
附图说明
21.图1是根据本发明的芯片的截面图。
22.图2示出了从上方观察到的芯片的上部(6)。
23.图3示出了从上方观察到的芯片的下部(5)。
24.图4示出了根据本发明的芯片底部的分解图。
25.图5示出了根据本发明的芯片顶部的分解图。
26.图6示出了根据本发明的芯片在5:0.5cm比例下的截面图。
27.图7示出了该芯片在5:1cm比例下的截面图。
28.图8是在微通道水平处，5x物镜下的倒置荧光显微图像，示出了在无梯度情况下的乳腺癌肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231)(14)。
29.图9是在微通道水平处，5x物镜下的倒置荧光显微图像，示出了乳腺癌肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231)(14)在胎牛血清梯度下被吸入芯片中，该胎牛血清梯度由芯片外部的1％胎牛血清和贮存器内的10μl纯胎牛血清产生。
30.图10是在微通道水平处，10x物镜下的倒置荧光显微图像，示出了在无梯度情况下的乳腺癌肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231)(14)。
31.图11是在芯片的中央贮存器水平处，5x物镜下的倒置荧光显微图像，示出了在无梯度情况下的乳腺癌肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231)(14)。
32.图12是在微通道水平处，10x物镜下的倒置荧光显微图像，示出了乳腺癌肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231)(14)在胎牛血清梯度下被吸入芯片中，该胎牛血清梯度由芯片外部的1％胎牛血清和贮存器内的10μl纯胎牛血清产生。
33.图13是在芯片的中央贮存器水平处，5x物镜下的倒置荧光显微图像，示出了乳腺癌肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231)(14)在胎牛血清梯度下被吸入芯片中，该胎牛血清梯度由芯片外部的1％胎牛血清和贮存器内的10μl纯胎牛血清产生。
34.图14是在微通道水平处，10x物镜下的倒置荧光显微图像，示出了乳腺癌肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231)(14)在化学吸附剂sdf
‑
1梯度(芯片中央贮存器中存在1μg化学吸附剂sdf
‑
1)下被吸入芯片中。
35.图15是在芯片的中央贮存器水平处，5x物镜下的倒置荧光显微图像，示出了乳腺癌肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231)(14)在化学吸附剂sdf
‑
1梯度(芯片中央贮存器中存在1μg化学吸附剂sdf
‑
1)下被吸入芯片中。
36.图16是示出了在5％co2和95％湿度的培养箱中培养48小时后，在未进行电穿孔的情况下，在含有叉指电极的载玻片上的乳腺癌肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231)(14)的倒置荧光显微图像。
37.图17是含有叉指电极的载玻片上的乳腺癌肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231)被电穿孔破坏后的倒置荧光显微图像，该电穿孔是通过在d0时刻和d0 3小时的时刻用叉指电极施加100μs的1hz、5v电场进行的。
38.图18是在微通道水平处的倒置荧光显微图像，示出了在没有梯度和脉冲电场情况下的乳腺癌肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231)。
39.图19是在微通道水平处的倒置荧光显微图像，示出了在没有脉冲电场情况下，乳腺癌肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231)在sdf
‑
1梯度(芯片中央贮存器中存在1μg化学吸附剂sdf
‑
1)下被吸入芯片中。
40.图20是在微通道水平处的倒置荧光显微图像，其示出了乳腺癌肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231)在sdf
‑
1梯度(芯片中央贮存器中存在1μg化学吸附剂sdf
‑
1)以及100ms的1hz、5v脉冲电场的情况下被吸入芯片中。
41.图21是示出了在50天时间内，从包含在根据本发明的微流控芯片中的海藻酸盐基质中释放bsa
‑
fitc(模拟sdf
‑
1)的曲线图。
42.图22是示出了在50天时间内，从海藻酸盐基质中释放sdf
‑
1的曲线图。
具体实施方式
43.申请人已经开发了一种微流控芯片以吸引和破坏生物元件，例如原核或真核细胞。该微流控芯片特别有利于在切除实体肿瘤之后在体内吸引和破坏癌细胞，以防止和/或降低局部复发和/或发生转移性癌的风险。
44.定义
[0045]“微流控芯片”是包括微通道网络的装置，微通道网络即微米尺寸的通道，其由通过对材料进行蚀刻或模制而获得，彼此连接，并且通过钻通芯片的入口和出口而将芯片内部与芯片外部进行连接，以便执行期望的功能。微流控芯片可以通过诸如沉积和电沉积、蚀刻、键合、注射模制、压印、软光刻、阳极焊接或任何其他技术的特定工艺来获得。这些制造工艺对于本领域技术人员是已知的。在本发明的上下文中，微流控芯片的期望功能是能够在体内吸引特定的生物元件，优选真核细胞，例如癌细胞，并且能够在体内破坏它。
[0046]“微通道网络”对应于通过钻通芯片的入口和出口连接到芯片外部的多个通道。微通道可以例如模制而成，或者直接在微流控芯片的材料中制造。微通道的数量根据芯片的直径、微通道的宽度或所述微通道之间的间距而变化。举例来说，对于直径为1厘米且通道宽度为10μm的芯片，微通道的数目可大致为1500。
[0047]
构成微通道网络的每个微通道对应的通路高度可以从几微米到几百微米，长度为几百微米高至几毫米。微通道的横截面原则上可以具有任何二维形状，诸如正方形、矩形、圆形或其组合。微通道可以是直的或弯的。
[0048]
微通道的宽度是位于横截面的相对边缘上的距离最远的两个点的水平距离。微通道的高度是位于横截面的相对边缘上的距离最远的点的垂直距离。微通道的长度是所述通道两端之间的距离，微通道的长度对应于最大尺寸。两个较短的尺寸通常限定前述横截面。
[0049]
在本发明的上下文中，“电极”是指能够传导电流的任何元件，并且包括由间距为1μm至1mm的气隙隔开的两个导体。为了清楚起见，本发明以单数形式提及电极，但本领域技术人员理解，电极由两个被气隙隔开的、可以传导电流的导体构成。
[0050]
微流控芯片优选地为“体内植入式”，即，微流控芯片意图被植入活体内并且能够被植入活体内，优选哺乳动物体内，特别是人体内。更具体地，这意味着芯片能够被植入活体中，而不干扰或降解与其接触的组织，并且所述芯片能够在体内发挥作用，即，在体内吸引和破坏特定的生物元件，优选为诸如癌细胞的真核细胞，并且在体内破坏它。
[0051]
在本发明的意义上，“生物元件”是指包含rna或dna形式的遗传信息并且可能在活生物体(即体内，如原核细胞、真核细胞和微生物)内发现的任何元件。在可构想的生物元件中，可以参考原核细胞，例如细菌；和真核细胞，例如动物细胞。
[0052]“特定生物元件”或“目标生物元件”是指在芯片的使用场景下，感兴趣的生物元件，即，打算在体内被吸引和破坏的生物元件。在使用微流控芯片的情况下，对存在于贮存器中的化学引诱物化合物进行选择来吸引所感兴趣的生物元件。
[0053]“在与微通道网络相同的位置处”是指电极被布置在微通道网络水平(level)处，更确切地，在微通道网络上方或下方。优选地，电极被布置在微通道网络上方。
[0054]
优选地，在本发明的上下文中，感兴趣的生物元件是原核或真核细胞，更优选地，所感兴趣的生物元件是真核细胞。更加优选地，真核细胞是癌细胞，优选为转移癌细胞。
[0055]“癌细胞”是这样的细胞：该细胞中已经发生了一个或多个主要dna病变，从而将正
常细胞转化为能够增殖形成一群相同转化细胞(即，肿瘤)的癌细胞。特别地，当所讨论的细胞具有多个特征时，它就被称为癌细胞，这些特征如：不受细胞生长调节信号的影响、逃脱细胞程序性死亡过程的能力以及无限分裂的能力。
[0056]
更具体地，在本发明的上下文中，“癌细胞”是指来自所谓的初始或原发性实体瘤、存在于实体瘤切除区域处或其附近的的细胞。
[0057]
优选地，在本发明的上下文中，“癌细胞”还指“转移癌细胞”，即，能够或已经通过血液或淋巴管从原始肿瘤迁移到全身，并且能够或已经在所述肿瘤附近或距离所述肿瘤一定距离处的一个或多个组织中大量繁殖，从而在“转移癌”或“转移瘤”的起源处形成转移的癌细胞。在本文中，癌细胞是源自所谓的二级或三级实体瘤的细胞，其相当于第二或第三组织或器官中的转移瘤，而不同于初始肿瘤。
[0058]
为了清楚起见，以单数形式提及“特定生物元件”、“原核细胞”、“真核细胞”、“癌细胞”、“转移性细胞”，应理解，根据本发明的微流控芯片能够在体内吸引和破坏数种所述元件和细胞。还应注意，根据本发明的微流控芯片能够在体内吸引和破坏可具有不同性质的数种特定生物元件，所述元件通过所特定选择的存在于贮存器中的一种或多种化学引诱物化合物而被吸入芯片中。
[0059]
在本发明的上下文中，术语“预防”是指降低患有特定疾病或病症的风险、减少或减缓该疾病症状的发作。例如，在本发明的上下文中，术语“预防”可以相当于降低感染扩散的风险(当生物元件是原核细胞时)；或降低癌症局部复发的风险和/或转移(特别是转移癌)出现的风险(当生物元件是癌类型的真核细胞时)。
[0060]
在本发明的上下文中，术语“治疗”是指指定疾病或病症或者至少一个可辨别症状的改善或逆转。术语“治疗”也可以指减轻或减缓疾病或病症的进展，或疾病或病症症状的发作。例如，在本发明的上下文中，当生物元件是原核细胞时，术语“治疗”可以相当于感染的进展减轻或减缓，或者当生物元件是癌类型的真核细胞时，相当于转移(更特别地是转移癌)出现的减少或减缓。
[0061]
在本发明的意义上，微流控芯片优选旨在植入对象的体内。
[0062]
本发明上下文中的对象为活体，优选为哺乳动物，更具体地为人类、儿童、男人或女人。
[0063]“实体癌”或“实体瘤”是指器官中存在的皮肤、黏膜、骨等组织或任何其他组织中的个体化的癌细胞团，即，源自上皮细胞(诸如皮肤、黏膜、腺体等)的癌症和源自结缔组织和支撑组织(诸如骨骼、软骨等)的细胞的肉瘤。
[0064]
优选地，在本发明的上下文中，“实体癌”或“实体瘤”是指诸如乳腺、肺、前列腺、膀胱、唾液腺、皮肤、小肠、结肠直肠、甲状腺、子宫颈、子宫内膜和卵巢、唇
‑
口
‑
喉、肾、肝、脑、睾丸、胰腺中的癌症，优选乳腺癌。实体瘤的这些示例是非限制性的。
[0065]“化学引诱物化合物”是指能够通过趋化作用吸引生物元件、优选吸引在其表面表达该化合物的特定膜受体的细胞的任何化合物，所述生物元件的移动依赖于化学引诱物化合物的浓度梯度。在本发明的上下文中，依赖于正向趋化作用中该化合物的浓度梯度，化学引诱物化合物能够诱导一种或多种特定生物元件发生位移，其中生物元件向着化学引诱物化合物浓度最高的区域移动。
[0066]
特别地，在本发明的上下文中，当化学引诱物化合物允许特定生物元件在微流控
芯片内移动、特别是当化学引诱物化合物允许该特定生物元件朝向化学引诱物化合物浓度最高的化学引诱物化合物贮存器移动时，化学引诱物化合物被认为“适合于吸引”特定的生物元件。本领域技术人员将知晓如何表征感兴趣的特定生物元件，以便对适合于吸引芯片内的所述元件的化学引诱物化合物进行选择。
[0067]
在本发明的上下文中，基于所关注的特定生物元件来选择化学引诱物化合物。
[0068]
当生物元件是真核细胞时根据该细胞表达的膜受体类型来选择化学引诱物化合物。
[0069]
更确切地，当生物元件是真核细胞时，化学引诱物化合物可以是细胞因子，即由细胞合成的多肽或可溶性蛋白质，并且所述多肽或可溶性蛋白质通过膜受体远距离作用于其他细胞以调节它们的活性和功能，所述化学引诱物化合物选自趋化因子、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子，如m
‑
csf、g
‑
csf、csf
‑
1；生长因子和转化生长因子，如tgfα、tgfβ、egf、β细胞素(betacellulin)、双调蛋白(amphiregulin)、调蛋白(heregulin)、hbegf、fgf、vegf；肿瘤坏死因子，如ngf、tnfα、tnfβ；干扰素，如ifnα、ifnβ、ifnγ、ifnλ；以及白细胞介素，如il
‑
1至il
‑
38。
[0070]
优选地，当生物元件是真核细胞(诸如癌细胞)时，化学引诱物化合物选自趋化因子、生长因子和转化生长因子。
[0071]
趋化因子是8至14千道尔顿的小蛋白，其特征为存在四个位置保守的半胱氨酸残基，从而允许形成其三维结构。趋化因子可根据n末端位置处的两个半胱氨酸之间的间距而被分为四个亚族，称为cxc或α家族(即，其前两个半胱氨酸被任意氨基酸分开)、cc或β家族、cx3c或δ家族以及c或γ家族。例如，本发明上下文中的趋化因子可以选自以下趋化因子：cxcl12(也称为基质细胞衍生因子1(sdf
‑
1))、ccl5、ccl2、ccl3、ccl7、ccl19、ccl21、ccl22、ccl25、cxcl1、cxcl5、cxcl6、cxcl8、cx3cl1。
[0072]
生长因子是一种低分子量蛋白(小于30千道尔顿)，其刺激细胞增殖，并被特定的膜受体识别，这些受体通常为酪氨酸激酶。本发明上下文中的生长因子可以例如选自tgfα或tgfβ(转化生长因子α或β)、fgf(成纤维细胞生长因子α)、egf(表皮生长因子)、β细胞素、双调蛋白、调蛋白、hbegf、vegf(血管内皮生长因子)、pdgf(血小板衍生生长因子)。
[0073]
当生物元件是原核细胞(诸如细菌)时，化学引诱物化合物可以是含有甲酰基化n基团的肽，诸如n
‑
甲酰基甲硫氨酰
‑
亮氨酰
‑
苯丙氨酸(fmlp)或碳水化合物分子，诸如葡萄糖。
[0074]
在本发明的上下文中，化学引诱物化合物包含在由本发明定义的生物相容性材料构成的基质中。可根据化学引诱物化合物、所期望的释放曲线以及微流控芯片的使用场景，对基质的生物相容性材料进行具体选择。
[0075]
在本发明的上下文中，“外部环境”是指当微流控芯片被植入体内时，位于微流控芯片周围的组织，更精确地，是指与芯片直接接触的组织，在芯片周围300mm以内，优选地150mm以内，更优选地100mm以内。
[0076]“切除实体瘤”是指例如通过外科手术去除、消融或切除实体瘤。
[0077]
因此，本发明涉及一种用于在体内吸引和破坏特定生物元件的微流控芯片。
[0078]
在当前具体实施方式的上下文中所使用的附图标记是指本技术中用于描述本发明的数字，但不限于此。
[0079]
本发明的第一主题涉及一种用于吸引和破坏特定生物元件的微流控芯片，所述芯片包括：
[0080]
‑
贮存器(1)，其由包含能够吸引生物元件的化学引诱物化合物的基质组成；
[0081]
‑
至少一个微通道网络(2)，其布置在贮存器(1)和芯片的外部环境(3)之间，并且允许化学引诱物化合物传递到所述环境，并允许存在于所述环境中的生物元件传递到贮存器(1)；
[0082]
‑
至少一个电极(4)，其布置在贮存器(1)和微通道网络(2)之间或布置在与微通道网络(2)相同的位置处，所述电极能够产生电场，使得生物元件在向贮存器(1)传递的过程中被破坏。
[0083]
更确切地，本发明涉及一种用于吸引和破坏特定生物元件(优选真核细胞)的体内植入式微流控芯片，所述芯片包括：
[0084]
‑
贮存器(1)，其由包含能够在体内吸引生物元件的化学引诱物化合物的基质组成；
[0085]
‑
至少一个微通道网络(2)，其布置在贮存器(1)和芯片的外部环境(3)之间，并且允许化学引诱物化合物传递到所述环境，并允许存在于所述环境中的生物元件传递到所述贮存器(1)；
[0086]
‑
至少一个电极(4)，其布置在贮存器(1)和微通道网络(2)之间或布置在与微通道网络(2)相同的位置处，所述电极能够产生电场，使得生物元件在体内向贮存器(1)传递的过程中被破坏。
[0087]
根据一优选方面，本发明涉及一种用于吸引和破坏真核细胞(优选癌细胞)的体内植入式微流控芯片，所述芯片包括：
[0088]
‑
贮存器(1)，其由包含能够在体内吸引所述细胞的化学引诱物化合物的基质组成；
[0089]
‑
至少一个微通道网络(2)，其布置在贮存器(1)和芯片的外部环境(3)之间，并且允许化学引诱物化合物传递到所述环境，并允许存在于所述环境中的所述细胞传递到贮存器(1)；
[0090]
‑
至少一个电极(4)，其布置在贮存器(1)和微通道网络(2)之间或布置在与微通道网络(2)相同的位置处，所述电极(4)能够产生电场，使得所述细胞在体内向贮存器(1)传递的过程中被破坏。
[0091]
根据第一具体实施方案，本发明涉及用于吸引和破坏特定生物元件(优选真核细胞，更优选癌细胞)的体内植入式微流控芯片，所述芯片包括：
[0092]
‑
贮存器(1)，其由包含能够在体内吸引所述细胞的化学引诱物化合物的基质组成；
[0093]
‑
至少一个微通道网络(2)，其布置在贮存器(1)和芯片的外部环境(3)之间，并且允许化学引诱物化合物传递到所述环境，并允许存在于所述环境中的所述细胞传递到贮存器(1)；
[0094]
‑
至少一个电极(4)，其布置在贮存器(1)和微通道网络(2)之间，所述电极(4)能够产生电场，使得所述细胞在体内向贮存器(1)传递的过程中被破坏。
[0095]
根据第二具体实施方案，本发明涉及一种用于吸引和破坏特定生物元件(优选真
核细胞，更优选癌细胞)的体内植入式微流控芯片，所述芯片包括：
[0096]
‑
贮存器(1)，其由包含能够在体内吸引所述细胞的化学引诱物化合物的基质组成；
[0097]
‑
至少一个微通道网络(2)，其布置在贮存器(1)和芯片的外部环境(3)之间，并且允许化学引诱物化合物传递到所述环境，并允许存在于所述环境中的所述细胞传递到贮存器(1)；
[0098]
‑
至少一个电极(4)，其布置在与微通道网络(2)相同的位置处，所述电极(4)能够产生电场，使得所述细胞在体内向贮存器(1)传递的过程中被破坏。
[0099]
优选地，在该实施方案中，电极布置在微通道网络上方或下方，更优选地，电极布置在微通道网络上方。
[0100]
包含化学引诱物化合物的贮存器(1)的基质由生物相容性材料形成。
[0101]
包含在贮存器(1)的基质中的化学引诱物化合物在体内通过正向趋化作用吸引芯片内的特定生物元件，生物元件迁移到化学引诱物化合物浓度最高的贮存器(1)处。微通道网络(2)允许化学引诱物化合物从贮存器(1)扩散到芯片的外部环境(3)，并允许特定生物元件从芯片的外部环境(3)迁移到芯片内部，到达贮存器(1)。电极(4)被布置在贮存器(1)和微通道网络(2)之间，使得当特定生物元件通过微通道网络(2)从外部环境(3)进入芯片并到达贮存器(1)时，其在体内向贮存器(1)传递的过程中被所述电极(4)产生的电场破坏。
[0102]
在本发明的上下文中，生物元件优选地是癌细胞，特别是源自癌症或实体瘤的癌细胞。该细胞在芯片内部的迁移通过黏附至布置有电极(4)的支撑件来进行，而后，由电极产生的电场能够在细胞在体内向贮存器(1)传递期间破坏细胞。
[0103]
根据本发明的微流控芯片的微通道网络(2)优选地位于所述芯片的外边缘上，即，与外部环境(3)接触，从而确保所述环境与芯片的内部空间之间的连通。
[0104]
根据本发明的芯片可以包括数个微通道网络(2)，例如两个微通道网络。根据一优选方面，根据本发明的微流控芯片包括单个电极(4)。根据另一方面，根据本发明的微流控芯片包括数个电极(4)。
[0105]
根据本发明的具体实施方案，电极可以更具体地布置为：
[0106]
‑
在至少一个微通道网络的两侧；
[0107]
‑
在至少一个微通道网络内；
[0108]
‑
在至少两个微通道网络之间；或
[0109]
‑
与至少一个微通道网络相邻。
[0110]
根据本发明的第一主题的微流控芯片包括下部(5)和上部(6)，包含化学引诱物化合物基质的贮存器(1)，微通道网络(2)和电极(4)能够彼此独立地包含于所述芯片的上部(6)和/或下部(5)中。
[0111]
微流控芯片的上部(6)适于布置在下部(5)的上方以形成覆盖件，所述上部(6)和下部(5)被固定在一起。
[0112]
根据一具体方面，根据本发明的微流控芯片包括下部(5)和上部(6)，下部(5)包括贮存器(1)的一部分、微通道网络(2)和电极(4)，上部(6)包括贮存器(1)的一部分，并且适于布置在下部(5)的上方，所述上部和下部被固定在一起。
[0113]
根据另一具体方面，根据本发明的微流控芯片包括下部(5)和上部(6)，下部(5)包
括贮存器(1)的一部分和电极(4)，上部(6)包括贮存器(1)的一部分和微通道网络(2)，所述上部适于布置在下部(5)的上方，所述上部和下部被固定在一起。
[0114]
关于电极(4)，“包含在”是指电极被沉积和/或集成在芯片的下部和/或上部上。优选地，电极被集成在芯片的下部上。
[0115]
包含在下部(5)和上部(6)中的贮存器(1)是单个贮存器，其一部分位于芯片的上部中，另一部分位于芯片的下部中。
[0116]
在本发明的上下文中，表述上部(6)“适于布置在下部(5)的上方以形成覆盖件”意指上部(6)的形状使得其适配于其所放置的下部(5)的形状，而不妨碍构成下部(5)的每个要素的功能，并且允许形成关闭芯片的覆盖件。
[0117]
有利地并且优选地，微流控芯片的上部(6)和下部(5)是圆形的，使得可以将芯片植入体内而不损伤组织。
[0118]
优选地，芯片是圆形的，例如，上部和下部具有半椭圆形或半球形形状，使得当上部被布置在下部上时，微流控芯片分别是椭圆形或球形的。
[0119]
根据第一主题的微流控芯片的尺寸适合于植入体内并且量级为几厘米，优选地为0.5cm至5cm，更优选地为1cm至3cm，更加优选地为1cm。
[0120]
更具体地，本发明涉及一种微流控芯片，其中贮存器(1)、微通道网络(2)和电极(4)均是环形的，并且其中贮存器位于芯片中心。
[0121]
顾名思义，环形即为环的形状。由于贮存器(1)处于中心位置并且微通道网络(2)具有环形形状，这种特定构造确保了包含在贮存器(1)中的化学引诱物化合物径向地扩散至外部环境(3)，以及均匀地将生物元件从所述环境吸引至贮存器(1)。同样地，布置在贮存器(1)和微通道网络(2)之间的电极(4)的环形形状有利地确保对从任何方向穿透芯片的每一生物元件的有效破坏。
[0122]
微流控芯片的下部(5)和上部(6)可以通过适合于体内使用的任何物理或化学手段(12)相互固定。作为物理或化学固定手段的示例，可以分别参照适合于体内使用芯片的螺钉或黏合剂，或参照存在于下部和上部中，将其连在一起的中空元件及与之相对设置的凸出元件。
[0123]
优选地，在本发明的上下文中，上部(6)包括一个或多个开口，一个或多个螺钉可通过该一个或多个开口插入，下部(5)包括适于接收所述一个或多个螺钉的一个或多个螺母。
[0124]
更优选地，根据本发明的微流控芯片的上部(6)包括中心开口，螺钉可通过该中心开口插入，并且下部(5)包括能够接收所述螺钉的中心螺母。在该优选实施方案中，环形贮存器(1)围绕芯片上部(6)的中心开口和芯片下部(5)的中心螺母布置。
[0125]
特别地，微流控芯片包括能够密封芯片的一个或多个密封件(7)，所述密封件(7)布置下部(5)和上部(6)之间，位于微通道网络(2)上方。
[0126]“能够密封芯片的密封件”是指密封件具有不允许可能存在于外部环境(3)中的流体(诸如血液)进入芯片，并且不允许存在于芯片内部的液体和物质通过微通道网络(2)以外的任何其他位置离开芯片的性质。一个或多个密封件(7)在微通道网络(2)上方，这不会妨碍化学引诱物化合物向外部环境(3)扩散，也不会阻碍存在于所述环境中的特定细胞经过芯片内而传递到贮存器(1)。有利地，密封件在芯片的上部与下部之间形成支撑区域。
[0127]
具体地，本发明涉及一种微流控芯片，其中上部(6)和/或下部(5)包括环形腔i)(8)和环形腔ii)(10)，环形腔i)(8)能够接收包含化学引诱物化合物的基质，环形腔ii)(10)布置在贮存器(1)和微通道网络(2)之间，其能够接收化学引诱物化合物能够扩散至其中的液体。
[0128]
更具体地，本发明涉及一种微流控芯片，其中上部(6)和/或下部(5)包括环形腔i)(8)和环形腔ii)(10)，环形腔i)(8)能够通过与外部环境(3)连通并且通向环形腔i)(8)的一个或多个开口(9)来接收包含化学引诱物化合物的基质；环形腔ii)(10)布置在贮存器(1)和微通道网络(2)之间，适于通过与外部环境(3)连通并通向环形腔ii)(10)的一个或多个开口(11)来接收化学引诱物化合物能够扩散至其中的液体。
[0129]
更加具体地，本发明涉及一种微流控芯片，其中上部(6)和下部(5)包括环形腔i)(8)和环形腔ii)(10)，环形腔i)(8)能够通过与外部环境(3)连通并且通向环形腔i)(8)的一个或多个开口(9)来接收包含化学引诱物化合物的基质；环形腔ii)(10)布置在贮存器(1)和微通道网络(2)之间，适于通过与外部环境(3)连通并通向环形腔ii)(10)的一个或多个开口(11)来接收化学引诱物化合物能够扩散至其中的液体。
[0130]
优选地，在添加到环形腔i)(8)中之前，已将化学引诱物化合物添加到贮存器(1)的基质中。或者，在添加至贮存器(1)基质所在的腔之前或之后，可已将化学引诱物化合物添加至环形腔i)(8)。
[0131]
优选地，在上部(6)已经置于下部(5)上方之后，分别通过所述开口(9，11)向环形腔i)(8)和环形腔ii)(10)中添加基质，所述基质包含化学引诱物化合物和化学引诱物化合物能够扩散至其中的液体。
[0132]
化学引诱物化合物能够扩散至其中的液体优选为水溶液，例如盐水或生理缓冲溶液，例如含有磷酸盐缓冲盐水(pbs)的水溶液。
[0133]
通过用密封件(例如由pdms或任何其它合适的材料制成)关闭开口来确保在所述添加操作之后每个腔的不可渗透性，所述密封件位于这些开口(9，11)的出口处并与外部环境(3)连通。
[0134]
优选地，环形腔i)(8)被包括在芯片的上部(6)和下部(5)，通向该腔的一个或多个开口(9)位于芯片的下部(5)，并且环形腔ii)(10)以及通向该腔的一个或多个开口(11)被包括在芯片的上部(6)中。
[0135]
根据本发明的芯片由生物相容性材料制成。特别地，本发明涉及一种微流控芯片，其中上部(6)和下部(5)由生物相容性材料构成。
[0136]
更确切地，这样的上部(6)和下部(5)以及它们所包括的元件均由生物相容性材料制成。更确切地，上部(6)、下部(5)、贮存器(1)、特别是包含化学引诱物化合物的基质、微通道网络(2)、电极(4)和密封件(7)均由生物相容性材料制成。
[0137]“生物相容性材料”或“生物材料”是指不干扰或降解其所用于的生物环境的材料，甚至与人或动物身体的内部组织和体液直接或间接、短暂或持续地接触也是如此。作为可在本发明上下文中使用的生物相容性材料的示例，可非穷举性地参考玻璃、陶瓷(诸如氧化铝、氧化锆、羟磷灰石)、金属和金属合金(诸如钛、铂)、天然来源的聚合物(诸如胶原、琼脂糖、壳聚糖、角叉菜胶、黄原胶和海藻酸盐)、或可降解的合成聚合物(诸如聚酯和聚酸酐)或不可降解聚合物(诸如聚氨酯、纤维素及其衍生物、乙烯基聚合物等。优选地，在本发明的上
下文中，合成聚合物是聚醚醚酮(peek)或聚二甲基硅氧烷(pdms)。
[0138]
优选地，上部(6)、下部(5)和微通道网络(2)彼此独立地由合成来源的聚合物制成，例如聚二甲基硅氧烷(pdms)或聚醚醚酮(peek)。甚至更优选地，上部(6)和下部(5)由聚醚醚酮(peek)制成。
[0139]
优选地，微通道网络(2)由聚醚醚酮(peek)制成。
[0140]
优选地，电极(4)由钛和/或铂制成，更优选地由钛和铂制成。
[0141]
优选地，贮存器(1)，特别是包含化学引诱物化合物的基质，由胶原和/或海藻酸盐制成，更优选地，所述贮存器(1)，特别是所述基质，由海藻酸盐制成。
[0142]
在一具体且优选的方式中，根据本发明的芯片的上部(6)、下部(5)和微通道网络(2)由聚醚醚酮(peek)制成，化学引诱物化合物的贮存器(1)由海藻酸盐制成，并且电极(4)由钛和铂制成。
[0143]
根据一具体方面，本发明涉及一种微流控芯片，其中包含化学引诱物化合物的基质由生物相容性材料构成，优选由交联聚合物构成。优选地，构成基质的交联聚合物是天然来源的聚合物，特别是胶原和/或海藻酸盐，优选海藻酸盐。
[0144]
聚合物的交联对应于由先行或支化聚合物通过化学和/或物理手段形成一个或多个三维网络的过程。本领域技术人员知晓如何根据所考虑的聚合物诱发聚合物的交联，作为示例，可以通过加热和/或通过使用交联剂来进行交联。“交联的”聚合物是其中一些链通过强键或弱键连接在一起的聚合物。
[0145]
举例来说，可在室温下使用氨气、氧化糖或醛等交联剂进行胶原的交联，且可在室温下在氯化钙浴中进行海藻酸盐的交联。
[0146]
甚至更优选地，构成包含化学引诱物化合物的基质的生物相容性材料是在氯化钙浴中，优选在室温下进行交联的海藻酸盐。
[0147]
构成包含化学引诱物化合物的基质的生物相容性材料的交联有利地允许该化合物持续释放。“持续释放”是指化学引诱物化合物在一段时间内的受控和连续释放的动力学表现。优选地，在本发明的上下文中，化学引诱物化合物的释放发生3天至6个月，优选地发生15天至3个月。
[0148]
根据特定方面，本发明涉及一种微流控芯片，其中贮存器(1)中化学引诱物化合物与基质的质量百分比为0.1％至20％，优选为0.5％至10％，更优选为0.5％至5％。
[0149]
本领域技术人员将知晓如何根据芯片的使用场景、感兴趣的特定生物元件、化学引诱物化合物的期望释放时间和构成贮存器基质的生物材料，来确定贮存器中化学引诱物化合物的含量。
[0150]
当特定生物元件是真核细胞，优选癌细胞时，包含在微流控芯片的贮存器中并且特别是贮存器基质中的化学引诱物化合物优选地选自趋化因子，例如cxcl12，也称为基质细胞衍生因子1(sdf
‑
1)、ccl5、ccl2、ccl3、ccl7、ccl19、ccl21、ccl22、ccl25、cxcl1、cxcl5、cxcl6、cxcl8、cx3cl1、生长因子和转化生长因子，诸如tgfα或β(转化生长因子α或β)、fgf(成纤维细胞生长因子α)、egf(表皮生长因子α)、β细胞素、双调蛋白、调蛋白、hbegf、pdgf(血小板衍生生长因子)、vegf(血管内皮生长因子)。
[0151]
更具体地，本发明涉及一种微流控芯片，其中包含在芯片的贮存器(1)中的化学引诱物化合物选自以下化合物中的至少一种：cxcl12、ccl5、ccl2、ccl3、ccl7、ccl19、ccl21、
ccl22、ccl25、cxcl1、cxcl5、cxcl6、cxcl8、cx3cl1、tgfα、tgfβ、fgf、pdgf、egf、vegf。
[0152]
根据另一方面，当特定生物元件是原核细胞(优选细菌)时，包含在微流控芯片的贮存器(1)中的化学引诱物，特别是贮存器(1)的基质中的化学引诱物，优选选自碳水化合物分子。
[0153]
化学引诱物化合物可单独使用或与上述一种或多种其它化学引诱物化合物和/或其它化合物组合使用，该化学引诱物化合物和化合物能够直接或间接地改善所述化学引诱物化合物吸引特定生物元件的能力，所述特定生物元件如真核细胞，特别是癌细胞；如碳水化合物(葡萄糖)和/或脂质(脂肪酸)分子，其能够为生物元件(特别是真核细胞，进一步地特别是癌细胞)的存活提供必需的能量(在葡萄糖或脂肪酸降解之后以atp的形式提供能量)。其他分子也能与化学引诱物结合使用，诸如氧。氧可以通过血红蛋白或合成血红蛋白传输。氧是细胞(尤其是癌细胞)存活和增殖的重要分子。优选地，化学引诱物化合物与一种或多种碳水化合物(葡萄糖)和/或脂质(脂肪酸)分子组合使用。
[0154]
本领域技术人员将根据所靶向的特定生物元件谨慎选择一种或多种化学引诱物化合物。
[0155]
为此，当生物元件是真核细胞时，必须预先对靶向细胞表达的膜受体进行分析以确保所选择的一种或多种化学引诱物化合物的特异性。
[0156]
举例来说，当特定生物元件是表达跨膜受体cxcr4(例如人乳癌细胞)的癌细胞时，所选择的化学引诱物化合物是基质细胞衍生因子1(sdf
‑
1)。
[0157]
类似地，当特定生物元件是肺癌的癌细胞时，所选择的化学引诱物化合物是表皮生长因子(egf)或转化生长因子α(tgfα)。
[0158]
构成根据本发明的微流控芯片的微通道网络(2)的微通道可以是平行六面体、圆柱体、鳞状、截头锥体或这些形状的混合物。
[0159]
根据本发明的微流控芯片的微通道网络(2)中所包含的每个微通道的高度可以为1μm至500μm，优选50μm至150μm，宽度可以为1μm至500μm，优选50μm至150μm，长度可以为30μm至1mm，优选30μm至500μm。
[0160]
具体地，在本发明的上下文中，在微通道网络(2)中包含的每个微通道的高度为1μm至40μm、宽度为1μm至40μm、长度为30μm至250μm。
[0161]
优选地，在本发明的上下文中，在微通道网络(2)中包含的每个微通道的高度为5μm至20μm、宽度为5μm至20μm、长度为100μm至200μm、优选200μm。
[0162]
包含在微通道网络中的各微通道可具有其各自的尺寸，该尺寸独立于包含在微通道网络中的其他微通道的尺寸。
[0163]
类似地，当芯片包括数个微通道网络时，同一网络的各微通道以及包含在不同微通道网络中的各微通道可以彼此独立地具有其各自的尺寸和形状。
[0164]
优选地，在本发明的上下文中，包括在微通道网络中的所有微通道具有相同的形状和相同的尺寸。
[0165]
根据特定方面，本发明涉及一种微流控芯片，其中电极(4)是叉指电极。
[0166]“叉指电极”对应于其中每个导体是多齿状的电极(4)。优选地，每个导体的直径为200μm至400μm，优选约315μm，并且每个导体通过10μm至50μm，优选约15μm的气隙与另一导体间隔开。
[0167]
甚至更优选地，电极(4)是由天线(13)远程供电的无线电极。
[0168]
例如，远程电源可以通过使用频率范围为13.553
‑
13.567mhz的ism(工业、科学和医疗)频带的无线通信来操作。
[0169]
更具体地，本发明涉及一种微流控芯片，其中电极(4)是无线电极，所述芯片包括可由第二天线激活的天线。优选地，当所述微流控芯片为体内植入式时，优选地将第二天线放置在体外。
[0170]“天线”是指由形成一个或多个线圈的导电材料构成的电子元件。当电流穿过天线时会产生磁场。该磁场可以由天线释放为电能。因此，天线通过电感使电流传输通过组织。优选地，在本发明的上下文中，天线是电感器。
[0171]
天线(13)允许电极(4)的远程供电。
[0172]
天线还可以允许远程地传输信息。
[0173]
待定位于体外的第二天线具有发射器功能，并且包括在无线电极中的天线具有接收器功能。
[0174]
本领域的技术人员将根据待发射的无线电力的效率，谨慎调适发射器与接收器之间的谐振频率、距离及对准。
[0175]
包括在芯片中的天线以及第二天线由生物相容性材料制成，优选地与制备电极(4)所用的材料相同，优选钛。
[0176]
更具体地，当芯片为体内植入式时，所述天线的直径足以通过电感将电力传输穿过组织，优选地，天线的直径与要穿过的组织的厚度具有相同数量级，优选地，所述天线的直径为5mm至100mm，甚至更优选地在10mm至80mm。
[0177]
根据一优选的方面，第二天线被集成到外用于皮肤的贴剂上，所述贴剂包括生理上可接受的外用载体，即，与皮肤、黏膜和皮肤等附属器官相兼容的外用载体。
[0178]
第二天线也可以位于外部的盒中。
[0179]
根据特定方面，本发明涉及一种微流控芯片，其中由电极(4)产生的电场能够通过不可逆电穿孔破坏生物元件。
[0180]
优选地，所述由电极产生的电场是脉冲电场，其相当于一种短持续时间(通常为几微秒至几毫秒)的选择性非热能处理。
[0181]
在特定细胞上施加脉冲电场导致膜表面上的电荷积聚和细胞膜的跨膜电位增加。积聚在细胞膜两侧的相反符号的电荷之间的吸引力导致细胞膜受到压缩，而弹力趋于对抗这种电压缩。当所施加的脉冲电场超过临界值时，电压缩力大于弹力，则细胞膜上出现孔洞。当脉冲电场的强度较高和/或治疗的持续时间较长时，则会增加细胞膜的渗透性，并且使得细胞膜的破坏变得不可逆。
[0182]
在本发明的上下文中，由电极在特定生物元件上产生的脉冲电场诱发所述生物元件的不可逆电穿孔。更确切地，当生物元件是原核或真核细胞时，由电极产生的脉冲电场在细胞膜上产生孔，特别是纳米孔，诱导细胞内稳态的不可逆失调，从而通过细胞凋亡或坏死而导致细胞死亡。
[0183]
更具体地，由电极(4)产生的电场是频率为1hz，持续时间为100μs至200μs的电压为1000v/cm至6500v/cm的脉冲电场，优选3000v/cm至5000v/cm的脉冲电场。
[0184]
优选地，每天由电极多次产生该持续时间为100μs至200μs的脉冲电场，优选每天
至少3次，持续的时间段适合于芯片的使用场景。
[0185]
根据本发明的具体实施方案，微流控芯片包括用于测量进入微流控芯片的特定生物元件的数量和/或由电极破坏的生物元件的数量的手段。
[0186]
在可构想的手段中，可以特别参考经由产生破坏生物元件之电场的电极的电阻抗测量系统，或是通过专用于该测量方法的其他电极的测量系统，并且该测量系统可以被包括在微流控芯片的上部和/或下部中。
[0187]
电阻抗是当将电位差施加于系统时，系统对于电荷移动的对抗的量度。换句话说，其相当于施加到系统的电压与所产生的电流的比率。在本发明的上下文中，该测量用于量化进入微流控芯片的特定生物元件，其黏附到支撑物上，诱发了电阻抗的变化，该测量还用于量化电极所破坏的特定生物元件，该特定生物元件与电极分离，由此诱发了电阻抗的变化。
[0188]
优选地，用于测量进入微流控芯片的生物元件数量和/或由电极破坏的生物元件数量的手段是一种电阻抗测量方法。在本发明的特定实施方案中，信息可以通过无线通信技术采集和传输，例如通过频率范围为13.553mhz至13.567mhz的ism(工业，科学和医疗)频段。
[0189]
本发明的第二主题涉及根据本发明第一主题的微流控芯片用于吸引和破坏特定生物元件的用途。
[0190]
更具体地，本发明涉及根据本发明的第一主题的微流控芯片用于在体内吸引和破坏特定生物元件的用途，或用于在体内吸引和破坏特定生物元件的方法，所述芯片被植入体内。
[0191]
更确切地，本发明涉及根据本发明的第一主题的微流控芯片用于治疗或预防对象中特定生物元件(例如原核或真核细胞)的增殖和散播的用途，或用于治疗或预防对象中的特定生物元件(例如原核或真核细胞)的增殖和散播的方法，其中所述芯片被植入对象的体内。
[0192]
根据一个方面，本发明涉及根据本发明的第一主题的微流控芯片用于治疗或预防由原核细胞(例如细菌)引起的感染的用途，或用于治疗或预防由原核细胞(例如细菌)引起的感染的方法，其中所述芯片被植入对象的体内。
[0193]
根据一优选方面，本发明涉及根据本发明的第一主题的微流控芯片用于治疗或预防真核细胞(具体为癌细胞)增殖和散播的用途，或用于治疗或预防真核细胞(具体为癌细胞)增殖和散播的方法，所述治疗或预防优选在切除对象的实体瘤之后，其中所述芯片被植入对象的体内。
[0194]
更确切地，本发明涉及根据本发明的第一主题的微流控芯片用于预防对象中局部癌症复发和/或转移癌发生的风险的用途，或用于预防对象中局部癌症复发和/或转移癌发生的风险的方法，其中所述芯片被植入对象的体内。
[0195]
在这些用途和方法的上下文中，微流控芯片被植入对象体内距离实体瘤的切除区域或细菌感染的病灶0.1cm至20cm、优选1cm至10cm，更优选5cm的位置处。优选地，一旦实体肿瘤被切除，在切除区域水平处尽快植入微流控芯片，优选在所述肿瘤切除后立即植入。
[0196]
在这些用途和方法的上下文中，优选地，用电极每天产生数次脉冲电场，优选每天产生至少3次，更优选每天产生8次，脉冲电场的持续时间适合于芯片的使用场景。
[0197]“芯片的使用场景”是指所靶向的特定生物元件的类型，即，当所述元件是细菌时，细菌感染的类型；或当所述元件是癌细胞时，所靶向的癌细胞的类型，特别是所移除的实体瘤类型，以及所述肿瘤的阶段。
[0198]
根据所述场景，可以在3天至6个月、优选2周至4个月的时间段内产生脉冲电场，从而以周期重复形式治疗，采用或不采用休止期。
[0199]
例如，如果所切除的实体瘤处于晚期，则在8至16周的时间段内，电极每天产生至少3次，优选每天产生8次脉冲电场。例如，如果切除的实体瘤处于晚期，则在8至16周的时间段内，电极每天产生至少8次脉冲电场。
[0200]
在上述用途的上下文中，当特定生物元件为癌细胞时，微流控芯片可单独使用，或同时或相继地与其它药物化合物组合使用，所述其它药物化合物例如抗癌化合物，包括化学治疗剂和/或激素和/或免疫治疗剂和/或靶向治疗化合物和/或放疗。
[0201]
最后，本发明还涉及根据第一主题的微流控芯片用于在体内吸引和破坏特定生物元件，所述芯片根据前述实施条件而被植入体内。
[0202]
更确切地，本发明涉及根据第一主题的微流控芯片用于治疗或预防对象中特定生物元件(例如原核或真核细胞)的增殖和散播，其中所述芯片根据前述实施条件而被植入对象的体内。
[0203]
根据一个方面，本发明涉及根据第一主题的微流控芯片用于治疗或预防由原核细胞(例如细菌)引起的感染，其中所述芯片被植入对象的体内。
[0204]
根据一优选方面，本发明涉及根据第一主题的微流控芯片用于治疗或预防真核细胞的增殖和散播，尤其是在切除对象中的实体瘤之后，其中所述芯片根据前述实施条件而被植入对象的体内。
[0205]
甚至更优选地，本发明涉及根据第一主题的微流控芯片用于预防对象中的局部癌复发和/或转移癌发生的风险，其中所述芯片根据前述实施条件而被植入对象的体内。
[0206]
在这些用途和方法的上下文中，当特定生物元件是真核细胞，特别是癌细胞时，所述细胞优选来自于乳腺、肺、前列腺、膀胱、唾液腺、皮肤、小肠、结肠直肠、甲状腺、子宫颈、子宫内膜和卵巢、唇口喉、肾、肝、脑、睾丸、胰腺的癌症，优选乳腺癌。这些实体瘤的示例是非限制性的。
[0207]
将通过以下附图和实施例来进一步说明本发明。然而，这些实施例和附图不应被解释为限制本发明的范围。
[0208]
实施例
[0209]
实施例1：用于体外概念研究的微流控芯片的制造
[0210]
为了进行体外的概念性验证，在微流控芯片的中心处设置了含有化学引诱物的贮存器。
[0211]
a)微电极的集成
[0212]
在所谓的“piranha”溶液(h2so4:h2o2，3:1)中制备玻璃衬底(尺寸50x50 mm)，以便对玻璃衬底进行清洁并增加其亲水特性，然后在150℃的热板上除湿15分钟以促进负型光敏树脂(来自microchemicals的nlof 2020)的黏附。
[0213]
通过离心涂覆(3000rpm，30s)将树脂沉积在衬底上，以获得2μm的厚度。通过在110℃的热板上退火一分钟来蒸发溶剂。为了引发光刻胶一些部分的交联，使样品经受uv曝光
(70mj/cm2)。这种活化将改变树脂的局部性质，其在烘烤之后将变得可溶于溶剂或不可溶于溶剂。若树脂是负性的，则在显影期间暴露于uv射线的部分将变成固体，而另一部分将溶解。为了继续由uv暴露引发的交联反应，随后使所述板经受曝光后烘烤(post
‑
exposure bake，peb)，以提供在110℃下处理1分钟所需的能量。最后，该显影步骤将使得树脂的非交联部分稀释于基于氢氧化四甲基铵的溶剂(tmah，来自microchemicals的726 mif)中。
[0214]
然后，溅射钛/铂(20/200nm)沉积物，随后进行所谓的“剥离(lift
‑
off”(丙酮和nano
tm remover pg，来自microchemicals)以去除树脂残留。在该步骤结束时，电极被构造在玻璃板上。
[0215]
采用氮化硅(si3n4)的微结构化来确保不应导电的部分的电绝缘性。为此，重复上述光刻工艺并进行附加的对准步骤。在pecvd(等离子体增强化学气相沉积)框架中获得200nm的si3n4沉积物。然后通过反应性离子蚀刻工艺(reactive ion etching process，icp rie)蚀刻未被树脂保护的区域。在该过程结束时，使用remover pg(来自microchemicals)和空气等离子体清洁该装置。
[0216]
b)使用microchemicals su
‑
8光敏环氧树脂制造模具
[0217]
在“piranha”溶液中制备硅板(直径76.2mm)，然后在15至150℃下进行除湿。通过离心涂覆(3000rpm，30s)将su
‑
8树脂沉积在硅板上，以获得期望的厚度(10μm或100μm，这取决于所使用的类型为su
‑
8 2010还是su
‑
8 2100)。通过非常缓慢的加热以及非常缓和的冷却斜率，来使树脂中的机械应力最小化(5℃/分钟)，从而进行溶剂蒸发。对于厚度为10μm的样品，使该样品经受125mj/cm2的365nm uv暴露，并且对于厚度为100μm的样品，使该样品经受250mj/cm2的365nm uv暴露。然后使板进行曝光后烘烤(peb)(厚度为10μm的样品，在95℃下烘烤4分钟；厚度为100μm的样品，在95℃下烘烤30分钟)。最后，通过显影，可以使su
‑
8树脂的未交联部分稀释于溶剂(主要由丙二醇单甲醚醋酸酯(propylene glycol monomethyl ether acetate，pgmea)构成的“su
‑
8显影液”)中。在该步骤结束时，将允许对保留在硅板上的微通道图案进行结构化。
[0218]
c)对芯片的微通道进行结构化和芯片的最终组装
[0219]
在制造模具之后，通过将其与其固化剂(来自dow的sylgard
tm 184有机硅弹性体试剂盒，比率1:10)混合来制备聚二甲基硅氧烷(pdms)有机硅聚合物。使用干燥器和真空泵去除在混合期间形成的气泡。一旦pdms被脱气，将其倾倒至置于皮氏培养皿中的su
‑
8模具上，并放置在80℃的烘箱中至少2小时以完成交联过程。冷却后，将pdms剥离，并用圆形刀片切割以获得圆柱形形状的装置。然后用冲头刺穿得到的pdms以形成待包含化学引诱物的中心孔。最后的步骤包括将pdms黏合在玻璃衬底上以封装通道。该过程通过使用o2或空气等离子体发生器活化pdms表面以将pdms的si
‑
ch3官能团转化成si
‑
oh来实现。在与玻璃(sio2)接触后，将能够产生永久的si
‑
o
‑
si共价键。
[0220]
d)电检测仪器
[0221]
芯片配备有叉指电极(距离：15μm)，其施加足够强的电场(2000v/cm至5000v/cm)，来引起特定细胞的不可逆电穿孔，从而诱导已经穿透系统的细胞的细胞凋亡或坏死。在芯片上(on
‑
chip)应用的过程中，方波信号(电压/频率/高压时间：3v至7.5v/1hz/100μs)由功能发生器(tg2511a tti)输出，并且由示波器(tbs1032b tektronix)显示。示波器的第二通
道连接到高精度分流电阻(0.1w，来自vishay的lvr01r1000fe70)，产生流过电极(4)的电流的图像。为了使实验自动化，该仪器通过usb连接线连接到计算机(raspberry pi 3 model b ，操作系统：linux raspbian 9(stretch))。“虚拟仪器软件架构”(visa)通信由“开放源”pyvisa库确保，并且由操作系统的crontab程序定期执行python脚本。
[0222]
e)释放基质的制造
[0223]
将3％(w/v)海藻酸盐水溶液沉积在具有芯片贮存器形状的多孔模具中。在氯化钙交联浴中浸泡模具24小时，在用milli
‑
q水洗涤3次之后，在
‑
20℃冷冻基质，并且随后冻干。
[0224]
然后，将基质轻轻置于芯片中。
[0225]
实施例2：细胞因子释放曲线的研究
[0226]
(a)为了保护化学引诱物化合物sdf
‑
1使其免受体外和体内的酶促蛋白水解作用，通常以1.51分子牛血清白蛋白(bsa)和10分子sdf
‑
1的比率将化学引诱物化合物sdf
‑
1与bsa复合。bsa是一个6kda的大的胎牛血清蛋白，而sdf
‑
1是一个8kda的小的细胞因子。由于sdf
‑
1从基质中释放是通过扩散作用进行的，具有最大流体动力学半径的分子将对复合物的扩散具有最大影响：即bsa。因此，作为第一步，使用该模型来研究sdf
‑
1化合物从根据实施例1制造的微流控芯片释放的释放曲线。为了最大限度地检测纳米级的浓度，我们选择通过高效液相色谱(hplc)耦合荧光检测器来检测偶联有异硫氰酸荧光素(fitc)的bsa。
[0227]
样品制备：
[0228]
‑
在包含在芯片中的冻干海藻酸盐基质上沉积3.2μg的bsa
‑
fitc；
[0229]
‑
在37℃下温育30分钟。
[0230]
研究开始：
[0231]
‑
在气密箱中，将芯片浸没在1.5ml pbs中。
[0232]
‑
在37℃的摇动下持续温育研究持续时间，即50天。
[0233]
‑
在不同时间，对释放溶液取样750μl，通过hplc(水/乙腈)对样品进行分析。
[0234]
所使用的色谱柱是设计用于检测诸如bsa
‑
fitc等蛋白质的色谱柱。
[0235]
‑
向释放介质中添加750μl新pbs，以补偿先前的样品。
[0236]
结果：
[0237]
该研究证实了从包含在根据本发明微流控芯片中的海藻酸盐基质持续释放bsa
‑
fitc达50天，在50天后实现了99％的释放(图21)。
[0238]
(b)在第二步中，使用elisa检测法对50天时间段内从海藻酸盐基质释放的sdf
‑
1进行定量。
[0239]
样品制备：
[0240]
‑
sdf
‑
1与bsa的复合(0.1％)；
[0241]
‑
在冻干海藻酸盐基质上沉积1μg的sdf
‑
1；
[0242]
‑
在37℃下温育30分钟。
[0243]
研究开始：
[0244]
‑
在气密箱中，将基质浸没在1.5ml pbs中；
[0245]
‑
在37℃的摇动下持续温育研究持续时间，即50天。
[0246]
‑
根据供应商的说明，在不同时间，取750μl释放溶液样品，通过专用于检测sdf
‑
1的elisa试剂盒对其进行分析。
[0247]
‑
向释放溶液中加入750μl新pbs，以补偿先前的样品。
[0248]
结果：
[0249]
该研究证实了仅在23天时间内从海藻酸盐基质持续释放sdf
‑
1，而在23天后实现了40％的释放(图22)。
[0250]
实施例3：体外微流控芯片的实施
[0251]
a)对芯片内细胞的吸引能力
[0252]
在体外实施微流控芯片以测试其吸引mda
‑
mb
‑
231乳腺癌细胞的能力，所述细胞是乳腺肿瘤的上皮细胞。化合物“基质细胞衍生因子”sdf
‑
1是能够吸引mda
‑
mb
‑
231细胞的化学引诱物化合物。
[0253]
1)在d0时对用绿色荧光蛋白(gfp)稳定转染的mda
‑
mb
‑
231细胞进行胰蛋白酶处理。然后，将20000个细胞接种于中心放置有微流控芯片的35mm皮氏培养皿中。在dulbecco改进的eagle培养基/营养混合物f
‑
12(dmem f12) 谷氨酰胺 1％胎牛血清 1％抗生素(链霉素，青霉素)中培养细胞。
[0254]
微流控芯片的中心贮存器装载有33μl的dmem f12 谷氨酰胺 1％胎牛血清 1％抗生素(链霉素、青霉素)(图8)，或33μl的dmem f12 谷氨酰胺 10μl纯胎牛血清 1％抗生素(链霉素、青霉素)(图9)。在5％co2和95％湿度的培养箱中培养7天后，使用倒置荧光显微镜拍摄照片。
[0255]
发现细胞在两种测试条件下均朝向贮存器移动，并且还特别地移动到贮存器中，其中在贮存器内存在10μl纯胎牛血清的情况下细胞数量更大。
[0256]
2)在d0时对用绿色荧光蛋白(gfp)稳定转染的mda
‑
mb
‑
231细胞进行胰蛋白酶处理。然后，将100000个细胞接种于中心放置有微流控芯片的50mm直径的皮氏培养皿中。在dulbecco改进的eagle培养基/营养混合物f
‑
12(dmem f12) 谷氨酰胺 1％胎牛血清 1％抗生素(链霉素，青霉素)中培养细胞。
[0257]
微流控芯片的中心贮存器装载有50μl的dmem f12 谷氨酰胺 1％胎牛血清 1％抗生素(链霉素、青霉素)(图10和图11)，或50μl的dmem f12 谷氨酰胺 10μl胎牛血清 1％抗生素(链霉素、青霉素)(图12和图13)，或50μl的dmem f12 谷氨酰胺 1μg sdf
‑
1 1％抗生素(链霉素、青霉素)(图14和图15)。
[0258]
在5％co2和95％湿度的培养箱中培养8天之后，使用倒置荧光显微镜拍摄照片。
[0259]
在所有测试条件下，特别是在胎牛血清梯度(图12和图13)的存在下，甚至更显著地在化合物sdf
‑
1梯度(图14和图15)存在下，发现细胞朝向贮存器移动，并且还特别地移动到贮存器中。
[0260]
b)叉指电极破坏细胞的能力
[0261]
1)对叉指电极产生电场以破坏mda
‑
mb
‑
231细胞的能力进行了测试。为此，在d0时对用绿色荧光蛋白(gfp)稳定转染的mda
‑
mb
‑
231细胞进行胰蛋白酶处理。然后将60000个细胞接种在固定于载玻片上的pdms孔中，其中设置有圆形的叉指电极。所使用的培养基是：dmem f12 谷氨酰胺 10％胎牛血清 1％抗生素(链霉素，青霉素)。
[0262]
在5％co2和95％湿度的培养箱中培养48小时之后，获得覆盖整个载玻片(其含有叉指电极)的细胞单层(图16)，然后通过在载玻片上施加5v 100μs 1hz的电场以来电穿孔细胞，3小时后用倒置荧光显微镜拍摄照片(图17)。
[0263]
观察到约70％的细胞在电穿孔之后3小时后被破坏。
[0264]
2)测试了根据本发明的微流控芯片吸引mda
‑
mb
‑
231细胞和通过电穿孔破坏该细胞的能力。
[0265]
为此，在d0时对用绿色荧光蛋白(gfp)稳定转染的mda
‑
mb
‑
231细胞进行胰蛋白酶处理。然后将50000个细胞接种在50mm直径的皮氏培养皿中，微流控芯片包括叉指电极和置于该皮氏培养皿中心的两个微通道网络。
[0266]
在dulbecco改进的eagle培养基/营养混合物f
‑
12(dmem f12) 谷氨酰胺 1％胎牛血清 1％抗生素(链霉素，青霉素)中培养细胞。
[0267]
测试了三个条件：
[0268]
‑
在没有梯度也没有脉冲电场的情况下，向芯片的中心贮存器装载50μl的dmem f12 谷氨酰胺 1％胎牛血清 1％抗生素(链霉素、青霉素)(图18)。
[0269]
‑
在没有脉冲电场的情况下，向芯片的中心贮存器装载50μl的dmem f12 谷氨酰胺 sdf
‑
1 1μg 1％抗生素(链霉素、青霉素)(图19)。
[0270]
‑
在有脉冲电场的情况下，向芯片的中心贮存器装载50μl的dmem f12 谷氨酰胺 sdf
‑
1 1μg 1％抗生素(链霉素、青霉素)(图20)。
[0271]
在培养3天之后，在5％co2和95％湿度的培养箱中培养7天，期间每3小时在c条件(5v 100ms 1hz)下施加电穿孔。使用倒置荧光显微镜拍摄照片。
[0272]
该研究证明，在化学引诱物sdf
‑
1梯度的存在下且不存在电场的情况下，mda
‑
mb
‑
231细胞被吸引到中心贮存器，并且保持在两个微通道网络之间的空间中。
[0273]
在化学引诱物sdf
‑
1和每3小时(5v 100μs 1hz)施加的脉冲电场的存在下，细胞穿过微通道的第一网络并且被电穿孔。
[0274]
在所有情况下，细胞不能跨越两个微通道网络。
[0275]
这些不同的实验已经证明了微流控芯片吸引和破坏生物元件的能力，并且特别地证明了，所述芯片能够在胎牛血清梯度下，更显著地在化学引诱物sdf
‑
1的梯度下，吸引乳腺癌肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231)，并且可以通过脉冲电场破坏这些种类的肿瘤细胞。