用于治疗癌症的HDM2抗体的制作方法

用于治疗癌症的hdm2抗体
1.相关申请的交叉引用
2.本技术本技术要求2019年2月20日提交的序列号为62/808,073的美国临时专利申请的优先权，并通过引用将其全部内容合并于此。


背景技术：

3.已经开发出靶向癌细胞内p53蛋白的癌症治疗方法。然而，某些类型的癌细胞不含p53，而其它癌细胞表现出突变的和/或失活形式的p53。因此，这些通过p53靶向癌症的治疗是有限的，因为它们不会在上述类型的癌细胞中引起细胞死亡。所以，靶向p53的癌症治疗在用于各种类型的癌症时是无效的。有效的癌症治疗仍然遥不可及。
4.因此，仍然需要改进的方法来治疗癌症。


技术实现要素：

5.一方面，本发明提供了对hdm
‑
2、hdm
‑
2剪接变体或其片段具有选择性的抗体或抗体片段。
6.一方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括，或者由、基本上由以下组成：向有需要的受试者施用治疗量的对膜结合hdm
‑
2及其任意剪接变体具有选择性的抗体或抗体片段。
7.一方面，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括，或者由、基本上由以下组成：向有需要的受试者施用治疗有效量的对hdm
‑
2或其片段具有选择性的抗体或抗体片段，其中所述癌症包括急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、多发性骨髓瘤、胆管、胆道、骨髓增生异常综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、单核细胞白血病、组织细胞性淋巴瘤、早幼粒细胞白血病、白血病干细胞，神经内分泌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞肿瘤/癌症、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾细胞癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文氏肉瘤、burkitts/
‑
b细胞急性淋巴细胞白血病(burkitts/all
‑
bcell)、t细胞
‑
急性淋巴细胞白血病(t
‑
all)、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺癌、膀胱癌、头颈部癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺癌、胃肠道间质瘤(gist)、表皮样、浆细胞、皮肤t细胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、结肠癌、结肠癌干细胞、白血病干细胞、卵巢癌、前列腺癌和宫颈癌。
具体实施方式
8.本文提供了治疗癌症的方法及组合物，包括向有需要的受试者施用对hdm
‑
2、其剪接变体及其片段具有选择性的抗体。
9.如本文所用，术语“抗体”是指多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、非人物种特异性抗体、合成抗体、单链抗体、嵌合抗体、人类抗体、亲和成熟抗体、双特异性抗体中的任何一种，以及包含至少一个互补决定区的这些分子的片段。
10.抗体可以是骆驼来源单域抗体或其部分。在一个实施方案中，骆驼来源单域抗体包括在骆驼科动物中发现的重链抗体或vhh抗体。骆驼科动物(例如骆驼、单峰驼、美洲驼和羊驼)的vhh抗体是指骆驼科动物单链抗体的可变片段(参见nguyen et al,2001；muyldermans,2001)，还包括骆驼科动物分离的vhh抗体、重组vhh抗体或合成vhh抗体。
11.例如，抗体片段包括scfv、sdab、di
‑
scfv和tri
‑
scfv。scfv是单链可变片段。sdab是单域抗体。scfv包括抗体的vh和vl结构域，并通过接头连接。di
‑
scfv包括两个通过接头连接的scfv分子。tri
‑
scfv包括三个通过接头连接的scfv分子。
12.所述抗体对hdm
‑
2的表面暴露部分具有选择性。在一个实施方案中，所述抗体对hdm
‑
2的p53结合位点具有选择性。在一个实施方案中，所述抗体对hdm
‑
2的残基1
‑
109、hdm
‑
2的残基1
‑
50、hdm
‑
2的残基25
‑
75、hdm
‑
2的残基50
‑
109、hdm
‑
2的残基1
‑
491，或其部分具有选择性。在一个实施方案中，所述抗体对hdm
‑
2剪接变体具有选择性。
13.在许多抑癌因子和致癌基因中发现了由选择性mrna剪接产生的基因转录变体。选择性mrna剪接有时是外显子跳跃的结果。因此，mrna剪接可能导致蛋白不表达或蛋白表达量小于wt蛋白(截短蛋白)。hdm
‑
2剪接变异体的分子量可以为30
‑
90kd、10
‑
50kd、50
‑
90kd或75
‑
110kda。
14.在一些实施方案中，hdm
‑
2的剪接变体的最小分子量为约1千道尔顿(kda)、5kda、10kda、15kda、20kda、25kda、30kda、40kda、50kda、60kda或75kda。
15.在一个实施方案中，hdm
‑
2的剪接变体的最大分子量为约30kda、35kda、40kda、45kda、50kda、60kda、75kda、80kda、90kda、95kda、100kda或110kda。
16.hdm
‑
2剪接变异体的实例包括mdm2
‑
a、mdm2
‑
b、mdm2
‑
c、mdm2
‑
d、mdm2
‑
e、mdm2
‑
a1、mdm2
‑
kb2、mdm2
‑
kb3、mdm2
‑
jn1、mdm2
‑
ds2、mdm2
‑
ds3、mdm2
‑
is1、mdm2
‑
gk1、mdm2
‑
pm2、mdm2
‑
eu2、mdm2
‑
bl、mdm2
‑
n、mdm2
‑
fb25、mdm2
‑
fb26、mdm2
‑
fb28、mdm2
‑
fb29、mdm2
‑
fb30、mdm2
‑
fb55、mdm2
‑
281bp、mdm2
‑
219bp、mdm2
‑
254bp、mdm2
‑
f、mdm2
‑
g、mdm2
‑
h、mdm2
‑
ln229a、mdm2
‑
ln229b、mdm2
‑
ln18、mdm2
‑
g116、mdm2
‑
g150、mdm2
‑
var2、mdm2
‑
var1、mdm2
‑
delf、mdm2
‑
dele和mdm2
‑
fb60(参见rosso m.,okoro d.e.,bargonetti j.(2014)splice variants of mdm2 in oncogenesis.in:deb s.,deb s.(eds)mutant p53 and mdm2 in cancer.subcellular biochemistry,vol 85.springer,dordrecht；其内容通过引用并入本文)。
17.在一个实施方案中，本文所述的抗体包括对至少第一靶点和第二靶点具有选择性的抗体或抗体片段，其中第一靶点和第二靶点不同。在该实施方案中，抗体可以对第一靶点、第二靶点和第三靶点具有选择性。三个靶点可以是同一靶点抗原蛋白上的三个不同表位，三个不同靶点抗原蛋白上的三个不同表位，或第一靶点抗原蛋白上的两个不同表位与第二靶点抗原蛋白上的一个表位。
18.在一个实施方案中，本文所述的抗体包括对第一靶点和第二靶点选择性的抗体或抗体片段中的一种或多种，其中第一靶点和第二靶点不同。这些抗体也称为双特异性抗体。两个靶点可以是同一靶点抗原蛋白上的两个不同表位，也可以是两个不同靶点抗原蛋白上的两个不同表位。第一靶点包括hdm2，第二靶点选自cd3(募集细胞毒性t细胞)、cd16(fcγriii)(募集adcc的其他效应细胞)、cd56(募集nk细胞)和cd28。
19.双特异性抗体可来源于两种不同抗体的抗原结合位点或其片段。
20.双特异性抗体也可以通过将抗体与未修饰的重链恒定区组装来产生，例如通过来自两种不同抗体的重链的异二聚化或通过附加结合位点延伸的重链的同二聚化。
21.双特异性抗体也可通过使用经修饰的重链以强制异二聚化来产生(例如，使用旋钮
‑
进入孔策略(knos
‑
into
‑
holes))。
22.或者，两种不同的抗体片段，如scfv，可以与非免疫球蛋白蛋白(如白蛋白)融合，或通过化学接头(如peg)融合。此外，两个抗原结合片段可以直接融合，产生小的双特异性抗体分子。双特异性抗体也可以通过两种不同抗体的化学结合产生。
23.双特异性抗体也可以通过两种不同的完整抗体的化学结合产生。
24.在一个实施方案中，本发明提供了双特异性抗体及其用途，其中第一靶点包括hdm
‑
2的残基1
‑
109、hdm
‑
2的残基1
‑
50、hdm
‑
2的残基25
‑
75、hdm
‑
2的残基50
‑
109、hdm
‑
2的残基1
‑
491，或其部分；第二靶点包括cd3、cd16(fcγriii)、cd56或cd28。
25.在一个实施方案中，本发明提供了双特异性抗体及其用途，其中所述第一靶点包括hdm
‑
2剪接变体(如上所述)；第二靶点包括cd3、cd16(fcγriii)、cd56或cd28。
26.在一个实施方案中，本文公开的抗体包括fc区或fc区的部分。在一个实施方案中，本文公开的抗体不包括fc区或fc区的部分。
27.在一个实施方案中，本发明的抗体包括单克隆抗体。
28.本发明的抗体和抗体片段不与成孔剂、毒素、药物、化学治疗剂或放射性核素结合。
29.在一个实施方案中，本发明的方法包括共同施用未与抗体结合的化学治疗剂。
30.在一个实施方案中，本发明的方法包括共同施用免疫系统调节剂。在一个实施方案中，抗体包括免疫系统调节剂。免疫系统调节剂的实例包括fc受体结合域和c1复合物结合域。
31.在另一个实施方案中，本发明的方法还可以包括通过诊断成像(包括mri、pet扫描和x射线)确定本发明的组合物或方法能否减缓癌症的步骤。
32.在另一个实施方案中，本发明的方法还可以包括通过测量血清生物标志物的水平来确定本发明的组合物能否引起癌细胞坏死、膜溶解或穿孔的步骤。在一个实施方案中，血清生物标志物是ldh、细胞角蛋白或hdm
‑
2。在施用本文公开的组合物之前和之后测量血清生物标志物的水平。治疗前后的血清生物标志物增加表明癌细胞坏死、膜溶解或穿孔。在一个实施例中，前述的增加为大于2倍、大于3倍或大于5倍。
33.在一个实施方案中，本文所述的抗体通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(adcc)对癌细胞具有毒性。adcc过程是抗体结合靶细胞并募集效应细胞，通过非吞噬机制诱导靶细胞死亡的过程。为了使效应细胞发挥adcc效应，它必须表达将与抗体结合的fc受体(fcr)。已知的fcr分类包括结合igg的fcγr、结合iga的fcαr，以及结合ige的fcεr。fcγr是髓系细胞清除肿瘤细胞最重要的因子，由活化fcγri(cd64)、fcγriia(cd32a)、fcγriiia(cd16a)和抑制性fcγriib(cd32b)受体组成。一旦fcγr与抗体结合，就会引发受体交联和下游信号传播。通过其免疫受体酪氨酸激活基序激活fcγr信号，而通过其免疫受体酪氨酸抑制基序抑制fcγr信号。
34.在一个实施方案中，本文公开的抗体包括富集的adcc功能。在该实施方案中，抗体包括至少一个fc受体结合域。fc受体结合域包括fcγri结合域(cd64)、fcγriia(cd32)结
合域、fcγriiia(cd16a)结合域、fcγriiib(cd16b)结合域、fcεri结合域、fcεrii(cd23)结合域、fcαri(cd89)结合域、fcα/μr结合域或fcrn结合域。
35.在另一个实施方案中，本发明的方法还可以包括确定本发明的组合物或方法能否引起adcc和adcc水平的步骤。所述确定步骤可能有助于测量抗体质量、预测患者反应和治疗有效性。荧光测定技术可用于评估adcc水平。例如，可用荧光染料标记靶细胞，以允许通过流式细胞术灵敏地测定细胞毒性。当细胞被杀死时，它们释放乳酸脱氢酶和其他蛋白酶，这些蛋白酶可以通过提供荧光底物来定量，以便准确评估细胞毒性，而无需对靶细胞进行任何标记或操作。阻抗分析也可用于提供细胞介导的细胞毒性的定量测量，其可随时间连续测量adcc。来自供体的外周血单核细胞和纯化的nk细胞可用于定量adcc。在无需分离nk细胞的情况下，可使用临床可用的血样进行快速adcc报告分析，该分析可应用于癌症患者，以确定治疗的有效性。
36.在一个实施方案中，本文所述的抗体通过补体依赖性细胞毒性(cdc)对癌细胞具有毒性。在补体依赖性细胞毒性(cdc)中，c1q与抗体结合，这种结合引发补体级联反应，从而导致在靶细胞表面形成膜攻击复合物(mac)(c5b
‑
c9)，这即是补体经典激活途径的结果。人igg1和igg3的cdc效应子功能水平高，igg2水平低，igg4水平为零。
37.在一个实施方案中，本发明的抗体包括富集的cdc活性。在该实施方案中，抗体包括至少一个c1复合物结合域。
38.在另一个实施方案中，本发明的方法还可以包括确定本发明的组合物或方法能否引起cdc以及cdc水平的步骤。所述确定的步骤可能有助于测量抗体质量、预测患者反应和治疗的有效性。补体依赖性细胞毒性试验可用于检测和定量cdc。例如，在含有活性补体或热灭活补体的人血清存在时，将靶表达细胞与抗体一起孵育，并测量细胞裂解。
39.在另一个实施方案中，抗体包括一个或多个fc受体结合域和一个或多个c1复合物结合域。
40.在一个实施方案中，本文所述的方法包括向有需要的受试者施用富集adcc活性的抗体和富集cdc活性的抗体。
41.在一个实施方案中，本文所述的方法包括将具有hdm
‑
2结合组分和膜驻留组分的肽与抗体或抗体片段共同施用。hdm
‑
2结合组分与膜驻留组分结合。
42.定义
43.如本文所用，在抗体与靶点结合的上下文中，术语“选择性的”、“选择性结合”、“特异性结合”(specific binding)或“特异性地结合”(specificallybinding)是指该抗体的fab、单价部分或靶点结合部分以小于约1
×
10
‑6m(摩尔)的亲和力常数(kd)与靶抗原(例如hdm
‑
2)结合。当抗体对hdm
‑
2具有选择性时，其特异性结合hdm
‑
2。在某些实施方案中，表现出与抗原特异性结合的抗体将具有小于约1
×
10
‑7m、小于约1
×
10
‑8m、小于约1
×
10
‑9m、小于约1
×
10
‑
10
m、小于约1
×
10
‑
12
m、小于约1
×
10
‑
13
m、小于约1
×
10
‑
14
m、小于约1
×
10
‑
15
m或小于约1
×
10
‑
18
m的kd。
44.如果抗体或其片段、变体或衍生物与给定表位结合并在一定程度上阻断参考抗体或其抗原结合片段与该表位的结合，则称该抗体或其片段、变体或衍生物竞争性地抑制参考抗体或其抗原结合片段与该表位的结合。竞争抑制可以通过本领域已知的任何方法测定，包括但不限于竞争elisa测定法。在某些实施方案中，当抗体相对于参考抗体以等摩尔
或更高浓度提供时，如果抗体将参考抗体的结合减少至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％，则可以认为抗体竞争性地抑制参考抗体与给定表位的结合。
45.如本文所用，短语“亲和力成熟抗体”是指在一个或多个高变区(hvrs)中包含一种或多种改变的抗体，与缺乏这些改变的未改变的亲本抗体相比，所述改变提供了抗体对抗原的亲和力的改善。用于获得亲和成熟抗体的方法包括但不限于marks et al.bio/technology 10:779
‑
783(1992),barbas et al.,proc nat.acad.sci,usa 91:3809
‑
3813(1994)；schier et al.,gene 169:147
‑
155(1995)；yelton etal.,j.immunol.155:1994
‑
2004(1995)；jackson et al.,j.immunol.154(7):3310
‑
9(1995)；和hawkins et al.,j.mol.biol.226:889
‑
896(1992)中描述的技术。
46.如本文所用，在癌症或细胞增殖性疾病的上下文中，术语“治疗”是指与未接受所述药剂的受试者相比，给定癌症或细胞增殖性疾病相关的症状进展的任何缓解。
47.如本文所用，短语“治疗有效剂量”是指与未接受药剂的受试者相比，可改善给定疾病相关症状发作或症状进展的药剂剂量。
48.在整个说明书中，数量由具有下限和上限的范围以及下限或上限来定义。每个下限可以与每个上限组合，以限定一个范围。两个下限值可以组合来限定一个范围，两个上限值可以组合来限定一个范围。下限和上限应分别作为一个单独的元素。
49.此外，除非另有明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是排他性的“或”。例如，条件a或b满足以下任一条件：a为真(或存在)b为假(或不存在)、a为假(或不存在)b为真(或存在)、a和b均为真(或存在)。
50.在本说明书中，描述了包含多个组分的各种参数组。在一组参数中，每个组分可以与任何一个或多个其他组分组合，形成额外的子组。例如，如果一个组的组分是a、b、c、d和e，则特别考虑的额外的子组包括任何一个、两个、三个或四个组分，例如a和c；a、d和e；b、c、d和e；等等。
51.在整个说明书中对“一个实施方案(one embodiment)”、“一个实施方案(an embodiment)”、“一个实施例(one example)”或“一个实施例(an example)”的引用意味着，在本实施方案的至少一个实施方案中，包括结合该实施方案或实施例所描述的特定特征、结构或特性。因此，本说明书中出现的短语“在一个实施方案中(in one embodiment)”、“在一个实施方案(in an embodiment)”、“一个实施例(one example)”或“一个实施例(an example)”不一定都指同一实施方案或实施例。此外，在一个或多个实施方案或实施例中，特定特征、结构、实施方案或特性可以以任何合适的组合和/或子组合来进行组合。
52.实施例
53.实施例1
54.抗hdm
‑
2单克隆抗体的制备、表征及人源化。
55.制备表达hdm
‑
2或其片段的细胞，用含有25mm edta的磷酸盐缓冲液(pbs)收集并用于免疫balb/c小鼠。在第0、2、5和7周，向小鼠腹膜内注射0.5ml pbs中约100个细胞。在第9周和第13周，对具有免疫沉淀32p标记的hdm
‑
2或其片段的抗血清的小鼠腹膜内注射用麦胚凝集素
‑
琼脂糖(wga)纯化的hdm
‑
2膜提取物。然后静脉注射0.1ml的hdm
‑
2制剂，并将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系x63
‑
ag8.653融合。通过elisa和放射免疫沉淀对杂交瘤上清液进行hdm
‑
2结合筛选。
56.鼠单克隆抗体为人源化抗体，使用诸如公开号为5,821,337的美国专利中所记载的“基因转化诱变”策略，其公开的全部内容明确引入本文以作为参考。
57.实施例2
58.抗hdm
‑
2抗体的抗体噬菌体展示的制备、表征及人源化。
59.噬菌体展示技术与基于细胞的淘选策略相结合。
60.转染细胞并表达hdm
‑
2、其剪接变体或其片段。针对融合附着的单层或针对悬浮液中的细胞淘选噬菌体基因文库。噬菌体基因文库来源—来自免疫的人类供体血液样品的免疫基因文库；通用基因文库或部分基因文库(single
‑
pot libraries)；基于插入完全合成框架序列的随机cdr区域的合成通用基因文库:具有有限数量的重链和轻链原始可变区的半合成基因文库用于插入随机合成的cdr。原始的通用igm抗体库，其中的抗体编码基因来自众多供体的b细胞与不同的种族背景，确保了广泛覆盖世界等位基因多样性。在一个实施例中，应用了hal9/10人原始抗体基因文库。
61.肽配体的选择经过4～10轮生物淘选。在每一轮中，细胞与展示不同肽的噬菌体混合物共同孵育。洗掉不结合或仅结合细胞表面的噬菌体。保留与细胞结合并被细胞内化的噬菌体。这些细胞内化的噬菌体在细菌中扩增、分离并用于下一轮生物淘选的输入。在每一轮淘选中，噬菌体样品的多样性降低，而展示介导细胞特异性结合的肽的噬菌体的比例增加。
62.使用封闭剂，如牛血清白蛋白(bsa)、牛奶或酪蛋白，可减少非特异性结合事件。表达相同靶抗原的细胞系可用于帮助消除任何不相关的结合物。可选地，或另外的，在用纯化形式的抗原包被的乳胶珠和表达相同抗原的细胞之间的淘选轮次交替进行。
63.在表1中肽浓度增加的情况下进行后续一轮淘选。在表1中的肽存在下进行淘选将增加肽对膜结合的hdm
‑
2靶点的亲和力。
64.生物淘选步骤的孵育在4℃下进行2～16小时。也可在20℃或37℃下孵育1～20小时。
65.噬菌体回收可在下列至少一种条件下进行：低ph值、碱性条件、非变性洗涤剂(np
‑
40或吐温20)，或用对数生长期的大肠杆菌直接感染细胞结合噬菌体。
66.任选地，噬菌体展示与轻链改组结合使用，以利用来自人类抗体基因获得的10
18
种不同重链/轻链组合的完整理论组合库，从而提供最佳的亲和力和动力学特性。轻链改组与抗体淘选子集的重链和原始文库的全部轻链结合。然后在改进的条件下重新筛选这些子文库，以获得具有高级特性(如跨物种反应性或更高亲和力)的抗体。
67.检测抗体诱导cdc和/或adcc的能力。
68.分离的克隆用于制备单克隆抗体。
69.表1:可溶性竞争肽
[0070][0071][0072]
实施例3
[0073]
应用抗hdm2抗体进行cdc检测。
[0074]
抗人/小鼠/大鼠hdm2多克隆抗体(af1244
‑
sp.r&d system)与mv4
‑
11细胞在人血清或兔血清存在下孵育。人血清从健康的人类供体中分离。兔血清从不相关的抗原免疫的
兔中分离。mv4
‑
11细胞(人源急性单核细胞性白血病细胞)。
[0075]
cdc检测的原理是：细胞膜表面的抗体
‑
抗原免疫复合物通过激活c1复合物(c1qrs)引发补体系统经典途径，引发连锁反应形成mac(膜攻击复合物)，引起细胞膨胀和破裂。
[0076]
将从30μg/ml开始的3倍系列稀释度的60μl抗体与40μl血清混合，然后将混合物加入到48孔板中的100μl的mv4
‑
11细胞(2x105/ml)中。在37℃孵育24小时后，通过流式细胞术检查细胞活力。记录活细胞计数(dapi
‑
)，并计算裂解率：％特异性裂解＝(纯细胞
–
细胞抗体(ab)复合物)/纯细胞
×
100％。
[0077]
cdc诱导的细胞毒性通过测试样本的细胞活力除以对照(未添加抗体)的细胞活力来测量。细胞裂解呈抗体剂量依赖性。添加30μg/ml抗hdm2抗体时，兔血清可诱导最大特异性裂解约30％。人血清诱导细胞裂解的程度较低。
[0078]
实施例4
[0079]
用hdm2抗体进行cdc检测。
[0080]
针对hdm2抗体和下列癌细胞进行cdc检测：急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、多发性骨髓瘤、胆管、胆道、骨髓增生异常综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、单核细胞白血病、组织细胞性淋巴瘤、早幼粒细胞白血病、白血病干细胞，神经内分泌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞肿瘤/癌症、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾细胞癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文氏肉瘤、burkitts/
‑
b细胞急性淋巴细胞白血病(burkitts/all
‑
bcell)、t细胞
‑
急性淋巴细胞白血病(t
‑
all)、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺癌、膀胱癌、头颈部癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺癌、胃肠道间质瘤(gist)、表皮样、浆细胞、皮肤t细胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、结肠癌、结肠癌干细胞、白血病干细胞、卵巢癌、前列腺癌和宫颈癌。
[0081]
实施例5
[0082]
用hdm2抗体进行adcc检测。
[0083]
抗人/小鼠/大鼠hdm2多克隆抗体(af1244
‑
sp.r&d system)与mv4
‑
11细胞在表达fc受体cd16的效应细胞存在下共同孵育。效应细胞包括pbmc(外周血单核细胞)或纯化的nk细胞。
[0084]
对下列癌细胞的细胞系进行检测：急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、多发性骨髓瘤、胆管、胆道、骨髓增生异常综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、单核细胞白血病、组织细胞性淋巴瘤、早幼粒细胞白血病、白血病干细胞，神经内分泌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞肿瘤/癌症、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾细胞癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文氏肉瘤、burkitts/
‑
b细胞急性淋巴细胞白血病(burkitts/all
‑
bcell)、t细胞
‑
急性淋巴细胞白血病(t
‑
all)、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺癌、膀胱癌、头颈部癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺癌、胃肠道间质瘤(gist)、表皮样、浆细胞、皮肤t细胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、结肠癌、结肠癌干细胞、白血病干细胞、卵巢癌、前列腺癌和宫颈癌。
[0085]
上述癌症的细胞系是本领域普通技术人员熟知的。例如，cal27是公知的头颈癌细
胞系；oe33是公知的食管癌细胞系；sknas是公知的神经母细胞瘤细胞系；hepg2是公知的肝癌细胞系；ut7是公知的aml细胞系；a172是公知的胶质母细胞瘤细胞系。
[0086]
实施例6
[0087]
facs分析以测定hdm2的细胞外表达。
[0088]
在不加抗体、正常兔igg(同型对照，santa cruz biotechnology,inc.item#sc
‑
3888)或兔多克隆抗mdm2/hdm2(克隆n
‑
20，santa cruz biotechnology,inc.item#sc
‑
813)的情况下，在4℃的黑暗条件下培养细胞15分钟。然后用2.0ml pbs洗涤细胞，吸出上清液并向每个试管中加入150μl pbs。然后将所有细胞与藻红蛋白标记的次级山羊抗兔igg(santa cruz biotechnology,inc.item#sc
‑
3739)在4℃黑暗条件下孵育15分钟。用2.0ml pbs洗涤细胞，吸出上清液，并将350μl pbs加入到每支试管中。立即使用bd cellquest软件在bd4色流式细胞仪上分析样本，以进行数据采集和分析。
[0089]
对每种细胞系的测试条件如下：2
°
山羊抗兔igg pe、2
°
山羊抗兔igg pe的兔正常igg和2
°
山羊抗兔igg pe的抗mdm2/hdm2。
[0090]
检测以下细胞：急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、多发性骨髓瘤、胆管、胆道、骨髓增生异常综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、单核细胞白血病、组织细胞性淋巴瘤、早幼粒细胞白血病、白血病干细胞，神经内分泌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞肿瘤/癌症、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾细胞癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文氏肉瘤、burkitts/
‑
b细胞急性淋巴细胞白血病(burkitts/all
‑
bcell)、t细胞
‑
急性淋巴细胞白血病(t
‑
all)、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺癌、膀胱癌、头颈部癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺癌、胃肠道间质瘤(gist)、表皮样、浆细胞、皮肤t细胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、结肠癌、结肠癌干细胞、白血病干细胞、卵巢癌、前列腺癌和宫颈癌。
[0091]
实施例7
[0092]
hdm
‑
2抗体活性的体内分析。
[0093]
nu/nu小鼠(harlan laboratories,indianapolis,ind.,n＝10)，重20
‑
22g，与活癌细胞皮下(s.c.)异种移植。允许肿瘤发展和生长。检测以下活癌细胞：急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、多发性骨髓瘤、胆管、胆道、骨髓增生异常综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、单核细胞白血病、组织细胞性淋巴瘤、早幼粒细胞白血病、白血病干细胞、神经内分泌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞肿瘤/癌症、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾细胞癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文氏肉瘤、burkitts/
‑
b细胞急性淋巴细胞白血病(burkitts/all
‑
bcell)、t细胞
‑
急性淋巴细胞白血病(t
‑
all)、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺癌、膀胱癌、头颈部癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺癌、胃肠道间质瘤(gist)、表皮样、浆细胞、皮肤t细胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、结肠癌、结肠癌干细胞、白血病干细胞、卵巢癌、前列腺癌和宫颈癌。
[0094]
肿瘤形成后，将小鼠分成三组。一组小鼠接受hdm
‑
2抗体，另一组小鼠接受非hdm
‑
2抗体(对照抗体)。第三组小鼠不接受抗体。将抗体注射到小鼠体内。剂量方案的描述如下所示。抗体的给药时间为1～14天。
[0095]
由于动物为nu/nu小鼠，因此免疫功能低下，当暴露于病原体时，极易受到感染。所以，手术及所有术前和术后治疗均在无菌罩内进行。
[0096]
或者，使用与上述相同的方法，将上述活癌细胞(1
×
106个细胞/小鼠)移植到一组小鼠的腹膜腔中，并且在肿瘤细胞移植的同时将本文公开的组合物注射到右肩区域中。
[0097]
实施例8
[0098]
在一组癌细胞系中，hdm
‑
2单克隆抗体对膜结合hdm
‑
2抗原的特异性细胞表面识别。
[0099]
通过流式细胞术检测hdm
‑
2抗体与几种癌细胞系的质膜上的hdm
‑
2抗原的结合。
[0100]
检测以下癌细胞：急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、多发性骨髓瘤、胆管、胆道、骨髓增生异常综合征、真性红细胞增多症、儿童白血病、单核细胞白血病、组织细胞性淋巴瘤、早幼粒细胞白血病、白血病干细胞，神经内分泌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、子宫癌、生殖细胞肿瘤/癌症、睾丸癌、肾母细胞瘤、肾细胞癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤、尤文氏肉瘤、burkitts/
‑
b细胞急性淋巴细胞白血病(burkitts/all
‑
bcell)、t细胞
‑
急性淋巴细胞白血病(t
‑
all)、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、甲状腺癌、膀胱癌、头颈部癌、食管癌、肝癌、腹膜癌、胸膜癌、肾上腺癌、胃肠道间质瘤(gist)、表皮样、浆细胞、皮肤t细胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、结肠癌、结肠癌干细胞、白血病干细胞、卵巢癌、前列腺癌和宫颈癌。
[0101]
序列
[0102]
hdm
‑
2蛋白序列
[0103]
niprotkb
‑
q00987(mdm2_human)
[0104]
mcntnmsvpt dgavttsqip aseqetlvrp kplllkllks vgaqkdtytm
[0105]
kevlfylgqy imtkrlydek qqhivycsnd llgdlfgvps fsvkehrkiy
[0106]
tmiyrnlvvv nqqessdsgt svsenrchle ggsdqkdlvq elqeekpsss
[0107]
hlvsrpstss rrraisetee nsdelsgerq rkrhksdsis lsfdeslalc
[0108]
vireiccers sssestgtps npdldagvse hsgdwldqds vsdqfsvefe
[0109]
vesldsedys lseegqelsd eddevyqvtv yqagesdtds feedpeisla
[0110]
dywkctscne mnpplpshcn rcwalrenwl pedkgkdkge isekaklens
[0111]
tqaeegfdvp dckktivnds rescveendd kitqasqsqe sedysqpsts
[0112]
ssiiyssqed vkefereetq dkeesvessl plnaiepcvi cqgrpkngci
[0113]
vhgktghlma cftcakklkk rnkpcpvcrq piqmivltyf p
[0114]
pnc
‑
27
[0115]
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[0116]
pnc
‑
28
[0117]
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