密集聚集的分析物层和检测方法与流程

技术特征：
1.一种用于对以高密度布置在基底的表面上的多个分析物进行测序的方法，所述方法包括：(a)提供包括表面的基底，其中所述表面是非图案化的并且包括多个分析物，所述多个分析物以使得所述多个分析物的分析物的结合位置之间的最小有效间距小于λ/(2*na)的密度布置在所述表面上，其中na是所述光学成像模块的数值孔径，并且其中所述表面包含用于合成测序法的试剂；(b)执行探针结合至所述多个分析物的多个循环，所述多个循环中的循环包括：(i)使所述多个分析物与多个探针接触，所述多个探针中的探针包含可检测标记；(ii)用光学系统对所述表面的区域进行成像，以检测来自与所述多个分析物接触的每个探针的光学信号，从而在所述循环中检测所述区域中的多个光学信号；(c)从来自所述多个循环中的至少两个循环的所述区域的图像的所述多个光学信号中的每个确定峰位置；(d)将每个光学信号的所述峰位置叠加，并在每个光学信号簇处应用光学分布模型，以确定每个检测到的探针在所述表面上的相对位置；(e)使用所述确定的相对位置和一分辨函数来分辨来自每个循环的每个区域图像中的所述光学信号；(f)从所述反卷积光学信号鉴定每个区域和每个循环的所述可检测标记；以及(g)在每个分析物位置处，从所述多个循环中的所述鉴定的可检测标记鉴定布置在所述基底的表面上的分析物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个分析物中的一个或多个分析物用拒斥物质或吸引物质处理。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述拒斥物质或吸引物质包含两性离子特征。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述拒斥物质或吸引物质包括peg、多糖、安福灵两性电解质、磺基甜菜碱和/或bsa。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物是dna串联体。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述dna串联体与ssdna丝杂交。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物是蛋白质或肽。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针包含多个可逆终止子核苷酸。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多个可逆终止子核苷酸包括至少四个不同的核苷酸，每个核苷酸具有不同的可检测标记。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述分辨包括：使用来自所述确定的相对位置的所述相邻多核苷酸之间的中心到中心距离，从相邻多核苷酸去除干扰光学信号。11.根据权利要求4所述的方法，其中所述分辨函数包括反卷积。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸密集聚集在所述基底上，使得由来自掺入相邻多核苷酸的核苷酸的所述可检测标记发射的光学信号之间存在重叠，并且其中所述相邻多核苷酸各自包含不同的序列。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸以每平方微米多于4个分子的平均密度沉积在所述表面上。14.根据权利要求1所述的方法，其中沿着所述图像区域的轴以每300nm一个像素或更
高的分辨率执行所述表面的所述成像。15.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：从每个循环的所述区域图像中的每个产生具有较高像素密度的过采样图像。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述叠加所述峰位置包括对准在多个所述循环的每个区域中检测到的所述光学信号峰的位置，以产生来自所述多个循环的每个多核苷酸的光峰位置的簇。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述叠加所述峰位置包括对准在所述循环的子集的每个区域中检测到的所述光学信号峰的位置，以产生来自所述循环的子集的每个多核苷酸的光峰位置的簇。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述光学分布模型包括点扩展函数。19.根据权利要求1所述的方法，其中沉积到所述基底的表面的所述分析物的所述相对位置在l0 nm rms内确定。20.一种用于精确确定沉积在密集聚集的基底的表面上的分析物的相对位置的方法，所述方法包括：(a)提供包括表面的基底，其中所述表面被图案化或非图案化并且包括沉积在所述表面上离散位置处的多个分析物；(b)在所述表面上执行探针结合和信号检测的多个循环，每个循环包括：(i)使所述分析物与来自探针组的多个探针接触，其中所述探针包含可检测标记，其中每个所述探针特异性地结合靶分析物；以及(ii)用光学系统对所述表面的区域进行成像，以检测来自与所述表面上离散位置处的所述分析物结合的单个探针的多个光学信号；(c)从来自所述多个循环中的至少两个循环的所述区域的图像的所述多个光学信号中的每一个确定峰位置；以及(d)将每个光学信号的所述峰位置叠加，并在每个光学信号簇处应用一光学分布模型，以提高的精度确定每个检测到的分析物在所述表面上的相对位置。21.根据权利要求20所述的方法，所述方法进一步包括：(a)使用所述确定的相对位置和分辨函数来分辨来自每个循环的每个区域图像中的所述光学信号；以及(b)从所述反卷积的光学信号中，针对每个区域和每个循环鉴定与所述沉积的分析物结合的所述可检测标记。22.根据权利要求20所述的方法，其中所述多个分析物中的一个或多个分析物用拒斥物质或吸引物质处理。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述拒斥物质或吸引物质包含两性离子特征。24.根据权利要求22所述的方法，其中所述拒斥物质或吸引物质包括peg、多糖、安福灵两性电解质、磺基甜菜碱和/或bsa。25.根据权利要求20所述的方法，其中所述分析物是dna串联体。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述dna串联体与ssdna丝杂交。27.根据权利要求20所述的方法，其中所述分析物是蛋白质或肽。28.根据权利要求21所述的方法，所述方法进一步包括：对在每个循环中检测到的每个
分析物使用所述可检测标记鉴定，以鉴定所述基底上的多个所述分析物。29.根据权利要求21所述的方法，其中所述分辨包括：使用来自所述相邻分析物的所述确定的相对位置的所述相邻分析物之间的中心到中心距离，从相邻多核苷酸去除干扰光学信号。30.根据权利要求21所述的方法，其中所述分辨函数包括反卷积。31.根据权利要求20所述的方法，其中所述分析物是单个生物分子。32.根据权利要求20所述的方法，其中沉积在所述表面上的所述分析物的间隔平均小于可检测标记所发射的并由光学系统成像的光的衍射极限。33.根据权利要求20所述的方法，其中沉积的分析物包括每个分析物和最近的相邻分析物之间小于500nm的平均中心到中心距离。34.根据权利要求20所述的方法，其中所述叠加所述峰位置包括对准在多个所述循环的每个区域中检测到的所述光学信号峰的位置，以产生来自所述多个循环的每个分析物的光峰位置的簇。35.根据权利要求20所述的方法，其中所述相对位置以l0纳米rms内的精度确定。36.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法分辨来自以每平方微米约4至约25个分析物的密度的表面的光学信号。37.一种用于确定多个分析物的标识的系统，所述系统包括：(a)光学成像装置，其被配置为在探针与沉积在基底的表面上的分析物结合的多个循环中对来自所述基底的区域的多个光学信号成像，其中所述表面是非图案化的；以及(b)图像处理模块，所述模块被配置为：(i)从来自所述多个循环中的至少两个循环的所述区域的图像的所述多个光学信号中的每一个确定峰位置；(ii)通过将光学分布模型应用于来自所述多个循环的每个光学信号簇，以提高的精度确定每个检测到的分析物在所述表面上的相对位置；以及(iii)使用所述确定的相对位置和一分辨函数来反卷积来自每个循环的每个区域图像中的所述光学信号。38.根据权利要求37所述的系统，其中所述图像处理模块还被配置为使用所述反卷积的光学信号来确定沉积在所述表面上的所述分析物的标识。39.根据权利要求37所述的系统，其中所述光学成像装置包括限定可扫描区域的可移动台。40.根据权利要求37所述的系统，其中所述光学成像装置包括传感器和光学放大器，所述传感器和光学放大器被配置为在所述可扫描区域中以低于衍射极限对基底的表面进行采样。41.根据权利要求37所述的系统，所述系统进一步包括基底，所述基底包括以低于衍射极限的中心到中心间距沉积到所述基底的非图案化表面的分析物。42.根据权利要求37所述的系统，其中所述分辨包括使用相邻分析物之间的中心到中心距离从所述相邻分析物去除干扰光学信号，以确定所述相邻分析物的所述相对位置。43.一种用于处理或分析多个分析物的方法，所述方法包括：(a)将所述多个分析物以最小有效间距小于λ/(2*na)的测量值的密度相邻于基底的表
面布置，其中所述表面是非图案化的；(b)在探针与相邻所述基底布置的所述多个分析物的分析物结合的一个或多个循环中，从所述基底获得多个光学信号，其中所述多个光学信号的至少一个子集叠加，所述多个光学信号包括具有波长λ的光；(c)应用成像算法来处理所述多个光学信号，以鉴定所述多个分析物的分析物的位置或所述分析物相对于所述多个分析物中的另一个分析物的相对位置；以及(d)使用所述位置或相对位置来鉴定所述多个分析物中的所述分析物。44.根据权利要求43所述的方法，其中所述多个分析物中的一个或多个分析物用拒斥物质或吸引物质处理。45.根据权利要求44所述的方法，其中所述拒斥物质或吸引物质包含两性离子特征。46.根据权利要求44所述的方法，其中所述拒斥物质或吸引物质包括peg、多糖、安福灵两性电解质、磺基甜菜碱和/或bsa。47.根据权利要求43所述的方法，其中所述分析物是dna串联体。48.根据权利要求47所述的方法，其中所述dna串联体与ssdna丝杂交。49.根据权利要求43所述的方法，其中所述分析物是蛋白质或肽。50.根据权利要求43所述的方法，其中步骤(b)进一步包括配置光学处理模块以叠加来自探针与分析物结合的所述一个或多个循环的所述多个光学信号，并且步骤(c)进一步包括应用光学分布模型至所述多个光学信号的所述叠加以确定每个检测到的分析物的相对位置。51.根据权利要求43所述的方法，其中所述成像算法包括分辨函数。52.根据权利要求51所述的方法，其中所述分辨函数包括反卷积。53.根据权利要求50所述的方法，其中所述分辨函数包括使用相邻分析物之间的中心到中心距离从所述相邻分析物去除干扰光学信号。54.根据权利要求43所述的方法，其中所述多个分析物以每平方微米约1至25个分子的密度相邻所述基底布置。55.根据权利要求43所述的方法，其中光学成像模块被配置成以每300纳米一个像素或更高的分辨率获得所述多个光学信号。56.一种控制沉积在非图案化表面上的多个分析物的分析物之间的平均最小中心到中心距离的分布的方法，所述方法包括用拒斥物质或吸引物质处理所述一个或多个分析物。57.根据权利要求56所述的方法，其中所述拒斥物质或吸引物质包含两性离子特征。58.根据权利要求57所述的方法，其中所述拒斥物质或吸引物质包括peg、多糖、安福灵两性电解质、磺基甜菜碱和/或bsa。59.根据权利要求56所述的方法，其中所述分析物是dna串联体。60.根据权利要求59所述的方法，其中所述dna串联体与ssdna丝杂交。61.根据权利要求56所述的方法，其中所述分析物是蛋白质或肽。62.根据权利要求56所述的方法，其中多个分析物中的一个或多个分析物之间的所述平均最小中心到中心距离小于约500纳米。63.根据权利要求56所述的方法，其中多个分析物中的一个或多个分析物之间的所述平均最小中心到中心距离是约315纳米。
64.根据权利要求56所述的方法，其中多个分析物中的一个或多个分析物之间的所述平均最小中心到中心距离是约250纳米。65.根据权利要求56所述的方法，其中所述用拒斥物质或吸引物质处理所述一个或多个分析物包括在将所述多个分析物沉积到所述表面之前将所述拒斥物质或吸引物质施用到所述非图案化表面。66.一种控制沉积在非图案化表面上的多个分析物的一个或多个分析物之间的平均最小中心到中心距离的分布的方法，所述方法包括：(a)用拒斥物质或吸引物质处理所述一个或多个分析物；(b)将所述多个分析物暴露于气
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液界面，使得所述多个分析物形成沉积在所述非图案化表面上的分析物单层。67.根据权利要求66所述的方法，其中所述气
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液界面是空气
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水界面。68.根据权利要求66所述的方法，其中(c)中的沉积包括拉或拖。69.根据权利要求66所述的方法，其中多个分析物中的一个或多个分析物之间的所述平均最小中心到中心距离小于约500纳米。70.根据权利要求66所述的方法，其中多个分析物中的一个或多个分析物之间的所述平均最小中心到中心距离是约315纳米。71.根据权利要求66所述的方法，其中多个分析物中的一个或多个分析物之间的所述平均最小中心到中心距离是约250纳米。72.一种系统，所述系统包括与表面相邻的多个核酸分子，其中所述多个核酸分子中的相邻核酸分子具有至少10纳米的平均中心到中心间距并且彼此不接触。73.根据权利要求72所述的系统，其中所述表面是非图案化的。74.根据权利要求72所述的系统，其中所述多个核酸分子是多个串联体。75.根据权利要求72所述的系统，其中所述平均中心到中心间距小于约500纳米。76.一种方法，所述方法包括与表面相邻的多个核酸分子，其中所述多个核酸分子中的相邻核酸分子具有至少10纳米的平均中心到中心间距并且彼此不接触。77.根据权利要求76所述的方法，其中所述表面是非图案化的。78.根据权利要求76所述的方法，其中所述多个核酸分子是多个串联体。79.根据权利要求76所述的方法，其中所述平均中心到中心间距小于约500nm。

技术总结
本文公开了用于检测和区分来自密集聚集的基底的光学信号的方法和系统。这些方法和系统在接近或低于光学系统衍射极限的生物分子检测方面具有广泛的应用，包括提高多核苷酸测序应用的效率和精度。序应用的效率和精度。序应用的效率和精度。


技术研发人员：丹尼斯
受保护的技术使用者：雅普顿生物系统公司
技术研发日：2019.09.18
技术公布日：2021/11/19