细菌来源的囊泡及其用途的制作方法

细菌来源的囊泡及其用途
相关申请的交叉引用
1.本技术申明优先于美国临时专利申请(u.s.provisional patent application no.62/790,366)，该申请于2019年1月9日提交，在此通过全文引用纳入。简介
2.天然释放的细菌囊泡，包括外膜囊泡(omvs)，已被开发为疫苗。一个例子是脑膜炎球菌疫苗，它在临床上是可用的。然而，这类疫苗已知会激活先天免疫，导致免疫时出现发热和流感样症状等严重的副作用。因此，有必要研发不会引起天然免疫激活导致严重副作用，但仍能诱导保护性免疫的细菌囊泡。本发明解决了上述问题以及其他相关问题，并提供了相关优势。总结
3.本发明公开了从细菌(如致病菌)中提取的非自然产生的囊泡、制造这些囊泡的方法以及使用这些囊泡及其组分的方法。使用囊泡的方法包括预防和/或治疗细菌感染。还提供了包括来自细菌和肿瘤囊泡的囊泡的组合物，制作肿瘤囊泡的方法，以及使用细菌囊泡和肿瘤囊泡的组合物的方法。使用细菌囊泡和肿瘤囊泡的组合物的方法包括在受试者中治疗癌症。肿瘤囊泡可能来自于被治疗对象中存在的癌细胞，或来自于表达至少一种新抗原的癌细胞系。新抗原可能是针对受试者的，也可能是通过对受试者的癌细胞进行测序而确定的。或者，新抗原是已知在特定类型癌症中普遍表达的新抗原。
4.本发明中由革兰氏阴性菌产生的人工外膜囊泡(aomvs)具有如下特征：缺乏革兰氏阴性菌中存在的下列一种或多种成分:内膜蛋白、核酸、细胞质蛋白、核糖体，和/或富集革兰阴性菌的外膜蛋白。本发明中的肿瘤囊泡，包含本发明所披露的至少一种可用于在受试者(如哺乳动物，人体)中治疗癌症的肿瘤抗原。该方法包括给受试者注射aomvs和肿瘤囊泡。aomvs和肿瘤囊泡也可用于治疗受试者的癌症，其中包括在aomvs和肿瘤囊泡给受试者之前、同时或之后注射免疫检查点抑制剂(如抗pd
‑
1抗体)。在本公开的方法中使用的aomvs也可以装载治疗药物，如sting激动剂。使用aomvs和肿瘤囊泡治疗癌症的优势，与免疫检查点抑制剂联合治疗和使用aomvs负载药物进行肿瘤治疗的优势，将在下面详细描述。图的简要说明
5.图1a描述了从革兰氏阴性菌生成人工外膜囊泡(aomvs)的步骤。图1b描述了根据本发明实施例从革兰氏阴性菌生成人工外膜囊泡(aomvs)的步骤。
6.图2a描述了每1ml lb培养基中自然产生的大肠杆菌外膜囊泡(omvs)和大肠杆菌aomvs的颗粒数(上图)和每微克蛋白中大肠杆菌omvs和大肠杆菌aomvs的颗粒数(下图)。***,p<0.001；双尾不配对t检验。n＝3。图2b为大肠杆菌omvs(上图)和aomvs(下图)的透射电镜图像。
7.图3a组为考马斯亮蓝染色显示的大肠杆菌omvs和aomvs的sds
‑
page分析。图3b图显示大肠杆菌裂解物(10μg总蛋白)、omvs(1μg总蛋白)和aomvs(0.20μg总蛋白)与抗ompa抗体的western blot分析。
8.图4a为大肠杆菌裂解物(10μg总蛋白)、omvs(1μg总蛋白)和aomvs(0.20μg总蛋白)
与抗脂质a抗体的western blot分析。图4b组描述了通过鲎试剂检测分析的大肠杆菌omvs和aomvs中每颗粒数的lps浓度。ns,无差异；双尾不配对t检验。n＝3。
9.图5为大肠杆菌裂解物(10μg总蛋白)、omvs(1μg总蛋白)和aomvs(0.20μg总蛋白)与抗ftsz抗体的western blot分析。
10.图6描述了从大肠杆菌aomvs和大肠杆菌omvs中提取的rna的电泳图。
11.图7显示了从大肠杆菌aomvs和从大肠杆菌omvs中分离的dna的电泳图。
12.图8为比较大肠杆菌aomvs和omvs的蛋白质组的维恩图。
↑
表明aomvs蛋白的含量是omvs中相同蛋白含量的1.5倍以上。
↓
表示aomvs蛋白的表达量小于omvs中相同蛋白表达量的0.67倍。
13.图9通过go亚细胞定位注释分析描述了omvs和aomvs中“共同的大肠杆菌蛋白”、omvs和aomvs中大肠杆菌蛋白的百分比。
14.图10描述了go生物过程注释分析的omvs和aomvs“共同的大肠杆菌蛋白”、omvs和aomvs中所显示的大肠杆菌蛋白百分比。
15.图11显示了raw264.7细胞上清中大肠杆菌omvs或aomvs诱导的促炎细胞因子。向细胞中加入相应数目的omvs或aomvs,15h后用elisa法检测tnf
‑
α(左)和il
‑
6(右)。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
16.图12描述了腹腔注射大肠杆菌omvs(5
×
109)、aomvs(5
×
109)或4倍数量aomvs(2
×
10
10
)后6小时小鼠的体重(左)和体温(右)。与pbs组进行比较；***,p<0.001；ns,无差异；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
17.图13显示腹腔注射大肠杆菌omvs(5
×
109)、aomvs(5
×
109)或4倍数量的aomvs(2
×
10
10
)后6小时小鼠腹膜中的炎性细胞因子tnf
‑
α(左)和il
‑
6(右)。与pbs组进行比较；*,p<0.05；ns,无差异；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
18.图14描述了腹腔注射大肠杆菌omvs(5
×
109)、aomvs(5
×
109)或4倍数量的aomvs(2
×
10
10
)后6小时血液中总白细胞(左)和血小板(右)的数量。与pbs组进行比较；*,p<0.05；**,p<0.01；ns,无差异；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
19.图15a是一个流式检测显示dio标记的大肠杆菌aomvs被骨髓来源树突状细胞在0、3、6和12h摄取的情况。图15b描述dio标记的大肠杆菌aomvs被骨髓来源树突状细胞在0、3、6和12h摄取的百分比。与0h组进行比较；***,p<0.001；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
20.图16a为大肠杆菌omvs或aomvs处理骨髓源性树突状细胞，上清中tnf
‑
α水平(pg/ml)的图表。***，p<0.001；与对照组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图16b为大肠杆菌omvs或aomvs处理骨髓源性树突状细胞24h后，上清中il
‑
6水平(pg/ml)的图表。***，p<0.001；与对照组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图16c为大肠杆菌omvs或aomvs处理骨髓源性树突状细胞24h后，上清中il
‑
12p70水平(pg/ml)图。**，p<0.01；***,p<0.001；与对照组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图16d组为经大肠杆菌omvs或aomvs处理骨髓源性树突状细胞24小时后，上清中il
‑
4水平(pg/ml)的图表。单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
21.图17a显示的每次注射间隔一周，三次腹腔注射，每次5
×
109的大肠杆菌omvs或aomvs注射后的大肠杆菌蛋白特异性抗体水平。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素
方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。图17b显示每次注射间隔一周，三次腹腔注射，每次5
×
109的大肠杆菌omvs或aomvs注射后的omv蛋白特异性抗体的水平。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝4。
22.图18a描述了5
×
109的大肠杆菌omvs或aomvs免疫小鼠后，处死小鼠并分离cd4 脾细胞后，用大肠杆菌omvs处理，观察小鼠脾脏cd4 t细胞分泌的tnf
‑
α水平。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝3。图18b显示了5
×
109的大肠杆菌omvs或aomvs免疫小鼠后，处死小鼠并分离cd4 脾细胞后，用大肠杆菌omvs处理，观察小鼠脾脏cd4 t细胞分泌的ifn
‑
γ水平。**,p<0.01；***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图18c图显示5
×
109的大肠杆菌omvs或aomvs免疫小鼠后，处死小鼠并分离cd4 脾细胞后，用大肠杆菌omvs处理，观察小鼠脾脏cd4 t细胞分泌的il
‑
4水平。与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝3。
23.图19描述了以每周间隔5
×
109大肠杆菌omvs或aomvs腹腔免疫小鼠三周的体重(左)和体温(右)变化。n＝4。
24.图20描述了连续三周每周5
×
109的大肠杆菌omvs或aomvs免疫小鼠后，用非致死剂量的大肠杆菌omvs(15μg)腹腔攻毒后6小时测量的体重(左)和体温(右)。*,p<0.05；***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝4。
25.图21a描述了用5
×
109的大肠杆菌omvs或aomvs每周免疫小鼠，连续3周，用非致死剂量的大肠杆菌omvs(15μg)腹腔攻毒后6小时腹膜中总白细胞的数量。**,p<0.01；***,p<0.001；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝4。图21b描述用5
×
109的大肠杆菌omvs或aomvs每周免疫小鼠，连续3周，用非致死剂量的大肠杆菌omvs(15μg)腹腔攻毒后6小时肺泡灌洗液(bal)中总白细胞的数量。*,p<0.05；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。
26.图22a描述了用5
×
109的大肠杆菌omvs或aomvs每周免疫小鼠，连续3周，腹腔注射非致死剂量的大肠杆菌omvs(15μg)后6小时的血液中总白细胞数。*,p<0.05；**,p<0.01；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝4。图22b描述了用5
×
109的大肠杆菌omvs或aomvs每周免疫小鼠，连续3周，用非致死剂量的大肠杆菌omvs(15μg)腹腔攻毒后6小时血液中的血小板数量。***,p<0.001；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝4。图22c组描述了用5
×
109的大肠杆菌omvs或aomvs每周免疫小鼠，连续3周，用非致死剂量的大肠杆菌omvs(15μg)腹腔攻毒后6小时血清中心肌肌钙蛋白t的水平。***,p<0.001；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝4。
27.图23描述了用5
×
109的大肠杆菌omvs或aomvs每周免疫小鼠，连续3周，腹腔注射非致死剂量的大肠杆菌omvs(15μg)后6小时的血清中肿瘤坏死因子
‑
α(左)和il
‑
6(右)的表达水平。*,p<0.05；**,p<0.01；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。
28.描述了用5
×
109的大肠杆菌omvs或aomvs每周免疫小鼠，连续3周，腹腔注射非致死剂量的大肠杆菌omvs(15μg)后6小时的支气管肺泡灌洗液(bal)中肿瘤坏死因子
‑
α(左)和il
‑
6(右)的表达水平。*,p<0.05；**,p<0.01；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝4。
29.图25a显示三次注射后omv特异的igg抗体水平。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝4。图25b显示三次注射后大肠杆菌特异的
igg抗体水平。*,p<0.05；***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。
30.图26a描述了每1ml lb培养基中铜绿假单胞菌自然产生的外膜囊(omvs)和铜绿假单胞菌人工omvs(aomvs)的颗粒数(上图)和每微克蛋白质中铜绿假单胞菌omvs和铜绿假单胞菌aomvs的颗粒数(下图)。**,p<0.01；双尾不配对t检验。n＝3。图26b为铜绿假单胞菌omvs(上)和aomvs(下)的透射电镜图像。
31.图27显示了从铜绿假单胞菌aomvs和omvs中分离出的rna的电泳图。
32.图28显示了从铜绿假单胞菌aomvs和omvs中分离出的dna的电泳图。
33.图29为铜绿假单胞菌aomvs与omvs蛋白组比较的维恩图。
↑
表明aomvs蛋白的含量是omvs中相同蛋白含量的1.5倍以上。
↓
表示aomvs蛋白的表达量小于omvs中相同蛋白表达量的0.67倍。
34.图30通过go亚细胞定位注释分析描述了omvs和aomvs中“共同的铜绿假单胞菌蛋白”、omvs和aomvs中铜绿假单胞菌蛋白的百分比。
35.图31描述了氧化石墨烯生物过程注释分析的omvs和aomvs中“共同的铜绿假单胞菌蛋白”、omvs和aomvs中铜绿假单胞菌蛋白的百分比。
36.图32显示了mh
‑
s细胞上清中铜绿假单胞菌omvs或aomvs诱导的促炎细胞因子。将不同颗粒数的omvs或aomvs加入细胞18h，用elisa法检测tnf
‑
α(左)和il
‑
6(右)。***,p<0.001；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝3。
37.图33以5
×
109大肠杆菌omvs或aomvs腹腔免疫小鼠三周的铜绿假单胞菌蛋白特异性抗体的水平。*,p<0.05；***,p<0.001；ns,无差异；与假手术组比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。
38.图34a描述了5
×
109的铜绿假单胞菌omvs或aomvs免疫小鼠后，处死小鼠并分离cd4 脾细胞后，1μg/ml铜绿假单胞菌蛋白处理，观察小鼠脾脏cd4 t细胞分泌的tnf
‑
α水平。***,p<0.001；ns,无差异；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝3。图34b显示了5
×
109的铜绿假单胞菌omvs或aomvs免疫小鼠后，处死小鼠并分离cd4 脾细胞后，1μg/ml铜绿假单胞菌蛋白处理，观察小鼠脾脏cd4 t细胞分泌的ifn
‑
γ水平。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图34c图显示5
×
109的铜绿假单胞菌omvs或aomvs免疫小鼠后，处死小鼠并分离cd4 脾细胞后，1μg/ml铜绿假单胞菌蛋白处理，观察小鼠脾脏cd4 t细胞分泌的il
‑
4水平。与假手术组进行比较；***,p<0.001；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝3。图34c图显示5
×
109的铜绿假单胞菌omvs或aomvs免疫小鼠后，处死小鼠并分离cd4 脾细胞后，1μg/ml铜绿假单胞菌蛋白处理，观察小鼠脾脏cd4 t细胞分泌的il
‑
17水平。与假手术组进行比较；***,p<0.001；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝3。
39.图35a描述了以5
×
109的铜绿假单胞菌omvs或aomvs每周免疫小鼠，连续三周，经非致死剂量铜绿假单胞菌(4
×
108c.f.u)鼻内攻毒后48小时bal中总白细胞的数量。与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝4。图35，图b描绘了以5
×
109铜绿假单胞菌omvs或aomvs免疫小鼠，连续三周，给予非致死剂量铜绿假单胞菌(4
×
108c.f.u)鼻内攻毒后48小时bal中白细胞的数量。*,p<0.05；n,无差异；与假手术组进行笔迹；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝4。
40.图36a描述了以5
×
109的铜绿假单胞菌omvs或aomvs免疫小鼠，连续三周，给予非致死剂量铜绿假单胞菌(4
×
108c.f.u)鼻内攻毒后48小时肺泡灌洗液中tnf
‑
α的水平。*,p<0.05；n,无差异；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝4。图36b描述了以5
×
109的铜绿假单胞菌omvs或aomvs免疫小鼠，连续三周，给予非致死剂量铜绿假单胞菌(4
×
108c.f.u)鼻内攻毒后48小时肺泡灌洗液中il
‑
6的水平。*,p<0.05；n,无差异；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。图36c描述以5
×
109的铜绿假单胞菌omvs或aomvs免疫小鼠，连续三周，给予非致死剂量铜绿假单胞菌(4
×
108c.f.u)鼻内攻毒后48小时肺泡灌洗液中角化细胞化学引诱物(kc)的表达水平。*,p<0.05；n,无差异；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。图36d描述了以5
×
109铜绿假单胞菌omvs或aomvs免疫小鼠，连续三周，每周给予非致死剂量铜绿假单胞菌(4
×
108c.f.u)鼻内激发后48小时肺泡灌洗液中rantes水平。*,p<0.05；n,无差异；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。
41.图37描述了以5
×
109的铜绿假单胞菌omvs或aomvs免疫小鼠，连续三周，给予非致死剂量铜绿假单胞菌(4
×
108c.f.u)鼻腔刺激后48小时苏木精
‑
伊红染色的肺切片图像。40x放大。
42.图38a描述了生成复泡原生质体衍生纳米囊泡(repdnvs)的步骤。图38b描述了根据本公开的实施例生成repdnvs的步骤。
43.图39a描述了每微克蛋白质中大肠杆菌pdnvs和repdnvs的颗粒数量。**,p<0.01；双尾不配对t检验。n＝3。图39b为大肠杆菌pdnvs(上)和repdnvs(下)的透射电镜图像。
44.图40a为考马斯亮蓝染色显示的大肠杆菌pdnvs和repdnvs的sds
‑
page分析。图40b为大肠杆菌裂解物、pdnvs和repdnvs的抗ftsz、抗ompa和抗脂质a抗体的western blot分析。
45.图41a描述了从大肠杆菌pdnvs和repdnvs分离得到的rna的电泳图。图41b描绘了大肠杆菌pdnvs和repdnvs分离的dna分子的电泳图。
46.图42为大肠杆菌pdnvs和repdnvs的蛋白质组维恩图。
47.图43为go亚细胞定位注释分析的大肠杆菌常见蛋白、pdnvs富集蛋白和repdnvs富集蛋白的蛋白质组学分析。
48.图44显示了raw 264.7细胞上清中大肠杆菌omv
‑
、pdnv
‑
或repdnvs诱导的促炎细胞因子。将1
×
108个omvs、pdnvs或repdnvs颗粒加入细胞15h，用elisa法检测tnf
‑
α(左)和il
‑
6(右)。*,p<0.05；**,p<0.01；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
49.图45a显示经大肠杆菌pdnvs或repdnvs处理24h后，骨髓源性树突状细胞上清中tnf
‑
α水平。***，p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图45b图显示大肠杆菌pdnvs或repdnvs处理24h后骨髓源性树突状细胞上清中il
‑
6水平。***，p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图45c显示大肠杆菌pdnvs或repdnvs处理24h后骨髓源性树突状细胞上清中il
‑
12p70的水平。***，p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图45d显示了经大肠杆菌pdnvs或repdnvs处理24小时后骨髓源性树突状细胞上清中il
‑
4的水平。单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
50.图46显示了以一周为间隔定期三次腹腔注射5
×
109的大肠杆菌pdnvs或repdnvs
过程中大肠杆菌蛋白特异性抗体的水平。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。
51.图47描述了根据本发明实施例生成肿瘤细胞外囊泡(ev)的步骤。
52.图48为小鼠黑色素瘤组织的透射电镜图像。比例尺＝2000nm。
53.图49描述了黑色素瘤组织来源ev的透射电镜图像。左比例尺＝500nm。右比例尺＝200nm。
54.图50描述了注射黑色素瘤细胞的小鼠的黑色素瘤的生长体积，分别用pbs、10μg大肠杆菌aomvs(5
×
109)的小鼠黑色素瘤ev或10μg大肠杆菌repdnvs(5
×
109)的小鼠黑色素瘤ev(5
×
109)，每5天免疫一次，共三次。*,p<0.05；***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝6。
55.图51a显示了以5天为间隔，三次腹腔注射大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)小鼠黑色素瘤ev(10μg)的过程中测量的黑色素瘤ev特异性抗体水平。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝6。图51b显示了以5天为间隔，三次腹腔注射大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)小鼠黑色素瘤ev(10μg)的过程中测量的黑色素瘤噬菌体特异性抗体水平。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝6。
56.图52a描述了大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)免疫小鼠后，处死小鼠并分离cd4 脾细胞后，1μg/ml黑色素瘤ev蛋白处理，观察小鼠脾脏cd4 t细胞分泌的tnf
‑
α水平。与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图52b描述了大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)免疫小鼠后，处死小鼠并分离cd4 脾细胞后，1μg/ml黑色素瘤ev蛋白处理，观察小鼠脾脏cd4 t细胞分泌的ifn
‑
γ水平。**,p<0.01；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图52c描述了大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)免疫小鼠后，处死小鼠并分离cd4 脾细胞后，1μg/ml黑色素瘤ev蛋白处理，观察小鼠脾脏cd4 t细胞分泌的il
‑
4水平。与假手术组进行；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图52d描述了大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)免疫小鼠后，处死小鼠并分离cd4 脾细胞后，1μg/ml黑色素瘤ev蛋白处理，观察小鼠脾脏cd4 t细胞分泌的il
‑
17水平。与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
57.图53为小鼠结肠癌组织的透射电镜图像。箭头指向肿瘤组织中存在的evs。比例尺＝2000nm(左)和1000nm(右)。
58.图54a各组小鼠在体(上)和离体(下)肿瘤生长图像。图54b为各组小鼠结肠肿瘤体积变化图。**,p<0.01；***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝5。图54c为各组小鼠结肠肿瘤重量。**,p<0.01；***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝5。
59.图55a显示了以5天为间隔，定期三次腹腔注射大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)小鼠结肠癌ev(10μg)的过程中检测到的结肠癌ev特异性抗体水平。*,p<0.05；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey的多重比较检验。n＝5。图55b显示了以5天为间隔定期腹腔注射大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)小鼠结肠癌evs(10μg)的过程中测量的结肠癌裂解液特异性抗体水平。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝5。
60.图56a描述了结肠癌ev(10μg)和大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)免疫小鼠后，采用结肠癌ev蛋白(1μg/ml)体外刺激小鼠脾脏cd4 t细胞，观察分泌的tnf
‑
α水平。与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图56b显示结肠癌ev(10μg)和大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)免疫小鼠后，采用结肠癌ev蛋白(1μg/ml)体外刺激小鼠脾脏cd4 t细胞，观察分泌的ifn
‑
γ水平。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图56c显示结肠癌ev(10μg)和大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)免疫小鼠后，采用结肠癌ev蛋白(1μg/ml)体外刺激小鼠脾脏cd4 t细胞，观察分泌的il
‑
4水平。与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图56d显示结肠癌ev(10μg)和大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)免疫小鼠后，采用结肠癌ev蛋白(1μg/ml)体外刺激小鼠脾脏cd4 t细胞，观察分泌的il
‑
17水平。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
61.图57描述了10μg含/不含大肠杆菌aomvs(5
×
109)的人黑色素瘤evs腹腔免疫小鼠的体重(左)和体温(右)变化，每隔一周免疫一次，持续3周。n＝4。
62.图58a描述了经腹腔注射人黑色素瘤evs(10μg)和大肠杆菌aomvs(5
×
109)最后一次免疫1周后，小鼠血液中的白细胞总数。与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。图58b描述经腹腔注射人黑色素瘤evs(10μg)和大肠杆菌aomvs(5
×
109)最后一次免疫1周后，小鼠血液中的血小板数量。与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。图58c描述了经腹腔注射人黑色素瘤evs(10μg)和大肠杆菌aomvs(5
×
109)最后一次免疫1周后，小鼠血清中tnf
‑
α的水平。与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。图58d描述了经腹腔注射人黑色素瘤evs(10μg)和大肠杆菌aomvs(5
×
109)最后一次免疫1周后，小鼠血清中il
‑
6的水平。与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。
63.图59显示了每周一次，定期三次腹腔注射10μg含/不含大肠杆菌aomvs的人黑色素瘤ev(5
×
109)的过程中测量的人黑色素瘤ev蛋白特异性抗体水平。***,p<0.001；ns,无差异；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。
64.图60a描述了经腹腔注射人黑色素瘤evs(10μg)和大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠后，采用人黑色素瘤evs体外刺激小鼠脾脏cd4 t细胞，观察分泌的tnf
‑
α水平。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图60b显示10μg含/不含大肠杆菌aomvs的人黑色素瘤ev(5
×
109)免疫小鼠后，经人黑色素瘤evs(10μg)和大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠后，采用人黑色素瘤evs体外刺激小鼠脾脏cd4 t细胞，观察分泌的ifn
‑
γ水平。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图60c显示人黑色素瘤evs(10μg)和大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠后，采用人黑色素瘤evs体外刺激小鼠脾脏cd4 t细胞，观察分泌的il
‑
4水平。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。图60d显示人黑色素瘤evs(10μg)和大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠后，采用人黑色素瘤evs体外刺激小鼠脾脏cd4 t细胞，观察分泌的il
‑
17水平。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
65.图61描述了根据本发明实施例通过挤压生成缩孔化肿瘤纳米泡(retnvs)的步骤。
66.图62描述了1克小鼠黑色素瘤组织中黑色素瘤衍生的retnv或ev蛋白含量。***,p<
0.001；双尾不配对t检验。n＝3。
67.图63描述了1克小鼠结肠癌组织中结肠癌细胞来源的retnv或ev蛋白的含量。**,p<0.01；双尾不配对t检验。n＝2。
68.图64a描述了注射了黑色素瘤细胞的各组小鼠的黑色素瘤体积。小鼠皮下免疫小鼠黑色素瘤ev(5μg)，大肠杆菌aomvs(5
×
109)或二者的组合，每周一次，共3次。用b16f10细胞接种小鼠，再加强免疫2次。*,p<0.05；***,p<0.001；ns,无差异；与pbs组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝5。图64b描述了注射黑素瘤细胞的各组小鼠的存活率。小鼠皮下免疫小鼠黑色素瘤ev(5μg)，大肠杆菌aomvs(5
×
109)，或二者的组合，每周一次，共3次。用b16f10细胞接种小鼠，再加强免疫2次。当肿瘤体积超过1000mm3时，携带肿瘤的小鼠被安乐死。n＝5。
69.图65显示小鼠骨髓源性树突状细胞(bmdcs)摄取aomv。将aomvs(1
×
109)与bmdcs孵育12h，分别用dio、cellmask deep red和dapi染色aomvs、aomvs细胞膜和细胞核。标尺，20μm。
70.图66a显示了树突状细胞成熟标志物的表达水平，包括cd40、cd80、cd44、cd80和mhc ii。aomvs(5
×
109)与bmdcs共孵育24h，用流式细胞仪分析，显示为总细胞的百分比。**,p<0.01；***,p<0.001；双尾不配对t检验。n＝3。
71.图66b显示了树突状细胞成熟标志物的表达水平，包括cd40、cd80、cd44、cd80和mhc ii。aomvs(5
×
109)与bmdcs孵育24h，用流式细胞仪分析，显示为平均荧光强度(mfi)。*,p<0.05；***,p<0.001；双尾不配对t检验。n＝3。
72.图67a显示了免疫小鼠黑色素瘤体积，采用鼠黑色素瘤外泌体(texo；5
×
109)和/或大肠杆菌aomvs(5
×
109)进行5次免疫，每3天间隔。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝14。
73.图67b显示了5次texo(5
×
109)和/或大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠的在体和离体肿瘤图像(第17天)。n＝5。
74.图68是texo(5
×
109)和/或大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠黑色素瘤肺转移克隆的数量(第17天)。***,p<0.001；ns,无差异；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝5。
75.图69显示了治疗性囊泡疫苗和抗pd
‑
1免疫治疗联合对黑素瘤小鼠的效果。用texo(5
×
109)和/或大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠5次，每次间隔3天，并在免疫前1天给予抗pd
‑
1治疗(100μg)。**,p<0.01；***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝7。
76.图70a显示了用texo(5
×
109)和/或大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠5次后(第17天)，用于测量肿瘤组织中肿瘤浸润淋巴细胞数量的代表性荧光激活细胞分选图。
77.图70b显示了用texo(5
×
109)和/或大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠5次后(第17天)，肿瘤组织中浸润淋巴细胞的百分比。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。
78.图70c显示了texo(5
×
109)和/或大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠5次后(第17天)，肿瘤组织中各种浸润细胞类型的百分比。*,p<0.05；**,p<0.01；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。
79.图71显示了texo(5
×
109)和/或大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠5次后(第17天)，淋巴结中各种浸润细胞类型的百分比。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。
80.texo(5
×
109)和/或大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠5次后，分离脾脏cd8 t细胞。图72a显示了texo(1μg/ml)体外处理小鼠脾脏cd8 t细胞分泌的ifn
‑
γ水平。***,p<0.001；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
81.图72b是通过免疫texo(5
×
109)和aomvs(5
×
109)诱导强效黑色素瘤特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的图。目的细胞b16f10与重刺激的脾t细胞(效应细胞)孵育后，采用mtt法测定其裂解程度。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
82.图73显示了大肠杆菌aomvs(109或10
10
)瘤内免疫7次，每次间隔3天，联合抗pd
‑
1治疗(100μg)小鼠的黑色素瘤体积变化。*,p<0.05；***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝9。
83.图74显示的是每周三次腹腔注射人texo(5
×
109)后检测到的人黑色素瘤texo特异性抗体水平。白矾(100μg)，不完全弗氏佐剂(ifa；50μl)，10μg cpg dna和大肠杆菌aomvs(5
×
109)作为佐剂。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝5。
84.图75a为不同高ph条件下分离的大肠杆菌aomvs的形态特征。
85.图75b显示了在不同的高ph条件下，从1ml lb培养基中分离出的总颗粒数(左)和从大肠杆菌aomvs中分离出的每微克蛋白质中的颗粒数(右)。n＝3。
86.图75c显示了在不同的高ph条件下从大肠杆菌aomvs中分离出的dna的电泳图。
87.图76显示了raw 264.7细胞上清中大肠杆菌aomvs诱导的促炎细胞因子。将不同高ph条件下分离的omvs或aomvs加入细胞中15h，用elisa法检测tnf
‑
α(左)和il
‑
6(右)。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；ns,无差异；与0组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
88.图77显示了每周三次腹腔注射含/不含不同ph条件下分泌的aomvs(5x109)和人texo(5x109)，检测人黑色素瘤texo特异性抗体的水平。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝5。
89.图78显示了每周三次腹腔注射不同比例的texo和aomvs的过程中测量到的人类黑色素瘤texo特异性抗体水平。**,p<0.05；***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝5。
90.图79显示了5次texo(5
×
109)和/或铜绿假单胞菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠，同时免疫前1天免疫抗pd
‑
1(100μg),检测黑色素瘤体积。同时，采用texo和/或大肠杆菌aomvs免疫进行比较。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。
91.图80显示了texo(5
×
109)和大肠杆菌bw25113 aomvs(5
×
109)或δmsbb突变aomvs(5
×
109)免疫小鼠的黑色素瘤体积变化。***,p<0.001；ns,无差异；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。错误条表示sem。n＝4。
92.图81显示了腹腔注射含/不含大肠杆菌bw25113 aomvs(5x109)或δmsbb突变
aomvs(5x109)的texo(5x109)5次后，人黑色素瘤texo特异性抗体水平。**,p<0.01；***,p<0.001；ns,无差异；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝5。
93.图82显示了经大肠杆菌bw25113 aomvs或δmsbb突变aomvs处理的raw 264.7细胞分泌的促炎细胞因子水平。将大肠杆菌天然omvs或aomvs添加到细胞中15h后，用elisa法测定tnf
‑
α(左)和il
‑
6(右)。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；ns,无差异；与0组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
94.图83为聚乙二醇(peg)分离的小鼠黑色素瘤囊泡(tpeg)的形态学特征。为了比较，研究了另一种用微米大小的膜过滤器挤压分离的囊泡(tnv)。
95.图84显示了从一克小鼠黑色素瘤中分离出的颗粒数量(左)和从肿瘤囊泡中每微克囊泡蛋白分离出的颗粒数量(右)。***,p<0.001；ns,无差异；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝3。
96.图85显示了用不同类型的肿瘤囊泡(texo,tnv和tpeg；5
×
109)和大肠埃希菌aomvs(5
×
109)免疫5次，每次间隔3天，免疫前1天给予抗pd
‑
1治疗(100μg)后肿瘤体积的差异。***,p<0.001；与pd
‑
1组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。
97.图86a显示了装载sting激动剂的aomvs的制备方法示意图。
98.图86b是载sting激动剂的aomvs经碘二醇梯度超离心后的照片。上下箭头分别为10
‑
30％和30
‑
50％碘二醇梯度层上带有sting激动剂的aomvs。
99.图87a是sting激动剂(20μg)、aomvs、aomvssting(10
‑
30％)或aomvssting(30
‑
50％)处理小鼠bmdcs上清液24小时的ifn
‑
β表达水平图。aomvs和aomvssting组使用相同数量的颗粒(5
×
109)。*,p<0.05；***,p<0.001；与pbs进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝2。
100.图87b为不同浓度aomvssting(30
‑
50％)处理小鼠bmdc上清液24小时的ifn
‑
β图。***，p<0.001；与pbs组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝2。
101.图88显示了texo(5
×
109)和大肠杆菌aomvssting(30
‑
50％；5x109)免疫小鼠的黑色素瘤体积。同时，对texo与大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫进行比较。***,p<0.001；与假手术组进行比较；单因素方差分析
‑
tukey多重比较检验。n＝4。定义
102.这里使用的“致病”一词是指引起疾病的有机体，特别是在动物和人类中。
[0103]“非致病”一词指的是不会在动物，特别是人类身上引起疾病的生物体。这个术语包括共生生物。共生生物是指那些可以在宿主体内定植而没有疾病迹象的生物。
[0104]“革兰氏阴性菌”是指根据革兰氏染色试验被归类为这种菌的细菌。革兰氏阴性细菌包括由外膜组成的细胞壁，包括脂蛋白等蛋白质和肽聚糖层的质周间隙。外膜(om)由不对称的脂双分子层组成，内膜由磷脂组成，外膜由脂多糖(lps)组成。om含有外膜蛋白，如外膜蛋白a(ompa)、ompe,ompc,lptd,bama等。
[0105]“革兰氏阳性细菌”是指根据革兰氏染色试验被归类为此类细菌的细菌。革兰氏阳性细菌的细胞壁由肽聚糖、磷壁酸和脂磷壁酸组成。革兰氏阳性细菌缺乏外膜。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁都包裹着一层由磷脂双分子层组成的内膜，磷脂双分子层包括几种蛋白质。内膜也称为细胞膜、质膜或细胞质膜。原核细胞的质膜围绕着包括核酸、细胞质蛋白和核糖体的细胞质。
[0106]
术语“外膜囊泡”或“omv(s)”是指囊泡含有外膜包裹着周质内容物、细胞质内容物和内膜成分。omvs一词包括生物体外膜出芽产生的水泡，如革兰氏阴性细菌。这样的omvs也可以被称为omvs。omvs也可以通过在亲水性溶液中干扰革兰氏阴性细菌(如挤压、超声波、洗涤剂或渗透休克)而产生，从而迫使细胞形成囊泡。
[0107]
这里使用的术语“球状体”指的是通过去除细胞内的肽聚糖层而产生的球状结构。球状体包括外膜和内膜。球状体可以由细菌、古菌、真菌或植物细胞产生。可由革兰氏阴性细菌产生球状体。
[0108]
这里使用的术语“原生质体”是指细胞壁被部分或全部切除，露出细胞质膜的细菌、古菌、真菌或植物细胞。原生质体可以由革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌产生。
[0109]“原生质体衍生的囊泡”是指亚原生质体大小的囊泡，其内部含有仅由细胞膜脂质和膜蛋白组成的脂质双层膜与外界环境分离的细胞质组分。原生质体衍生囊泡可能是原生质体衍生的纳米囊泡，其大小各不相同。纳米囊泡的直径可以在1nm到小于1μm的范围内，例如1nm
‑
999nm。原生质体衍生囊泡(pdvs)的例子包括但不限于，从原生质体中自发分泌的囊泡，利用物理、机械、电或化学方法从原生质体中人工合成的囊泡，以及通过特定物质处理或通过诱导原生质体分泌囊泡的基因修饰而制备的。
[0110]
这里使用的术语“囊泡”是指一种球状结构，它包含一个由脂质双分子层膜与外部环境隔开的内部体积。囊泡可以由细胞分泌，也可以由细胞、球状体或原生质体人工合成。囊泡通常比形成它的细胞、球状体或原生质体小。囊泡可以是外膜囊泡，也可以是细胞膜囊泡(如原生质体衍生囊泡)。
[0111]“重泡”一词和语法类似,此处是指使用的一个打开一个囊泡的过程,例如,一个外膜囊泡,原生质体衍生囊泡,或肿瘤囊泡,这样的内部内容囊泡释放,紧随其后的是孤立的开放的脂质双分子层膜,以及封闭开放的脂质双分子层膜以改造囊泡。这种囊泡称为复泡囊泡。
[0112]
这里使用的术语“未重泡”及其语法等价物是指囊泡，如外膜囊泡、原生质体衍生囊泡或未重泡的肿瘤囊泡，即:未经历打开囊泡使囊泡内部内容物被释放，随后分离开放的脂质双分子层膜，并关闭开放的脂质双分子层膜以改造囊泡的过程。因此，与从同一类型细胞制备的囊泡相比，未重泡囊泡包含更多的细胞内容物。
[0113]“缺陷”一词用于本文所披露的细菌衍生的非自然发生的外膜泡(人工omvs,aomvs)中的成分时，指的是与自然发生的omvs或由细菌产生的未重泡omvs中存在的成分数量相比至少少50％的成分。“缺陷”一词用于描述来自本文披露的一种细菌的未重泡原生质体衍生囊泡(repdvs)中的成分，指的是与同一细菌产生的原生质体衍生的囊泡中所含成分的数量相比至少少50％的成分。
[0114]“富集”一词用于蛋白质，意味着aomvs中该组分蛋白质的总量与细菌天然产生的omvs或未重泡的omvs相比要多。例如，在aomvs中，富集的蛋白质可能至少占总蛋白的25％或更多，而在自然发生的omvs中，相同的蛋白质可能最多占总蛋白的20％。富集组aomvs中，存在更高浓度目标蛋白。
[0115]“富集”一词用于蛋白质，意味着repdvs中该组分蛋白质的总量与未重泡的pdvs相比要多。例如，在repdvs中，富集的蛋白可能至少占总蛋白的25％或更多，而在未重泡的pdvs中，相同的蛋白可能最多占总蛋白的20％。富集组repdvs中，存在更高浓度目标蛋白。
[0116]
在这里，术语“细胞外囊泡”是指真核生物，例如哺乳动物细胞释放的囊泡。细胞外囊泡包括外泌体、外泌体、微囊泡、前列腺体、肿瘤小体和凋亡小体。在这里，术语“肿瘤囊泡”是指由肿瘤细胞释放的细胞外囊泡。肿瘤囊泡可被重泡化以产生重泡化肿瘤囊泡(retv)，如重泡化肿瘤微囊泡或纳米囊泡(retmvs或retnvs)。“富集”意味着retvs中该组分蛋白质的总量与自然发生的肿瘤囊泡和未重泡的tvs相比要多，可以是3倍、5倍、30倍，甚至100倍。
[0117]
因此，如果某一特定蛋白组分的浓度为每克细胞总制剂(或每克细胞总蛋白)1微克，则富集的组分将含有更大的浓度，例如，每克细胞总制剂(或每克细胞总蛋白)至少含有3微克。
[0118]“保护性免疫”这个词意味着疫苗或免疫接种程序对哺乳动物诱发免疫反应,阻止/阻碍疾病发展,或降低疾病的严重程度,或减少或完全消除疾病的症状。
[0119]
这里使用的术语“炎症反应”是指促炎细胞因子的分泌、toll样受体(tlr)的激活和/或全身炎症反应。促炎的细胞因子包括il
‑
1、tnf
‑
γ和il
‑
6。
[0120]
炎症反应中“减少”一词的含义是指，与由细菌产生的自然omvs相比，aomvs注射后促炎细胞因子水平更低。在一些实施例中，与自然产生的omvs相比，细胞因子的产生至少降低了5％，10％、60％或更多。促炎细胞因子包括il
‑
2、il
‑
4、il
‑
6、il
‑
12、il
‑
12p70、il
‑
17、肿瘤坏死因子α(tnf
‑
α)和干扰素γ(ifn
‑
γ)。
[0121]
此处所使用的“毒性反应”一词指的是受试者服用某一组合物后，在受影响细胞和邻近组织中发生的任何有害反应。毒性反应的例子包括但不限于白细胞数量减少、血小板数量减少和/或体重减少。
[0122]
当提到多糖、磷脂、蛋白质或多肽等抗原时，“与抗体特异性结合”或“与抗体特异性免疫反应”这一短语，指基于和/或证明样品中存在抗原的结合反应，该样品也可能包括其他分子的异质群体。因此，在指定的免疫分析条件下，抗体与样品中的一个或多个特定抗原结合，而不与样品中的其他分子大量结合。在这种条件下与抗体的特异性结合可能需要一种抗体或抗血清，这种抗体或抗血清是由于其对特定抗原或抗原的特异性而被选择的。
[0123]“足以引起对上述制备中的抗原表位的免疫反应”这句话的意思是，在特定抗原制备前后测定的免疫反应指标之间存在可检测的差异。免疫反应指标包括但不限于:通过酶联免疫分析(elisa)、杀菌分析、流式细胞术、免疫沉淀、ouchter
‑
lowny免疫扩散、斑点杂交、western杂交、抗原阵列等测得的抗体滴度和特异性。
[0124]“表面抗原”是存在于细胞表面结构中的抗原。
[0125]“内源的”一词指的是细胞中自然存在的生物成分，即自然界中存在的物质。
[0126]“外源的”一词指的是自然界中不能同时发现的两种生物成分。这些成分可能是宿主细胞、基因或调控区域，如启动子。虽然在自然界中不存在异种成分，但它们可以一起发挥作用，比如当一个基因的启动子与一个编码序列可操作地连接在一起时。这里在基因或蛋白质方面使用的“异源”包括在两种不同菌株中自然表达的细菌基因或蛋白质。基因和蛋白质也被称为“异种”，即它们在同一品系中表达，但来自不同品系。例如，表达一种内源性外膜多肽的菌株，同时也表达一种与内源性外膜多肽在氨基酸序列上不同的重组外膜多肽(例如，属于不同的变异组或变异亚型)，则称为含有异体外膜多肽。
[0127]“重组”是指经人为操控，使得核酸编码基因产物,或者一个基因产物(如多肽)编
码核酸。因此，“重组”包括，例如，一个编码基因产物的可操作连接到一个异源启动子的核酸(这样，从一个可操作连接的启动子中提供表达基因产物的结构，而这种启动子在自然界中是不存在的)。例如，一个“重组外膜多肽”包含一个外膜多肽，该外膜多肽由一个构建物编码，该构建物提供从外源启动子到外膜多肽编码序列的表达，外膜多肽相对于自然发生的外膜(例如，比如融合蛋白)等等。需要注意的是，重组外膜多肽对存在这种重组核酸的细胞既可以是内源性的，也可以是异源的。
[0128]
术语“新抗原”或“新抗原”是指由肿瘤特异性突变引起的一类肿瘤抗原，这种突变改变了基因组编码蛋白质的氨基酸序列。
[0129]“敲除”目标基因是指改变基因序列，从而减少目标基因的功能,例如,目标基因表达检测不到或无关紧要的,和/或基因产物的功能或不显著的功能。例如，“敲除”参与lps合成的基因意味着该基因的功能已大幅下降，因此该基因的表达无法检测或仅以微不足道的水平存在和/或基因产物的生物活性(例如，酶活性)相对于修饰前显著降低或无法检测。“敲除”包括条件敲除，靶基因的改变可能发生在，例如，暴露于一组预先设定的条件下(例如，温度、渗透压、暴露于促进靶基因改变的物质，等等)。
[0130]“分离的”指所处的环境与它可能自然发生的环境不同。“分离”指的是样品中对相关组分进行了大量浓缩和/或相关组分已部分或基本提纯的实体。
[0131]“受试者”和“患者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅举例说明，一个主题包括但不限于，哺乳动物，人类或非人类哺乳动物。
[0132]
术语“治疗”在此处泛指治疗任何哺乳动物(尤其是人类的)一种疾病或症状,包括:(a)防止疾病发生在一个可能倾向于疾病但尚未被诊断；(b)抑制疾病，即阻止其发展；(c)减轻或改善疾病，即使疾病或状况好转；或(d)治疗疾病，即阻止其发展或进展。使用本发明方法治疗的受试者群体包括患有不良条件或疾病的受试者，以及有发展该条件或疾病风险的受试者。
[0133]“治疗效果”一词指的是某种疾病(如感染、肿瘤或肿瘤)的一个或多个症状或相关病理的某种程度的缓解。“治疗有效量”是指达到治疗效果所需的量。在这一领域具有普通技能的医生或兽医可以很容易地确定并开出所需药物成分的“治疗有效量”(如ed50)。例如，医生或兽医为达到预期的治疗效果，可以将本发明所述药物组合物中所使用的囊泡的起始剂量低于所需剂量，并逐渐增加剂量，直到达到预期效果。
[0134]
本文所提供的任何细胞、制剂、囊泡、组合物或方法都可以与本文所提供的任何其他细胞、制剂、囊泡、组合物和方法中的一种或多种组合物或方法相结合，无论它们是在应用程序的单独部分中披露的，还是在应用程序的同一部分中披露的。
[0135]
在进一步描述本发明之前，需要了解的是，本发明并不局限于所描述的特定实施例，因为这些实施例当然可能有所不同。还需要理解的是，此处使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不打算进行限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限制。
[0136]
在提供值范围的情况下，应理解每个中间值，到下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定，在该范围的上限和下限与任何其他规定或所述范围内的中间值包括在本发明内。这些较小量程的上下限可以独立地包括在较小量程中，也包括在本发明中，但须受所述量程中任何特别排除的限制的限制。如果所述范围包括一个或两个限度，则不包括其中一个或两个所包括限度的范围也包括在本发明中。
[0137]
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技能人员通常理解的含义相同。虽然与本发明相似或等效的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，首选的方法和材料在此进行描述。本文所提及的所有出版物均以参考资料的形式纳入其中，以披露和描述引用这些出版物的方法和/或材料。
[0138]
必须注意的是，在本文和所附权利要求中使用的单数形式“a”、“an”和“the”，除非上下文另有明确指示，否则包括复数所指。因此，例如，“囊泡”一词包括多个这样的囊泡，“囊泡”一词包括一个或多个囊泡及其相关技术人员所知的对等物，“一个细菌”一词包括多个同一类型的细菌，对“原生质体”的提及包括对多个原生质体的提及，对“球体质体”的提及包括对多个这样的球体质体的提及，对“新抗原”的提及包括对一个或多个可能不同的新抗原的提及，“异种蛋白质”包括一种或多种可能不同的异种蛋白质，等等。还应指出，在起草索赔要求时可排除任何任择因素。因此，这一陈述旨在作为使用“完全”、“仅”等专有术语的前提基础，与权利要求要素的背诵有关，或使用“负面”限制。
[0139]
值得注意的是，本发明的某些特征，为清晰起见，在单独实施例的上下文中描述，也可以在单个实施例中组合提供。反过来，为简便起见，本发明的各种特性也可以单独或在任何合适的子组合中提供，这些特性是在单个实施例的上下文中描述的。与本发明有关的实施例的所有组合都被本发明专门包含，并在此公开，就如同每一个组合都是单独和明确公开的一样。此外，本发明还特别包含各种实施例及其元素的所有子组合，并在此公开，就如同每一个这样的子组合在此单独和明确地公开一样。
[0140]
本文所讨论的出版物仅用于在本技术提交日期之前披露。此处的任何内容都不应被解释为承认本发明无权提前发表。此外，提供的出版日期可能与实际的出版日期不同，可能需要独立确认。详细描述
[0141]
本发明公开了从细菌(如致病菌)中提取的非自然发生的囊泡、制造囊泡的方法以及使用这些囊泡的组合物的方法。使用囊泡的方法包括预防和/或治疗细菌感染。还提供了包括来自细菌和肿瘤囊泡的囊泡的组合物，制作肿瘤囊泡的方法，以及使用细菌囊泡和肿瘤囊泡的组合物的方法。使用细菌囊泡和肿瘤囊泡的组合物的方法包括在受试者中治疗癌症。肿瘤囊泡可能来自于被治疗对象中存在的癌细胞，或来自于表达至少一种新抗原的癌细胞系。新抗原可能是针对受试者的，也可能是通过对受试者的癌细胞进行测序而确定的。新抗原可能是已知在特定类型癌症中普遍表达的新抗原。本披露的这些方面将在下面的章节中进一步详细描述。细菌小泡人工外膜囊泡及其组合
[0142]
本发明提供了一种革兰氏阴性细菌衍生的非自然发生的人工外膜囊泡(aomvs)。基于下列一项或多项特征，来自革兰氏阴性菌的aomvs与革兰氏阴性菌自然产生的外膜囊泡(omvs)相区别:aomvs富含外膜蛋白，缺乏革兰氏阴性菌中存在的一种或多种成分:内膜蛋白、核酸、胞浆蛋白和核糖体。
[0143]
在某些方面，在富含外膜蛋白的aomvs中，外膜蛋白在总蛋白含量中所占的比例高于自然存在的aomvs。在某些方面，与由aomvs来源的同一细菌产生的omvs相比，aomvs的外膜蛋白(omp)含量/总蛋白量高，至少高出3倍，5倍，10倍，甚至100倍。
[0144]
在某些方面,aomvs丰富的外膜蛋白,可能是一个孔蛋白或bama。在某些方面，与同一来源的omvs相比，本文所述的aomvs可能具有更高含量的孔蛋白和/或bama。
[0145]
在某些方面，本文提供的aomvs可能来自革兰氏阴性菌，通过破坏革兰氏阴性菌制备的球状体，从而产生由外膜组成的囊泡和由内膜组成的囊泡；将囊泡暴露于离子表面活性剂，以破坏包含内膜的囊泡，随后暴露于碱性ph，以打开包含外膜的囊泡，从而产生外膜片；净化外膜片；并对净化后的外膜板施加足够的能量或力，将外膜板转化为omvs，从而产生非自然发生的aomvs。通过离子表面活性剂处理去除包含内膜的囊泡的步骤减少了内膜组件的污染。打开囊泡的步骤释放囊泡内存在的任何内膜组分、细胞质周围组分和细胞质组分，开放的外膜片的回泡提供富含omps而缺乏一种或多种内膜组分、质周组分和细胞质成分的omvs。aomvs可能具有与它们来源的细胞相同的脂质双分子层拓扑结构。在某些方面，本发明的aomvs是通过将由球状体产生的囊泡暴露于离子表面活性剂和碱性ph下，以去除内膜污染制备的，以打开囊泡，释放在囊泡重组之前存在于囊泡中的任何内膜组分、细胞质周围组分和细胞质组分。
[0146]
在某些方面，本文提供的aomvs富含外膜蛋白，外膜蛋白至少占aomvs总蛋白含量的25％。相比之下，由aomvs来源的同一革兰氏阴性菌产生的omvs，外膜蛋白通常最多只形成总蛋白含量的15％。在某些方面,aomvs所提供的丰富的外膜蛋白的外膜蛋白形成至少30％,至少35％,至少40％,至少50％,甚至更多(例如,25％
‑
80％,25％
‑
75％,25％
‑
70％,25％
‑
50％,25％
‑
40％,30％
‑
80％,30％
‑
75％,30％
‑
70％,30％
‑
50％,30％
‑
40％)的总蛋白质含量aomvs。
[0147]
在某些方面，本文提供的aomvs缺乏下列细菌中存在的一种、两种或更多的非外膜组分:肽聚糖、胞浆周蛋白、内膜蛋白、核酸、胞浆蛋白和核糖体。在某些方面,aomvs缺乏一个,两个,甚至更多的非外膜组件(非外膜组件的数量出现在aomvs减少至少50％(例如,至少55％,60％,65％,70％,甚至更多,例如,90％,95％,99％,或100％)，而革兰氏阴性菌产生的omvs中存在相同的非外膜成分。
[0148]
在某些方面，本文提供的aomvs存在胞质蛋白缺陷，其胞质蛋白含量小于25％，例如小于aomv总蛋白含量的20％、15％或10％。相反，由同一革兰氏阴性菌产生的omvs可能包含至少占omvs总蛋白含量50％(如至少60％、65％、70％或更多)的细胞质蛋白。
[0149]
在某些方面，本文提供的aomvs存在内膜蛋白缺陷，其内膜蛋白含量不足20％，例如小于15％，或占aomvs总蛋白含量的10％。相比之下，由同一革兰氏阴性菌产生的omvs可能包含至少占omvs总蛋白含量25％(例如，至少30％、40％或高达50％)的内膜蛋白。
[0150]
在某些方面，本文提供的aomvs在外膜蛋白中富集，至少有25％(例如，aomvs总蛋白含量中至少30％
‑
40％为外膜蛋白，这些aomvs缺乏胞质蛋白，其胞质蛋白含量低于25％(如1％
‑
20％或更少)。
[0151]
本披露的aomvs可能大致为呈球形。aomvs的直径或最大尺寸范围从20nm
‑
200nm，例如，40nm
‑
200nm,50nm
‑
200nm,30nm
‑
175nm,30nm
‑
150nm,40nm
‑
175nm，或50nm
‑
150nm。本发明的aomv也可以被称为aomv粒子、reomvs或重泡的aomv。
[0152]
在某些方面，aomvs可能来自革兰氏阴性细菌，这种细菌经过基因改造以减少脂多糖(lps)的产生。基因修饰可能包括导致脂多糖合成所需的一种或多种蛋白质活性降低的突变。基因修饰可能包括导致脂质a减少的突变。
[0153]
在某些方面，革兰氏阴性菌经过基因改造，可以增加内源性外膜蛋白的表达，例如，omp是一种毒力因子，与来自革兰氏阴性细菌的aomvs的免疫原性相比，omp增加了aomvs的免疫原性，而非由于omp的产量减少而进行基因修饰。
[0154]
在某些方面，革兰氏阴性菌是经过基因修饰的，以便在外膜上表达一种异种蛋白。这种异源蛋白可能是一种癌症抗原。任何癌症抗原都可以在革兰氏阴性菌中表达。在某些方面，癌抗原可能是局限于外膜的抗原。在某些方面，异源蛋白是来自另一种革兰氏阴性菌的外膜蛋白。异源蛋白可能是来自革兰氏阴性菌的omp，与转基因革兰氏阴性菌相比，革兰氏阴性菌可以是不同的菌株、不同的物种或不同的属。
[0155]
在某些方面，本发明披露了包括aomvs在内的组分。所述组分可包括aomvs、载体、稀释剂、载体、赋形剂等。在某些方面，本公开的组分可能包括aomvs和药物上可接受的载体、稀释剂、载体、赋形剂等。在某些方面，该组合物还可包括额外的预防剂或治疗剂。此处使用的载体、稀释剂、载体、赋形剂等包括盐、缓冲液、抗氧化剂(如抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(如苯甲醇、苯甲酸甲酯、乙基或正丙基、对羟基苯甲酸酯)、乳化剂、悬浮剂、分散剂、溶剂、填料、膨松剂、洗涤剂、和/或辅助。例如，一个合适的载体可能是生理盐水溶液或缓冲盐水，也可能补充其他常见的药物组合物，如肠外给药。中性缓冲盐水或盐水与血清白蛋白混合是进一步的示范载体。有经验的人会很容易地识别出各种缓冲可以在组合中使用。典型的缓冲液包括但不限于药物上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。例如，缓冲组分可以是磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸及其盐类等水溶性物质。可接受的缓冲剂包括，例如，tris缓冲液、n
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑
n'
‑
(2
‑
乙磺酸)(hepes)、2
‑
(n
‑
吗啉代)乙磺酸(mes)、2
‑
(n
‑
吗啉代)乙磺酸钠盐(mes)、3
‑
(n
‑
吗啉代)丙磺酸(mops)和n
‑
三[羟甲基]甲基
‑3‑
氨基丙磺酸(taps)。在某些方面，所公开的组合物中包含的佐剂可以是聚
‑
iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp
‑
870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm
‑
csf、ic30、ic31、咪喹莫特、imufact imp321、is贴剂、iss、iscomatrix、juvlmmune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a、montanide ims 1312、montanide isa 206、montanide isa 50v、montanide isa
‑
51、ok
‑
432、om
‑
1197
‑
ommp ec、ontak、peptel、载体系统、plga微粒、resiquimod、srl172、病毒体和其他病毒样颗粒、yf
‑
17d、vegf trap、r848、β
‑
葡聚糖、pam3cys、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，或马来酸酐和aquila的qs21刺激物。
[0156]
在某些方面，一个组合可能包括由第一种革兰氏阴性菌产生的第一群aomvs和由第二种革兰氏阴性菌产生的第二群aomvs，其中第一种和第二种革兰氏阴性菌彼此不同，例如，不同的菌株、不同的物种、或不同的属。在某些方面，一种组合可能包括来自不同类型革兰氏阴性菌的第一、第二、第三、第四或更多aomvs群体。
[0157]
本文描述的aomvs可以由任何革兰氏阴性菌合成，例如致病性革兰氏阴性菌，例如任何人类和/或动物病原体。在某些方面，这些细菌可能来自大肠杆菌属、假单胞菌属、莫拉菌属、志贺氏菌属、密螺旋体属、卟啉单胞菌属、幽门螺杆菌属、奈瑟菌属、金氏菌属、不动杆菌属、布鲁氏菌属、波德氏菌属、嗜血杆菌属、衣原体属、军团菌属、变形杆菌属或耶尔森菌属。在某些方面，革兰氏阴性菌可能来自大肠杆菌属。在某些方面，革兰氏阴性菌可能来自假单胞菌属。在某些方面，革兰氏阴性菌可能是大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、内酰胺奈瑟菌、卡他莫拉菌、福氏志贺氏菌、铜绿假单胞菌、牙龈卟啉单胞菌、梅毒螺旋体、流感嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、鼠疫杆菌、幽门螺杆菌、衣原体、李斯特菌、弗朗西斯氏菌属、布鲁
氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌，链球菌，奈瑟菌或分枝杆菌。在某些方面，革兰氏阴性菌可能是铜绿假单胞菌。在某些方面，革兰氏阴性菌可能是大肠杆菌，如肠外致病性大肠杆菌(expec)、产肠毒素大肠杆菌(etec)、肠致病性大肠杆菌(epec)、肠出血性大肠杆菌(ehec)、产志贺毒素大肠杆菌(stec)、肠聚集性大肠杆菌(eaec)、肠侵入性大肠杆菌(eiec)或弥漫性黏附大肠杆菌(daec)。在某些方面，大肠杆菌可能是etec、epec、ehec、stec、eaec、eiec或daec的大肠杆菌菌株。重泡原生质体衍生囊泡及其组成
[0158]
本发明还提供了由细菌(如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌)产生的原生质体衍生的囊泡。这些内膜囊泡被称为重泡原生质体衍生囊泡revesiculation protoplast
‑
derived vesicles(repdvs)，因为它们是通过打开原生质体生成的囊泡，释放其细胞质含量并重新形成囊泡的过程产生的。repdvs大致球形,大小不等,例如,最大直径,从10
‑
200nm,例如,20
‑
200nm,30
‑
200nm,40
‑
200nm,50
‑
200nm,30
‑
175nm,30
‑
150nm,40
‑
175nm,或50
‑
150nm。repdvs也可以被称为重泡原生质体衍生的纳米泡(repdnvs)。pdvs也可以被称为原生质体衍生的纳米泡(pdnvs)。
[0159]
在某些方面，repdvs是由革兰氏阴性菌产生的，缺乏革兰氏阴性菌中存在的一种或多种成分:外膜蛋白、核酸、胞质蛋白和核糖体。
[0160]
在某些方面，repdvs是由革兰氏阳性细菌产生的，并且缺乏革兰氏阳性细菌中存在的一种或多种成分:细胞壁成分，如肽聚糖、磷壁酸和脂磷壁酸；核酸；细胞质蛋白质；和核糖体。
[0161]
在某些方面，与未经历过再生的原生质体衍生的纳米泡(pdvs)相比，repdvs富集内膜蛋白(即质膜蛋白)，而缺乏胞质蛋白。例如，pdvs是通过破坏原生质体产生囊泡而产生的，在囊泡中，内膜包裹着细菌的细胞质内容物。这些囊泡被纯化以获得pdvs的种群。在本发明公开的用于生成repdvs的重泡(revesiculation)方法实施例中，将纯化的pdvs暴露于足以打开pdvs的碱性ph中。将内膜片分离并重新闭合，生成repdvs。repdvs可能具有与它们来源的细胞相同的脂质双分子层拓扑结构。
[0162]
在某些方面，repdvs中总蛋白中至少有60％(如至少65％、至少70％、至少75％或至少80％，或60％
‑
85％、65％
‑
80％或65％
‑
75％)可能是内膜蛋白。丰富的内膜蛋白包括:内膜蛋白yjiy、琥珀酸脱氢酶疏水膜锚定亚基、磷脂abc转运结合蛋白mlad、多药外排泵亚基acra、atp合酶亚基b、pts系统葡萄糖特异性eiicb组分、蛋白转位酶亚基secf、蛋白转移酶亚基secd和多药外排泵亚基acrb。在某些方面，repdvs中存在的总蛋白中小于20％(如小于15％、小于10％、小于5％、小于2％，如1％
‑
10％)的蛋白可能是细胞质蛋白。相比之下,只有不到20％(例如,只有10％
‑
20％)的总蛋白出现在刚才可能是内在膜蛋白和70％以上(如70
‑
80％)的总蛋白出现在刚才可能是细胞质蛋白质,repdvs和刚才在哪里来自相同的细菌。
[0163]
在某些方面，repdvs可能来自一种革兰氏阴性细菌，这种细菌经过基因改造以减少脂多糖(lps)的产生。基因修饰可能包括导致脂多糖合成所需的一种或多种蛋白质活性降低的突变。基因修饰可能包括导致a类脂质减少的突变。在某些方面，repdvs可能来自革兰氏阳性细菌，该细菌经过基因修饰，使肽聚糖、磷壁酸和/或脂壁酸的产量减少。
[0164]
在某些方面，革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌的基因被修饰以增加内源性内膜蛋白
的表达，例如，与来自非转基因细菌的repdvs的免疫原性相比，该蛋白是一种毒力因子，可提高repdvs的免疫原性，以增加内源性内膜蛋白的表达。
[0165]
在某些方面，这种细菌是经过基因改造的，以便在内膜中表达一种异种蛋白。这种异源蛋白可能是一种癌症抗原。任何癌症抗原都可以在这种细菌中表达。在某些方面，癌抗原可能是局限于内膜的抗原。在某些方面，异源蛋白是来自不同细菌的内膜蛋白。异源蛋白可能是来自革兰氏阴性菌的内膜蛋白，与转基因革兰氏阴性菌相比，革兰氏阴性菌是不同的菌株、不同的物种或不同的属。异源蛋白可能是革兰氏阳性菌的内膜蛋白，与转基因革兰氏阳性菌相比，革兰氏阳性菌是不同的菌株、不同的物种或不同的属。
[0166]
在某些方面，本发明披露了包含repdvs的组分。所述组分可包括repdvs和载体、稀释剂、载体、赋形剂等。在某些方面，本公开的组分可能包括repdvs和药物上可接受的载体、稀释剂、载体、赋形剂等。在某些方面，该组分还可包括额外的预防剂或治疗剂。用于制造包含repdvs的组合物的载体、稀释剂、载体、赋形剂等可按本协议规定，例如，在前一节中。
[0167]
在某些方面，一种组合可能包括由第一革兰氏阴性菌产生的第一种群repdvs和由第二革兰氏阴性菌产生的第二种群repdvs，其中第一和第二革兰氏阴性菌彼此不同，例如，不同的菌株、不同的物种、或不同的属。在某些方面，一种组合可能包括来自不同类型革兰氏阴性菌的第一、第二、第三、第四或更多的repdvs种群。
[0168]
在某些方面，一种组合可能包括由第一种革兰氏阳性细菌产生的第一种群repdvs和由第二种革兰氏阳性细菌产生的第二种群repdvs，其中第一和第二种革兰氏阳性细菌彼此不同，例如，不同的菌株、不同的物种、或不同的属。在某些方面，一种组合可能包括来自不同类型革兰氏阳性细菌的第一、第二、第三、第四或更多的repdvs种群。
[0169]
在某些方面，一种组合可能包括由第一革兰氏阳性菌生成的第一种群repdvs和由第二革兰氏阴性菌生成的第二种群repdvs。
[0170]
本文描述的repdvs可以由任何革兰氏阴性菌合成，例如，前一节中提供的一种或多种革兰氏阴性菌。
[0171]
在某些方面，本文描述的repdvs可能由任何革兰氏阳性细菌合成，如致病性革兰氏阳性细菌，如致病性人或动物的革兰氏阳性细菌。在某些方面，革兰氏阳性菌可能是分枝杆菌属、棒状杆菌属、诺卡氏菌属、红球菌属、链霉菌属、肠球菌属、葡萄球菌属、链球菌属或芽孢杆菌属、衣原体属、李斯特菌属、弗朗西斯菌属、布鲁氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、奈瑟菌属或分枝杆菌属。在某些方面，革兰氏阳性菌可能是粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、表皮葡萄球菌或炭疽芽胞杆菌。
[0172]
在某些方面,革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌用于生成所提供的囊泡可能是野生型细菌在自然界发现的,没有转基因的,例如,没有转基因提供低毒性(例如,通过突变导致减少或没有有限合伙人的表达式,肽聚糖、磷壁酸和/或脂磷壁酸)。在某些方面，用于产生本文提供的囊泡的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌可能没有经过基因修饰以表达异种蛋白，例如肿瘤抗原或特异性结合肿瘤抗原的抗体。
[0173]
在某些方面，本文所披露的细菌囊泡，如aomv和repdvs，可能装载治疗药物，如化疗药物、抗癌抗体等。在某些方面，本文所披露的细菌囊泡，例如aomv和repdvs，不能装载治疗药物。在某些方面，治疗药物可能是干扰素基因刺激因子(sting)的激动剂。在某些方面，sting激动剂可能是sting的配体。在某些方面，sting的配体可能是5,6
‑
二甲基杂蒽酮
‑4‑
乙酸(dmxaa)或mk
‑
1454，一种合成的环二核苷酸(cdn)。
[0174]
在某些方面，所述包括本发明所述细菌囊泡的组合物可能不包括佐剂的有效数量，例如，用于增强组合物免疫原性的佐剂。肿瘤囊泡及其组成
[0175]“肿瘤囊泡”是指由表达肿瘤抗原的细胞形成的囊泡，例如肿瘤细胞系或肿瘤中存在的癌细胞，其中肿瘤囊泡包含至少一个肿瘤抗原。在某些方面，肿瘤抗原可能在细胞表面表达，也可能暴露在肿瘤泡囊的表面。肿瘤囊泡(tv)可能是表达肿瘤抗原的细胞分泌的细胞外囊泡(ev)。ev在这里也可以称为外泌体(exo)。肿瘤囊泡可能是一种重泡tv(retv)，通过将ev暴露在高ph下，分离细胞膜的开放叶，关闭细胞膜的开放叶，产生重泡tv。在这里，retv也被称为肿瘤纳米囊泡“tnv”。未被重泡的tv，例如，由表达肿瘤抗原的细胞分泌的分离ev可能包括细胞质成分，如细胞器、细胞质蛋白、细胞核、核酸(如rna、mrna、mirna等)。retv缺乏这样的成分，即至少少50％的组分。tv的形状大致为球形，直径可能比生产tv的细胞小。在某些方面,tv相对较大的tv直径范围从100nm
‑
900nm。在某些方面，tv可能相对较小，直径可能在10nm
‑
100nm。在某些方面，tv的制备，如tv的组合，可能包括大tv和小tv。tv组合可以是ev、retv或其组合，并可以包括小型和大型tv。在某些方面，tv的制备，如tv的组合可能包括小型tv，这里也称为texo。
[0176]
在某些方面，肿瘤囊泡可能是由使用聚乙二醇(peg)沉淀的肿瘤细胞产生的囊泡。在某些方面，该方法可能涉及分离肿瘤细胞分泌的肿瘤泡，例如，生成小块的肿瘤组织；通过溶解纤维结构来分解组织；去除细胞、组织碎片和大囊泡(如过滤和离心)；将由小泡组成的上清液与peg混合(例如，20％
‑
80％、30％
‑
80％、40％
‑
80％、20％
‑
70％、20％
‑
60％、40％
‑
60％、45％
‑
55％或50％peg)；孵育后，分离小泡；选择性地将小泡与peg重复混合，孵育后，分离小泡，生成含有peg的肿瘤囊泡。这种含有peg的肿瘤囊泡称为tpeg。
[0177]
tvs可能是从肿瘤组织中分离出来的，例如，位于皮肤、大脑、乳腺、肺、胰腺、胃、食道、口腔、卵巢、结肠、膀胱、睾丸、前列腺、会阴、子宫、淋巴结、骨骼、软骨和其他组织中的肿瘤，如哺乳动物或人类。在某些方面，tvs可能是从癌细胞中分离出来的，如实体肿瘤:癌(如腺癌、鳞状细胞癌或基底细胞癌)或肉瘤。在某些方面，tvs可能来自骨肉瘤或骨原性肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、间皮肉瘤或间皮瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤或血管内皮瘤、脂肪肉瘤、胶质瘤或星形细胞瘤、粘液肉瘤、间质性或混合性中皮肉瘤、肿瘤骨源性肉瘤。脊索瘤，淋巴管肉瘤，滑膜瘤，尤文氏瘤，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管细胞癌，肾细胞癌，肝癌，wilm's肿瘤，宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成髓细胞瘤、颅咽管瘤、松果瘤、血管母细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤或视网膜母细胞瘤。
[0178]
在某些方面，本发明的肿瘤囊泡可能是从表达肿瘤抗原的细胞培养中分离出来的。在某些方面,目前披露的肿瘤囊泡分离于癌症细胞系,例如,肺癌细胞株、卵巢癌细胞系,乳腺癌细胞系,大脑癌症细胞系,皮肤癌症细胞系,胰腺癌细胞系,淋巴结癌症细胞系,食道癌症细胞系,口腔癌细胞系、结肠癌细胞系、胃癌细胞系、膀胱癌细胞系、睾丸癌细胞系、前列腺癌细胞系、子宫癌细胞系、淋巴癌细胞系、骨癌细胞系、软骨癌细胞系等。
[0179]
肿瘤抗原是指肿瘤细胞拥有的一种蛋白质或肽，可被肿瘤特异性的细胞毒性t淋
巴细胞(以下简称ctl)识别，并/或可诱导细胞毒性t淋巴细胞反应。肿瘤抗原可能是肿瘤抗原在肿瘤细胞内降解时产生的肽。这种多肽可以被肿瘤特异性的细胞毒性t淋巴细胞识别，并/或通过与hla分子结合并呈现在细胞表面而诱导细胞毒性t淋巴细胞。在某些方面，肿瘤抗原可以是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在某些方面，肿瘤抗原可能是致癌基因。肿瘤抗原包括ras p21原癌基因、her
‑
2/neu、bcr
‑
abl癌基因、erbb
‑
2、ksa、癌胎抗原如甲胎蛋白(afp)、人绒毛膜促性腺激素(hcg)；癌胚抗原(cea)、黑色素细胞分化抗原如mart 1/melan a、gp100、gp75、酪氨酸酶、trp1、trp2；前列腺相关抗原如psa、pap、psma、psm
‑
p1、psm
‑
p2；重新激活胚胎基因产物如mage 1、mage 3、mage 4、gage 1、gage 2、bage、rage和其他癌性睾丸抗原如ny
‑
eso1、ssx2、scp1；粘液蛋白，如muc1和muc2；神经节苷类如gm2、gd2和gd3，中性糖脂和糖蛋白如lewis(y)和globoh；糖蛋白如tn、tf、stn等。
[0180]
在某些方面，表达肿瘤抗原的细胞可能是一个至少表达一种新抗原的细胞。例如，该细胞可能是一种转基因细胞系，以表达一种或多种新抗原。在某些方面，该细胞系可能是癌症细胞系。在某些方面，新抗原可能是在特定类型的癌症中表达的肿瘤抗原，即肿瘤特异性新抗原。在某些方面，新抗原可能是被研究对象所表达的癌症抗原，例如，患有某种特定类型癌症的人类患者，即患者特异性新抗原。在某些方面，患者特异性新抗原(s)可以通过对患者肿瘤细胞的测序来确定。
[0181]
在某些方面，一个细胞可以通过基因修饰来表达多个新抗原，例如，两个、三个、四个或更多的新抗原。新抗原可能是蛋白质或多肽。在某些方面，新抗原可以使用本技术中已知的方法进行鉴定，例如us20160339090中描述的方法，本文将其纳入参考文献。在某些方面，新抗原可能是一种致癌基因。在某些方面，新抗原可能是us20180153975中公开的新抗原。在某些方面,肿瘤新抗原可能来自于以下蛋白的一个突变：程序性死亡受体
‑
1(pd
‑
l1)、雄激素受体(ar)、布鲁顿酪氨酸激酶(btk)、表皮生长因子受体(egfr)、bcr
‑
abl,c
‑
kit,pik3ca,her2,eml4
‑
alk,kras,alk,ros1,akt1,braf,mekj,mek2,nras,rac1,和esr1。在某些方面，新抗原是pd
‑
l1、ar
‑
v1或ar
‑
v7等的剪接变体。在某些方面，新抗原来自于如下基因的耐药突变：btk/c481s,egfr/t790m,bcr
‑
abl/t315i,bcr
‑
abl/y253h,bcr
‑
abl/e255k,bcr
‑
abl/e255v,c
‑
kit/t670lpik3ca/e545k,pik3ca/e542k,her2/g776(yvma),her2/e545k,eml4
‑
alk/g1269a,kras/g12v/d,alk/l196m,alk/g1202r,alk/s1206y,alk/1151t(ins),alk/f1174c,ros1/g2032r,akt1/e17k,braf/v600e,mek1/q56p,mek1/e203k,mek1/c121s,mek1/v60e,mek1/g128v,mek1n/v54i,mek1/p124s,mek1/p124l,nras/q61k/l/r,nras/t58i,mek2/c125s,rac1/p29s,esr1/s463p,ar/v534e,ar/p535h,ar/l536q,ar/l536r,ar/y537c,ar/y537s,ar/y537n,ar/d538g and ar/f876l。
[0182]
本文还披露了包括肿瘤囊泡和细菌囊泡的组合物，如上文所述的aomvs和/或repdvs。这些组合物还可以包括载体、稀释剂、载体、赋形剂等。在某些方面，本公开的组合物可能包括药物上可接受的载体、稀释剂、载体、赋形剂，例如本文所述的那些。
[0183]
在某些方面，本发明公开的包括肿瘤囊泡和细菌囊泡的组合物不得包括大量的佐剂以增强组合物的免疫原性，其中，大量的佐剂有效地增强了肿瘤囊泡和细菌囊泡组成的免疫原性。
[0184]
在某些方面，本文提供的组合物，如由aomvs、repdvs、aomvs和肿瘤囊泡组成的组合物，以及repdvs和肿瘤囊泡组成的组合物，可以进行冻干以产生冻干组合物。在某些方
面，本公开的组合物可能在试剂盒中提供，该试剂盒进一步包括用于稀释和/或重组冻干组合物的溶液。制造细菌囊泡的方法
[0185]
上述部分中描述的细菌囊泡可以使用本文公开的方法生产。
[0186]
在某些方面，本发明提供了一种从革兰氏阴性细菌产生非自然发生的人工外膜囊泡(aomvs)的方法。所述方法可能包括:a)破坏由革兰氏阴性细菌产生的球状体，以产生包括外膜的囊泡和包括内膜的囊泡；b)将囊泡暴露于离子表面活性剂，以破坏包含内膜的囊泡，并暴露于碱性ph，以打开包含外膜的囊泡，从而产生外膜片；c)净化外膜片；d)对净化后的外膜板施加足够的能量或力，使外膜板转化为aomvs，从而产生非自然发生的omvs。在某些方面，aomvs可以通过图1a所示的方法生成。
[0187]
在某些方面，革兰氏阴性菌产生球状体可能涉及到在足以去除革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖层的条件下，用一种具有活性的酶培养革兰氏阴性菌。从而将革兰氏阴性细菌转化为球状体。在某些方面，具有胞浆酶活性的酶可能是胞浆酶水解酶。在某些方面，壁蛋白水解酶可能是一种糖苷酶(如n
‑
乙酰壁酰胺聚糖水解酶(也称为溶菌酶))或一种氨基葡萄糖酶。在某些方面，壁蛋白水解酶可能是肽内酶或酰胺酶。溶菌酶在市场上是可以得到的，而去除肽聚糖的条件可能是制造商的方案，可以选择性地修改以优化结果。在某些方面，溶菌酶可能是蛋清溶菌酶(hewl)。
[0188]
在某些方面，破坏球状体以产生囊泡可能涉及机械、电或化学方法。这些方法的例子包括使用渗透、电穿孔、超声、均质化、洗涤剂处理、冻融、挤压、机械降解和化学处理，但不限于此。在机械降解方法中，将球状塑料溶液与金属、陶瓷或足够硬的塑料球搅拌在一起。在某些方面，破坏球状体可能包括对球状体施加剪切力。剪切力可以通过挤压球质体施加。挤压可以包括迫使球状体通过小于球状体大小的孔。在挤压过程中，球状体可能被迫依次通过一系列孔径减小的过滤器。例如，球质体依次通过3个孔径分别为10μm
→
5μm
→
1μm的过滤器形成囊泡。
[0189]
在某些方面，破坏球状体可能包括对球状体施加声能。可以通过超声装置来应用声能。超声条件可以根据所需的干扰能量进行调整。例如，低温、低能量和/或短时间的超声波可以用于破坏球状体产生囊泡。超声可以进行不同程度的强度，包括低能量超声周期1分钟至3小时。在某些方面，超声可以使用超声波探头式装置来进行。在某些方面，可以用超声波浴进行超声波处理。超声的持续时间可以根据用于执行超声的设备类型进行调整。例如，一个超声波探头型装置可以提供比超声波浴高出1000倍的能量。在某些方面，超声探头式装置可用于破坏球质体。
[0190]
当球质体被破坏而产生囊泡时，例如外膜包裹胞质内容物的囊泡和内膜包裹胞质内容物的囊泡(或两者都有)，这些囊泡可从任何剩余的球质体中分离出来。从球状体中分离这些囊泡可以利用大小、密度、浮力等方面的差异。在某些方面，可采用离心或过滤来分离囊泡。
[0191]
然后将分离出来的囊泡暴露于离子表面活性剂中，以破坏包含内膜的囊泡，并暴露于碱性ph中，以打开包含外膜的囊泡。在某些方面，将囊泡暴露于离子表面活性剂和碱性ph的步骤可以通过使用含有离子表面活性剂的碱性溶液作为一个步骤来完成。在其他方面，可以首先将囊泡暴露于离子表面活性剂以破坏包含内膜的囊泡，然后将包含外膜的囊
泡暴露于碱性ph。在这些方面，在将包含外膜的囊泡暴露于碱性ph值之前，可以将包含外膜的囊泡与破坏的内膜囊泡分离。
[0192]
任何合适的离子表面活性剂都可用于破坏由内膜组成的囊泡。在某些方面，离子表面活性剂可以是一种洗涤剂。在某些方面，洗涤剂可能是月桂醇肌酸钠，也称为醇酸酯，去氧胆酸盐，十二烷基硫酸钠(sds)，十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，或其组合。在某些方面，用于破坏包含内膜的囊泡的条件可能涉及使用0.25％
‑
2％的萨科齐约20分钟，它可以溶解内膜而不严重影响外膜。
[0193]
在某些方面，用于打开由外膜组成的囊泡的碱性ph值可能为9
‑
14，例如ph 9
‑
13、ph 11
‑
14、ph 9
‑
12或ph 10
‑
12。可使用碳酸钠(na2co3)、氢氧化钠(naoh)、氨(nh3)、氢氧化钙(ca(oh)2)、氢氧化钾(koh)、碳酸氢钠(nahco3)或氢氧化镁(mg(oh)2)制备开囊泡的碱性溶液。由外膜组成的囊泡在碱性溶液中的孵育时间可根据囊泡的数量、溶液的总体积等因素进行调整。在某些方面，潜伏期可能为10分钟
‑
3小时。孵育可在室温(约25℃)、4℃或37℃下进行。当在更高的温度和/或更高的碱性ph下进行孵育时，孵育时间可能会减少。当在更低的温度和/或更低的ph下进行孵育时，孵育时间可能会增加。
[0194]
可采用任何合适的分离方法，将包括外膜的囊泡开口产生的外膜片从整个囊泡(即未开口的囊泡)中分离出来。在某些方面，外膜片的净化可能涉及离心，如离心(如密度梯度离心或密度梯度超离心)，过滤，或其他合适的方法，如尺寸排除，透析，切向流过滤等。在某些方面，净化外膜片可能包括通过收集外膜片进行离心(例如，通过离心获得包含膜片的颗粒)和使用密度梯度离心分离外膜片。在某些方面，碘二醇或蔗糖分层可形成密度梯度。例如，可以使用碘克沙醇梯度来分离膜片，例如由10％、30％和50％碘克沙醇形成的密度梯度。外膜片存在于10％
‑
30％碘克沙醇超离心后形成的层中，可以收集来提供纯化的外膜片。
[0195]
在某些方面，产生非自然aomvs的方法可能涉及对纯化的外膜板施加足够的能量或力，以将外膜转化为aomvs。适当的能量来源包括温和的声波、剪切力、声波、冻融等。在某些方面，纯化后的外膜片可以经过一段时间的超声，足以将外膜片转化为aomvs。在某些方面，纯化的外膜片可以通过施加比破坏球质体少100
‑
1000倍的能量来超声。在某些方面，轻度超声可以包括使用超声波浴将外膜板转化为aomvs。
[0196]
与现有分离自然分泌omvs的技术方法相比，本发明的方法提高了aomvs的产量。来源于相同体积的细菌培养液，本发明的方法分离的产量至少是原有方法的2倍，3倍，4倍，甚至5倍以上。此外，与omv制剂相比，通过本发明方法生产的aomvs组合物具有更少的污染物。例如，每一蛋白质总量中存在的aomvs的数量至少比每一蛋白质总量中存在的omvs的数量多出2x、3x、4x甚至5x。此外，非外膜组分如胞浆周、内膜和胞浆的污染较少。由公开的方法产生的aomvs的其他特性在前面的章节中已经提供。
[0197]
在某一特定方面，本发明的aomvs可能是由大肠杆菌或铜绿假单胞菌制备的。在特定方面，aomvs可以通过在蔗糖(例如，5％
‑
30％)、溶菌酶和edta(例如，ph 8.0)中培养革兰氏阴性菌(如大肠杆菌或铜绿假单胞菌)作为悬浮液来制备，从而去除肽聚糖层。由此产生的球质体可以被超声，并以不同的速度进行离心，以将整个细胞从细胞膜中分离出来。分离出来的膜可以冷冻解冻，并在洗涤剂中孵育(如萨科齐)。外层膜可通过离心分离(例如，40000x g)，并在高ph溶液中孵育，并分离，以分离10％至30％碘克沙醇之间形成的膜层。隔
离膜可以超声产生aomvs。
[0198]
在某些方面，本文提供了一种从革兰氏阴性细菌中产生复泡原生质体衍生泡(repdvs)的方法。该方法可能包括:a)用二价离子螯合剂或表面活性剂在足以使外膜对化学或酶的破坏敏感的条件下孵育革兰氏阴性细菌；b)用化学或酶的方法从步骤a中去除革兰氏阴性菌细胞壁的外膜和肽聚糖层，从而将革兰氏阴性菌转化为含有内膜而缺乏外膜和肽聚糖层的原生质体；c)破坏原生质体产生囊泡；d)净化小泡；e)将分离的囊泡暴露于碱性ph下，以打开囊泡，从而产生内膜片；f)净化内膜片；g)对净化后的内膜板施加足够的能量或力，使内膜板转化为repdvs。在某些方面，repdvs可以通过图38a所示的方法生成。
[0199]
在某些方面，在足以使外膜对化学或酶的破坏敏感的条件下，用二价离子螯合剂孵育革兰氏阴性细菌的步骤可能包括用二价阳离子螯合剂孵育细菌，如含有乙二胺的试剂(例如，乙二胺四乙酸(edta)或乙二醇
‑
双(β
‑
氨基乙醚)
‑
n,n,n'，n'
‑
四乙酸(egta)或卟啉(如卟啉)。在某些方面，在足以使外膜对化学或酶的破坏敏感的条件下，用表面活性剂孵育革兰氏阴性细菌的步骤可能包括用离子或非离子清洁剂孵育细菌。在某些方面，可以使用非离子洗涤剂，如tween或triton，例如tween
‑
20或triton x
‑
100。
[0200]
如本文所述，通过化学或酶法去除外膜和肽聚糖层可能涉及使用一种或多种二价离子螯合剂和一种具有活性的酶来产生原生质体。
[0201]
在某些方面，破坏原生质体以产生囊泡可能涉及机械、电或化学方法。这些方法的例子包括使用渗透、电穿孔、超声、均质化、洗涤剂处理、冻融、挤压、机械降解和化学处理，但不限于此。在机械降解方法中，原生质体的溶液与金属、陶瓷或足够硬的塑料球一起摇动。在某些方面，原生质体的破坏可能包括对原生质体施加剪切力。剪切力可以通过挤压原生质体来施加。挤压可以包括迫使原生质体通过小于原生质体大小的孔。在挤压过程中，原生质体可能被迫依次通过一系列孔径减小的过滤器。例如原生质体依次通过3个孔径分别为10μm
→
5μm
→
1μm的过滤器形成囊泡。
[0202]
在某些方面，原生质体的破坏可能包括对球状体施加声能或力。可以通过超声装置来应用声能。超声条件可以根据所需的干扰能量进行调整。例如，低温、低能量和/或短时间的超声波可以用于破坏原生质体产生囊泡。由原生质体分裂产生的由内膜组成的囊泡可以使用任何合适的方法纯化，如离心(如密度梯度离心或密度梯度超离心)、过滤、聚乙二醇沉淀或其他合适的方法。
[0203]
在某些方面，可以根据密度分离由内膜组成的囊泡，分离出直径在10nm
‑
700nm范围内的囊泡。这种囊泡在这里被称为原生质体衍生的纳米囊泡(pdnvs)或简单地称为原生质体衍生的囊泡(pdvs)。然后，pdvs可能会受到一个碱性ph足以导致囊泡打开释放任何胞质或周质内容物，如本文中生成aomvs的方法所述。
[0204]
打开表产生的内膜的刚才可能纯化使用任何合适的方法(例如,离心分离(例如,密度梯度离心法或密度梯度超速离心法),过滤,或另一个合适的方法,如大小排斥、透析,切向流过滤等)。
[0205]
在某些方面，产生repdvs的方法可能涉及对纯化的内膜施加足够的能量，将内膜板转化为repdvs。适当的能量来源包括温和的声波、剪切力、声波、冻融等。在某些方面，纯化的内膜片可以被超声处理一段足够长的时间，以将内膜片转化为repdvs。在某些方面，可以使用超声波浴来生成repdvs。
[0206]
与pdvs相比，repdvs的开囊、纯化膜和关闭纯化膜的步骤提高了其纯度。例如，这些步骤提供了一个repdvs的组合，其中组合中每蛋白质总量的repdvs的数量至少比每蛋白质总量的pdvs的数量高2x、3x、4x甚至5x。前述内容提供了由公开的方法生成的repdvs的其他特性。
[0207]
本文提供了一种从革兰氏阳性细菌中生成重泡原生质体(repdvs)的方法。所述方法可包括:a)酶法或化学法除去革兰氏阳性细菌细胞壁中的肽聚糖层，从而将革兰氏阳性细菌转化为包含内膜而缺乏细胞壁的原生质体；b)破坏原生质体产生囊泡；c)净化小泡；d)将分离的囊泡暴露于碱性ph中，以打开囊泡，从而产生内膜片；e)净化内膜片；f)对净化后的内膜板施加足够的能量或力，将内膜板转化为repdvs。
[0208]
从革兰氏阳性细菌产生repdvs的方法与从革兰氏阴性细菌产生repdvs的方法相似，只是不需要去除外膜的步骤。
[0209]
这里使用的孵育或将囊泡暴露于碱性ph的步骤可能包括使用ph为9
‑
14的碱性溶液，例如ph为10
‑
14、ph为11
‑
14、ph为12
‑
14或ph为13
‑
14。
[0210]
任何革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌都可以使用本文所述的方法产生囊泡。在某些方面，革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌可能是前面所列的。制作负载治疗剂的aomvs和repdvs的方法
[0211]
本文描述的aomvs和repdvs可能装载了治疗剂。在某些方面，治疗剂可能是一种增强aomv和repdv的免疫激活效应和/或肿瘤效应的药物。在某些方面，治疗药物可能是干扰素基因刺激因子(sting)的激动剂。在某些方面，sting激动剂可能是sting的配体。在某些方面，sting的配体可能是5,6
‑
二甲基杂蒽酮
‑4‑
乙酸(dmxaa)或mk
‑
1454，一种合成的环二核苷酸(cdn)。
[0212]
在某些方面,可以运用能量(例如,通过声波降解法)将治疗剂如sting激动剂加载到aomvs和repdvs的混合物纯化外膜,从而形成负载有治疗剂的aomvs和repdvs。分离或分馏步骤可用于从载有治疗剂的aomvs或repdvs中分离出未装载的aomvs或repdvs和自由的治疗剂。该分馏步骤可能涉及使用10％、30％和50％碘二醇形成的密度梯度分离混合物，收集在30％和50％或10％和30％碘二醇之间形成的层，以获得载有治疗剂的aomvs或repdvs。制作肿瘤囊泡的方法
[0213]
本发明中肿瘤囊泡的组分和产生方法可以使用任何合适的方法生成，如在此文中引用us9220763或wo2018171947中公开的方法。简单来说，通过差速离心可以从表达肿瘤抗原的细胞培养或肿瘤组织中分离肿瘤囊泡。在某些方面，肿瘤细胞可能被破坏而形成肿瘤囊泡。在某些方面，可以从病人的肿瘤样本中培养细胞，并分离出细胞分泌的肿瘤小泡。在某些实施例中，肿瘤样本是来自病人的生物液体，例如来自受试者的淋巴液、腹水、血液或脊髓液。
[0214]
当癌细胞出现在实体瘤中时，实体瘤中释放的肿瘤囊泡可以通过消化组织和/或切割组织产生多个组织块来分离；并从消化和/或切割的组织块中分离细胞外囊泡。
[0215]
在某些方面，ev可以进一步处理，将细胞外囊泡暴露于ph范围为9至14的碱性环境中，以分离膜并重新闭合细胞膜，形成囊泡状的肿瘤囊泡。
[0216]
在某些方面，产生肿瘤泡的方法可能包括从肿瘤组织中分离细胞；通过挤压、超声、细胞裂解、均质化、冻融、电穿孔、机械降解和/或化学处理从细胞悬浮液中构建囊泡；并
从悬浮液中分离出构建的囊泡。所构建的囊泡可以进一步处理，将细胞外囊泡暴露于ph范围为9至14的碱性环境中以获得膜；隔离膜；并重新闭合细胞膜以产生重泡化的肿瘤囊泡(retv)。使用囊泡的方法细菌囊泡
[0217]
此处提及的包含细菌囊泡的组合物可用于诱导对产生囊泡的细菌的免疫反应。免疫反应可能足以防止细菌感染或治疗细菌引起的疾病。
[0218]
在某些方面，提供了一种在哺乳动物中产生对革兰氏阴性细菌的免疫反应的方法。该方法可包括给药一种组合物，该组合物包括由革兰氏阴性菌产生的非自然产生的人工外膜囊泡(aomvs)，其中aomvs缺乏革兰氏阴性菌中存在的下列一种或多种成分:内膜蛋白、核酸、细胞质蛋白和核糖体；和/或其中aomvs富集外膜蛋白。在某些方面，aomvs如应用程序的前几节所述。例如，aomvs的直径为50nm
‑
150nm。aomvs可能来源于一种革兰氏阴性细菌，这种细菌经过基因修饰可以减少脂多糖(lps)的产生。革兰氏阴性菌可能被基因修饰以增加内源性外膜蛋白的表达。革兰氏阴性菌可以通过基因修饰在外膜上表达异种蛋白。这种异源蛋白可能是一种癌症抗原。该异源蛋白可能是来自另一种革兰氏阴性菌的外膜蛋白。该组合物可以包括由第一革兰氏阴性菌产生的omvs和由第二革兰氏阴性菌产生的omvs，其中第一和第二革兰氏阴性菌是不同的菌株、不同的种或不同的属。
[0219]
在哺乳动物实验对象中，该组合物的剂量可有效地诱导对革兰氏阴性菌的免疫反应。给药引起的免疫反应可能是产生针对革兰氏阴性菌的抗体和/或激活t细胞，如th1。
[0220]
在某些方面，与给药由革兰氏阴性菌释放的自然发生的omvs相比，给药产生的炎症反应减少。与由革兰氏阴性菌释放的自然发生的omvs相比，炎症反应的减少可能包括低水平的促炎细胞因子的产生。与由革兰氏阴性菌释放的自然发生的omvs相比，炎症反应的减少可能包括产生更低水平的肿瘤坏死因子(tnf
‑
α)和/或白细胞介素
‑
6(il
‑
6)。
[0221]
在某些方面，与给药由革兰氏阴性菌释放的自然产生的omvs相比，给药产生的毒性反应降低了。毒性反应可能包括白细胞数量减少、血小板数量减少和/或体重减少。
[0222]
在某些方面，一种在哺乳动物受试者中产生对革兰氏阴性菌的免疫应答的方法，可能包括将本文所披露的革兰氏阴性菌产生的repdvs的组合物给予受试者，其剂量可有效地诱导对哺乳动物受试者中的革兰氏阴性菌的免疫应答。如前几节所述，repdvs可能缺乏来自革兰氏阴性细菌的下列一种或多种成分:外膜蛋白、核酸、细胞质蛋白和核糖体。在某些方面，repdvs的革兰氏阴性菌可能被转基因，以减少脂多糖(lps)的生产。在某些方面，该组合可能包括由第一革兰氏阴性菌生成的repdnvs和由第二革兰氏阴性菌生成的repdnvs，其中第一和第二革兰氏阴性菌是不同的菌株、不同的种或不同的属。在某些方面，repdnv的直径为50nm
‑
150nm。
[0223]
在某些方面，与给药革兰氏阴性菌衍生的pdvs相比，给药产生的炎症反应减少。与使用革兰氏阴性细菌衍生的pdvs相比，炎症反应的减少可能包括低水平的促炎细胞因子的产生。与使用革兰氏阴性菌衍生的pdvs相比，炎症反应的减少可能包括产生更低水平的肿瘤坏死因子(tnf
‑
α)和/或白细胞介素
‑
6(il
‑
6)。
[0224]
在某些方面，与使用革兰氏阴性细菌衍生的pdvs相比，使用pdvs产生的毒性反应降低了。毒性反应可能包括白细胞数量减少、血小板数量减少和/或体重减少。
[0225]
在某些方面，提供了一种在哺乳动物中产生对革兰氏阳性细菌的免疫反应的方法。该方法可包括将由本文所披露的革兰氏阳性细菌产生的repdvs组成的组合物给予受试者，其剂量可有效地诱导哺乳动物受试者对革兰氏阳性细菌的免疫反应。如前几节所述，repdvs可能缺乏产生repdvs的革兰氏阳性细菌中的一种或多种成分:核酸、细胞质蛋白和核糖体。
[0226]
在某些方面，细菌囊泡的组成成分，如aomvs和repdvs，可用于预防或治疗细菌感染，例如，由用于产生aomvs或repdvs的同一细菌感染。
[0227]
治疗或预防由致病菌引起的任何疾病。在某些方面，哺乳动物已经或正处于由致病菌引起的疾病或失调的危险之中。例如，哺乳动物有或有可能发展成结核病、肺炎、败血症、腹泻、破伤风、伤寒、白喉、梅毒、脑膜炎、尿路感染或麻风病。
[0228]
在某些方面，哺乳动物有或正处于发生败血症的风险，其中omvs或repdvs是由引起败血症的大肠杆菌菌株产生的。在某些方面，哺乳动物有或有患肺炎的风险，其中omvs或repdvs是由铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)产生的。
[0229]
在某些方面，可以评估由细菌引起的疾病或感染的受试者，以确定病原体，例如，确定细菌菌株的类型，aomvs或repdvs可能由同一菌株的细菌衍生。肿瘤囊泡和细菌囊泡
[0230]
前几节描述的肿瘤囊泡(例如ev或retv)和细菌囊泡(aomvs和/或repdvs)的组合物可用于在哺乳动物中诱导对肿瘤的免疫反应。免疫反应可能对治疗哺乳动物肿瘤有效。在某些方面，管理本发明的成分可能会减少受试者体内癌细胞的生长和/或减少受试者体内肿瘤的体积。
[0231]
在某些方面，一种治疗哺乳动物癌症的方法可能包括给药一种由革兰氏阴性菌产生的人造外膜囊泡(aomvs)组成的组合物，其中aomvs缺乏革兰氏阴性菌中存在的下列一种或多种成分:内膜蛋白、核酸、细胞质蛋白和核糖体，以及/或其中的omvs富含外膜蛋白；其中肿瘤囊泡包含至少一个肿瘤抗原。
[0232]
在某些方面，治疗哺乳动物癌症的方法可能包括给药由革兰氏阴性菌产生的人工外膜囊泡(aomvs)，其中aomvs缺乏革兰氏阴性菌中存在的一种或多种成分:内膜蛋白、核酸、细胞质蛋白和核糖体，以及/或其中的omvs富含外膜蛋白；肿瘤囊泡包含至少一个肿瘤抗原。aomvs和肿瘤囊泡的管理可以同时进行或依次进行。例如，aomvs和肿瘤囊泡可以同时给药(例如，在12小时、6小时、3小时、1小时、30分钟、10分钟或5分钟内)。在某些方面，治疗癌症的方法可能包括顺序给药，首先给aomvs，然后给肿瘤囊泡，反之亦然。例如，在序贯给药期间，aomvs和肿瘤囊泡的给药间隔可能超过12小时，例如超过24小时，例如12小时
‑
5天。在某些方面，aomvs和肿瘤囊泡的给药途径可能是相同的。在某些方面，aomvs和肿瘤囊泡的给药部位可能是相同的，例如，相距10厘米，如0.1厘米至5厘米。
[0233]
在某些方面，肿瘤囊泡是从哺乳动物的肿瘤中分离出来的。肿瘤可以是以下列出的任何肿瘤，如结肠肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胃肿瘤或胰腺肿瘤。
[0234]
在某些方面，如前所述，肿瘤囊泡是从癌细胞系产生的培养液中分离出来的。
[0235]
在某些方面，与给药由同一细菌释放的自然产生的omvs或来自同一细菌的pdvs相比，给药由本文提供的细菌囊泡和肿瘤囊泡组成的组合物产生的炎症反应减少。
[0236]
在某些方面，注射产生针对肿瘤的抗体和/或激活针对肿瘤的t细胞反应(如th1细
胞反应)。
[0237]
在此列出的任何类型的癌症都可以使用本披露的成分进行治疗。在某些方面，所述组合物中存在的肿瘤泡可与待治疗对象的癌症类型相匹配。
[0238]
在某些方面，哺乳动物体内的肿瘤是结肠肿瘤，肿瘤囊泡是从结肠肿瘤中分离出来的；哺乳动物体内的肿瘤是结肠肿瘤，肿瘤囊泡也可以是从结肠癌细胞系中分离出来的；肿瘤在哺乳动物是肺肿瘤，肿瘤囊泡是从肺肿瘤中分离出来的，肿瘤囊泡也可以是从肺癌细胞系中分离出来的；肿瘤在哺乳动物是黑色素瘤，肿瘤囊泡是从黑色素瘤中分离出来的，肿瘤囊泡也可以是从黑色素瘤细胞系中分离出来的；肿瘤在哺乳动物是乳腺肿瘤，肿瘤囊泡是从乳腺肿瘤中分离出来的，肿瘤囊泡也可以是从乳腺癌细胞系中分离出来的；肿瘤在哺乳动物是卵巢肿瘤，肿瘤囊泡是从卵巢肿瘤中分离出来的，肿瘤囊泡也可以是从卵巢肿瘤细胞系中分离出来的。
[0239]
本文提供的数据表明，细菌囊泡(如aomvs)提供的免疫应答优于传统佐剂，如由铝组成的佐剂，如羟基磷酸硫酸铝(aahs)、氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝钾(明矾)；不完全弗氏佐剂；和/或胞嘧啶磷酸鸟嘌呤(cpg)。
[0240]
在某些方面，治疗癌症的方法可能包括给药，该组合物包括本发明公开的细菌囊泡(例如，aomv)和本发明公开的肿瘤囊泡(例如，ev)，其中该组合物不包括佐剂。
[0241]
在某些方面，治疗会导致诱导的抗肿瘤囊泡抗体的滴度超过使用佐剂而不是aomv诱导的抗肿瘤囊泡抗体滴度的两倍(例如，超过3x、4x或5x)。
[0242]
在某些方面，一种治疗哺乳动物肿瘤的方法可能包括给被试注射一种组合物，该组合物包括本发明公开的细菌囊泡(例如，aomv)和本发明公开的肿瘤囊泡(例如，ev)，以及给被试注射抗pd1抗体。该组合物和抗pd1抗体可同时给药(例如，在单一组合物中或在一天内单独给药)。所述组合物和抗pd1抗体可以在不同的时间给药，例如，所述抗pd1抗体可以在所述组合物之前给药，反之亦然。在某些方面，治疗方案可能包括多次给药的组合物和抗pd1抗体。
[0243]
在某些方面，用于哺乳动物癌症治疗的细菌囊泡(如本文所披露的aomvs)可能装载了治疗剂。治疗药物可能是sting激动剂，如sting配体。在某些方面，sting配体可能是dmxaa。如上述例子所示，aomv负载sting配体dmxaa诱导的ifn
‑
β反应明显高于aomv单独或dmxaa单独产生的ifn
‑
β反应(5倍以上)，表明aomv和dmxaa在诱导ifn
‑
β反应方面具有很强的协同作用。免疫接种
[0244]
用作疫苗或治疗的免疫原性成分可能包括免疫有效数量的活性成分，如用于治疗或预防细菌感染的细菌泡(aomvs或repdvs)，以及用于治疗癌症的组合成分(如肿瘤泡和aomvs或repdvs)。以及任何其他需要的兼容组件。“免疫有效剂量”指的是给一个人注射该剂量，无论是单次注射还是作为一系列注射的一部分，都能有效地诱发治疗或预防。这个数量变化取决于个人的健康和身体状况将被处理,年龄,个人的分类组治疗(例如,非人类的灵长类动物,灵长类动物,人类,等等),个人的能力合成抗体,免疫系统保护的程度,制定的疫苗,治疗医师对病情及其他相关因素的评估。预计该剂量将下降在一个相对较大的范围内，可以通过常规试验确定。
[0245]
剂量方案可以是单一剂量计划，也可以是多个剂量计划(例如，包括加强剂量)，其
单位剂量形式是在不同时间给药的组合物。本发明所称单位剂型，是指适用于人和动物实验对象的单一剂量的物理离散单位，每个单位含有本发明组合物的预定数量，且数量足以产生预期效果；与药物可接受的赋形剂(例如，药物可接受的稀释剂、载体或载体)联合提供的组合物。该疫苗可与其他免疫调节剂联合使用。
[0246]
所述组合物的剂量能有效地引起受试者的免疫反应，特别是体液免疫反应。这种混合物的免疫剂量一般为每70公斤病人约0.001毫克至约1.0毫克，更常见的为每70公斤病人约0.001毫克至约0.2毫克。每个病人每天可使用0.001至10毫克的剂量，特别是当该成分被施用于隐蔽的部位而不是进入血流，如进入体腔或器官腔内时。在口服、鼻腔或外用时，可大大增加剂量(如10至100毫克或更多)。最初给药时，可随后用同一种不同的混合剂进行加强免疫，至少使用一种加强剂，通常多使用两种。给药途径
[0247]
本披露考虑以任何适当的方式管理所披露的组合。适当的给药途径包括肠外(如肌肉注射、静脉注射、皮下(如注射)、腹腔内、胸骨内、关节内、腹腔内、脑内(实质内)和脑室内)、口腔、鼻腔、阴道、舌下、眼内、直肠、局部(如经皮)、舌下神经和吸入。在某些方面，可以将细菌囊泡和肿瘤囊泡的组成物注射到肿瘤内或肿瘤的邻近部位。在某些方面，细菌囊泡的组合物和肿瘤囊泡的组合物可以同时给被试。
[0248]
目前披露的思考方法在目前的信息披露管理的作品主题至少每天两次,每天至少一次,每48小时至少一次,每72小时至少一次,每周至少一次,至少每两周或每月一次。联合治疗
[0249]
本发明设想将本发明提供的组合物与一种或多种活性治疗剂或其他预防或治疗方式结合使用。在这种联合治疗中，各种活性药物往往有不同的作用机制。通过允许减少一种或多种药物的剂量，从而减少或消除与一种或多种药物相关的不良反应，这种联合疗法可能特别有利；此外，这种联合治疗可能对潜在的疾病、障碍或状况具有协同治疗或预防作用。
[0250]
此处使用的“联合”指的是可以单独给药的治疗，例如，可以单独配制用于单独给药的治疗(例如，可以在试剂盒中提供)，以及可以在单一配方中一起给药的治疗(即“联合配方”)。
[0251]
在某些实施例中，按顺序管理或应用本公开的组合物，例如，在一个代理之前管理一个或多个其他代理。在其他实施例中，组合物是同时施予的，例如，在或大约同时施予两个或多个组合物；这两种或两种以上的组合物可以存在于两种或两种以上的单独配方中，也可以组合成单一的配方(即联合配方)。无论两个或多个组合是按顺序或同时管理的，就本披露的目的而言，它们都被认为是组合管理的。
[0252]
本发明专利技术的组合物可与用于治疗、预防、抑制或改善本文所述疾病、失调或状况的其他制剂联合使用，包括那些通常用于患有细菌感染或癌症的患者的制剂。
[0253]
在某些方面，治疗对象癌症的方法可能包括对对象施用aomvs、肿瘤泡和抗肿瘤药物(如免疫治疗剂或化疗药物)。
[0254]
有用的免疫治疗药物包括:抗pd
‑
1抗体、抗pd
‑
l1抗体、ctla
‑
4、lag
‑
3、tim
‑
3等其他免疫检测点标志物的抑制剂，如抗ctla抗体、抗lag
‑
3抗体和/或抗tim
‑
3抗体。anti
‑
pd
‑
1/pd
‑
l1免疫疗法可能包括但不限于如管理主体的有效量的一个或多个
(nivolumab)(pembrolizumab)tecentriq
tm
(atezolizumab)durvalumab(medi4736)avelumab(msb0010718c),bms
‑
936559(mdx
‑
1105),ca
‑
170,bms
‑
202,bms
‑
8bms
‑
37,bms
‑
242等。
[0255]
化疗药物的非限制性例子包括烷基化剂(如亚硝基脲)、抗代谢物(如甲氨蝶呤)、抗肿瘤抗生素(如蒽环类)、植物生物碱(如长春花生物碱、紫杉烷等)、拓扑omerase抑制剂和类固醇激素。披露的非限制性方面的例子
[0256]
上述所述当前主题的方面(包括实施例)可单独或与一个或多个其他方面或实施例相结合是有益的。在不限制上述描述的情况下，下文提供了披露的某些非限制性方面。在阅读此揭露时，对于明白和掌握这些技能的人来说将是明显的，每一个单独编号的方面可以被使用或与任何前面或后面单独编号的方面相结合。这旨在为所有这些方面的组合提供支持，包括但不限于以下明确规定的方面的组合:1.一种由革兰氏阴性细菌产生的非自然产生的人工外膜泡(aomvs)组成的组合物，其中omvs缺乏革兰氏阴性菌中存在的下列一种或多种成分:周质蛋白、内膜蛋白、核酸、细胞质蛋白和核糖体；和/或omvs富含外膜蛋白。2.第1条所列组分，其中aomvs的直径为50nm
‑
150nm。3.第1或2条所列组分，其中革兰氏阴性菌经过基因修饰以减少脂多糖(lps)的产生。4.第1
‑
3条所列组分，其中革兰氏阴性菌经过基因修饰以增加至少一种内源性外膜蛋白的表达。5.第1
‑
4条所列组分，其中革兰氏阴性菌经过基因修饰以在外膜中表达至少一种异种蛋白。6.第5条所列组分，其中至少一个异源蛋白包括癌症抗原。7.第5条所列组分，其中至少一个异源蛋白包括来自不同革兰氏阴性菌的外膜蛋白。8.第1
‑
7条所列组分，其中aomvs是由某种革兰氏阴性菌产生的，该组合还包括由第二种革兰氏阴性菌产生的aomvs，其中第一和第二革兰氏阴性菌是不同的菌株、不同的种或不同的属。9.一种在哺乳动物实验对象中产生对革兰氏阴性菌的免疫反应的方法，该方法包括将1
‑
8所列组分的任何一个组合物施加于实验对象，其数量能有效地诱导对哺乳动物实验对象中的革兰氏阴性菌的免疫反应。10.第9条所列方法，其中与自然发生的omvs相比，注射程序能够减少针对革兰氏阴性细菌的炎症反应。11.第10条所列方法，其中减少的炎症反应包括降低促炎细胞因子的产生。12.第10条所列方法，其中减少的炎症反应包括较低水平的肿瘤坏死因子α(tnf
‑
α)和/或白介素
‑
6(il
‑
6)的产生。13.第9条所列方法，其中给药aomvs产生的毒性反应比给自然发生的由革兰氏阴性细菌释放的omvs产生的毒性反应减少。14.第13条所列的方法，其中减少的毒性反应包括白细胞数量的减少。
15.第13条所列的方法，其中减少的毒性反应包括血小板数量的减少。16.第13条所列的方法，其中减少的毒性反应包括体重的减少。17.所述方法包括9
‑
16方面中的任何一个方面，其中所述免疫反应包括产生针对革兰氏阴性细菌的抗体。18.方法9
‑
17中任何一个方面，其中免疫反应包括活化t细胞。19.方法9
‑
18中任何一个方面，其中哺乳动物有或有发生败血症的风险，其中aomvs是由引起败血症的大肠杆菌(大肠杆菌)菌株产生的。20.方法9
‑
18中任何一个方面，其中哺乳动物主体有或有发展为肺炎的风险，其中aomvs是由铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)产生的。21.一个成分组成:由革兰氏阴性菌产生的人工外膜囊泡(aomvs)，其中aomvs缺乏革兰氏阴性菌中存在的一种或多种成分:内膜蛋白、核酸、胞浆蛋白和核糖体，和/或其中aomvs富集外膜蛋白；和肿瘤囊泡，其中肿瘤囊泡包含至少一个肿瘤抗原。22.第21条所列的方法，其中肿瘤囊泡为直径为100nm
‑
200nm的大肿瘤囊泡。23.第21条所列的方法，其中肿瘤囊泡为直径为40nm
‑
100nm的小肿瘤囊泡。24.第21条所列的方法，其中肿瘤囊泡由直径为100nm
‑
200nm的大肿瘤囊泡和直径为40nm
‑
100nm的小肿瘤囊泡组成。25.从哺乳动物的肿瘤中分离出的肿瘤囊泡。26.第25条所列的组分，其中肿瘤可以是结肠肿瘤、肺肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、胃肿瘤或胰腺肿瘤。27. 21
‑
24中任何一个方面的组成部分，其中肿瘤囊泡是从癌细胞系产生的含有肿瘤泡的培养基中分离出来的。28.第27条的组成部分，其中癌细胞系表达至少一种癌症新抗原。29.第28条的组成部分，其中肿瘤新抗原由存在于受试者中的癌细胞表达。30.第28条的组成部分，其中肿瘤新抗原是由存在于多个受试者中的癌细胞表达的保守的肿瘤新抗原。31. 28
‑
30中任何一个方面的组成部分，其中癌新抗原由一个突变的癌基因编码。32. 21
‑
31中任意一个方面的组成，其中aomvs的直径为50nm
‑
150nm。33. 21
‑
32中任意一个方面的组成，其中革兰氏阴性细菌经过基因修饰，与未修饰的亲本细菌产生的lps相比，其产生的脂多糖(lps)减少。34. 21
‑
33中任意一个方面的组成部分，其中革兰氏阴性菌经过基因修饰以增加至少一种内源性外膜蛋白的表达。35. 21
‑
34中任何一个方面的组成部分，其中革兰氏阴性菌经过基因修饰以在外膜中表达至少一种异种蛋白。36.第35条的组成部分，其中至少一个异源蛋白包括癌症抗原。37.第35条的组成部分，其中至少一个异源蛋白包括来自不同革兰氏阴性菌的外膜蛋白。38.其中aomvs是由第一种革兰氏阴性菌产生的，该组合还包括由第二种革兰氏阴性菌产生的aomvs，其中第一和第二革兰氏阴性菌是不同的菌株、不同的种或不同的属。39.一种用于诱导针对哺乳动物受试者肿瘤的免疫反应的方法，该方法包括将21
‑
38中的任何一个成分以有效的量注入哺乳动物受试者，以诱导对哺乳动物受试者肿瘤的免疫反应。40.第39条所述方法，其中与自然发生的omvs相比，注射程序能够减少针对革兰氏阴性细菌的炎症反应。41.第39或40所述方法，其中给药产生针对肿瘤的抗体。42.第39
‑
41所述方法，其中注射aomvs激活t细胞对肿瘤的反应。43. 39
‑
42中任何一个所述方法，其中肿瘤囊泡从肿瘤中分离出来。44.其中39
‑
42中任何一个所述方法，其中在某些方面，哺乳动物体内的肿瘤是结肠肿瘤，肿瘤囊泡是从结肠肿瘤中分离出来的；哺乳动物体内的肿瘤是结肠肿瘤，肿瘤囊泡也可以是从结肠癌细胞系中分离出来的；肿瘤在哺乳动物是肺肿瘤，肿瘤囊泡是从肺肿瘤中分离出来的，肿瘤囊泡也可以是从肺癌细胞系中分离出来的；肿瘤在哺乳动物是黑色素瘤，肿瘤囊泡是从黑色素瘤中分离出来的，肿瘤囊泡也可以是从黑色素瘤细胞系中分离出来的；肿瘤在哺乳动物是乳腺肿瘤，肿瘤囊泡是从乳腺肿瘤中分离出来的，肿瘤囊泡也可以是从乳腺癌细胞系中分离出来的；肿瘤在哺乳动物是卵巢肿瘤，肿瘤囊泡是从卵巢肿瘤中分离出来的，肿瘤囊泡也可以是从卵巢肿瘤细胞系中分离出来的。45.一种用于在哺乳动物对象中治疗癌症的方法，该方法包括将21
‑
38中任何一个方面的成分以有效的量施予哺乳动物对象，以治疗哺乳动物对象中的癌症。46.第45所述方法，其中的治疗减少癌细胞的生长。47.第45或46所述方法，其中治疗减少了哺乳动物肿瘤的体积。48.第45
‑
47所述，其中与自然发生的omvs相比，注射程序能够减少针对革兰氏阴性细菌的炎症反应。49.第48所述方法，其中炎症反应包括促炎细胞因子的产生。50.一种从革兰氏阴性细菌产生非自然发生的人工外膜囊泡(aomvs)的方法，该方法包括:a)破坏由革兰氏阴性菌产生的球状体，产生由外膜组成的囊泡和由内膜组成的囊泡；b)将囊泡暴露于离子表面活性剂，以破坏包含内膜的囊泡，并暴露于碱性ph，以打开包含外膜的囊泡，从而产生外膜片；c)净化外膜片；和d)对净化后的外膜板施加足够的能量，使外膜板转化为aomvs，从而产生非自然发生的aomvs。51.第50所述方法，包括通过将革兰氏阴性菌与溶菌酶在足以去除革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖层的条件下培养，从而将革兰氏阴性菌转化为球状体，从而从革兰氏阴性菌产生球状体。52.第50或51所述方法，其中破坏所述球状体以产生囊泡包括对所述球状体施加剪切力。53.第50或51所述方法，其中破坏所述球状体以产生囊泡，包括将声能应用于所述球状体。54.第50
‑
53所述方法，其中步骤b)包括将囊泡暴露于离子表面活性剂，以破坏囊泡组成的内膜，隔离囊泡组成的外膜，并将囊泡组成的外膜暴露于碱性ph。55.第50
‑
54所述方法，其中碱性ph包括ph为11
‑
14。56.第50
‑
55所述方法，其中步骤c)包括密度离心。57.第50
‑
55所述方法，其中步骤d)包括对纯化的外膜片施加剪切力。
58.第50
‑
55所述方法，其中步骤d)包括将声能应用于纯化的外膜板。59.一种由革兰氏阴性细菌产生的空泡原生质体衍生小泡(repdvs)组成的组合物，其中repdvs缺乏革兰氏阴性细菌中存在的一种或多种成分:外膜蛋白、核酸、细胞质蛋白和核糖体。60.第59所述组分，其中革兰氏阴性菌经过基因修饰以减少脂多糖(lps)的产生。61.第59或60所述组分，其中repdvs由第一革兰氏阴性菌生成，该组成部分还包括第二革兰氏阴性菌生成的repdvs，其中第一和第二革兰氏阴性菌是不同的菌株、不同的物种或不同的属。62.第60或61所述组分，其中repdvs的直径为50nm
‑
150nm。63.一种由革兰氏阳性细菌产生的空泡原生质体衍生小泡(repdvs)组成的组合物，其中repdvs缺乏革兰氏阳性细菌中存在的一种或多种成分:核酸、细胞质蛋白和核糖体。64.第63所述组分，其中repdvs由第一种革兰氏阳性细菌生成，该组成部分进一步包括第二种革兰氏阳性细菌生成的repdvs，其中第一和第二革兰氏阳性细菌是不同的菌株、不同的物种或不同的属。65.第63或64所述组分，其中repdvs的直径为50nm
‑
150nm。66.一种在哺乳动物受试者中产生对革兰氏阴性菌的免疫反应的方法，该方法包括将任何方面59
‑
62的组合物施加给受试者，其数量能有效地诱导对哺乳动物受试者中的革兰氏阴性菌的免疫反应。67.第66所述方法，其中免疫反应包括产生针对革兰氏阴性细菌的抗体。68.第66所述方法，其中免疫反应包括活化t细胞。69.第66
‑
68所述方法，在哺乳动物对象患败血症的风险,其中输注repdvs产生的应变大肠杆菌(大肠杆菌)败血症的风险较输注pdvs产生的应变大肠杆菌(大肠杆菌)败血症风险要小。70.第66
–
68所述方法,在哺乳动物患肺炎的风险,其中输注repdvs产生铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)风险较pdvs产生铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)风险要小。71.一种对哺乳动物实验对象中的革兰氏阳性细菌产生免疫反应的方法，该方法包括将63
‑
65的任何一个成分施加给实验对象，其剂量能有效地诱导对哺乳动物实验对象中的革兰氏阳性细菌产生免疫反应。72.第71所述方法，其中免疫反应包括产生针对革兰氏阳性细菌的抗体。73.第71所述方法，其中免疫反应包括活化t细胞。74.一个成分组成:由革兰氏阴性菌产生的重泡原生质体衍生小泡(repdvs)，其中repdvs缺乏革兰氏阴性菌中存在的一种或多种成分:外膜蛋白、核酸、细胞质蛋白和核糖体，或由革兰氏阳性细菌产生的重泡原生质体衍生小泡(repdvs)，其中repdvs缺乏革兰氏阳性细菌中存在的一种或多种成分:核酸、细胞质蛋白和核糖体；和肿瘤囊泡，其中肿瘤囊泡包含至少一个肿瘤抗原。75.第74所述组分，肿瘤囊泡为直径为100nm
‑
200nm的大肿瘤囊泡。76.第74所述组分，肿瘤囊泡为直径为40nm
‑
100nm的小肿瘤囊泡。77.第74所述组分，其中肿瘤囊泡由直径为100nm
‑
200nm的大肿瘤囊泡和直径为
40nm
‑
100nm的小肿瘤囊泡组成。78.从哺乳动物的肿瘤中分离出的肿瘤囊泡。79.第78所述组分，其中肿瘤是结肠肿瘤，肺肿瘤，黑色素瘤，乳腺肿瘤，或卵巢肿瘤。80.方面74
‑
78中的任何一个组成部分，其中肿瘤囊泡是从癌细胞系产生的含有肿瘤泡的培养基中分离出来的。81.第80所述组分，其中癌细胞表达一种癌症新抗原。82.第81所述组分，其中肿瘤新抗原由存在于受试者中的癌细胞表达。83.第81所述组分，其中肿瘤新抗原是由存在于多个受试者中的癌细胞表达的保守的肿瘤新抗原。84.第81
‑
83所述组分，其中癌新抗原由突变癌基因编码。85.一种用于诱导针对哺乳动物受试者肿瘤的免疫反应的方法，该方法包括将第74
‑
84所述组分施加于哺乳动物受试者，其数量有效地诱导对哺乳动物受试者肿瘤的免疫反应。86.第85所述方法，其中repdvs由革兰氏阴性细菌产生，与由革兰氏阴性细菌产生的pdvs相比，repdvs给药产生的炎症反应减少。87.第85所述方法，其中repdvs由革兰氏阳性细菌产生，与由革兰氏阳性细菌产生的pdvs相比，repdvs给药产生的炎症反应减少。88.第85
‑
87所述方法，其中给药产生针对肿瘤的抗体。89.第85
‑
87所述方法，其中给药激活t细胞对肿瘤的反应。90.第85
‑
89所述方法，从肿瘤中分离出肿瘤囊泡的方法。91.第85
‑
89所述方法，其中在某些方面，哺乳动物体内的肿瘤是结肠肿瘤，肿瘤囊泡是从结肠肿瘤中分离出来的；哺乳动物体内的肿瘤是结肠肿瘤，肿瘤囊泡也可以是从结肠癌细胞系中分离出来的；肿瘤在哺乳动物是肺肿瘤，肿瘤囊泡是从肺肿瘤中分离出来的，肿瘤囊泡也可以是从肺癌细胞系中分离出来的；肿瘤在哺乳动物是黑色素瘤，肿瘤囊泡是从黑色素瘤中分离出来的，肿瘤囊泡也可以是从黑色素瘤细胞系中分离出来的；肿瘤在哺乳动物是乳腺肿瘤，肿瘤囊泡是从乳腺肿瘤中分离出来的，肿瘤囊泡也可以是从乳腺癌细胞系中分离出来的；肿瘤在哺乳动物是卵巢肿瘤，肿瘤囊泡是从卵巢肿瘤中分离出来的，肿瘤囊泡也可以是从卵巢肿瘤细胞系中分离出来的。92.一种用于在哺乳动物对象中治疗癌症的方法，该方法包括将第74
‑
84所述方法和第139
‑
143所述方法中的任何一个组成部分以有效的数量施予哺乳动物对象，以治疗哺乳动物对象中的癌症。93.第92所述方法，其中的治疗减少癌细胞的生长。94.第92或93所述方法，其治疗减少了哺乳动物肿瘤的体积。95.一种从革兰氏阴性细菌中产生囊泡的原生质体的方法，该方法包括:a)用二价离子螯合剂在足以使外膜对化学或酶的破坏敏感的条件下培养革兰氏阴性细菌；b)用化学或酶的方法从步骤a中去除革兰氏阴性菌细胞壁的外膜和肽聚糖层，从而将革兰氏阴性菌转化为含有内膜而缺乏外膜和肽聚糖层的原生质体；c)破坏原生质体产生囊泡；d)净化小泡；e)将分离的囊泡暴露于碱性ph下，以打开囊泡，从而产生内膜片；f)净化内膜片；和g)对
净化后的内膜板施加足够的能量或力，使内膜板转化为repdvs。96.第95所述方法，其中破坏原生质体以产生囊泡，包括挤压原生质体。97.第95或96所述方法，其中碱性ph包括ph为11
‑
14。98.第64
‑
66中的任何一个方法，其中二价离子螯合剂包括乙二胺四乙酸(edta)。99.第95
‑
98中的任何一个方法，其中步骤a)包括用溶菌酶培养革兰氏阴性细菌。100.一种从革兰氏阳性细菌产生复泡原生质体衍生囊泡(repdvs)的方法，该方法包括:a)用酶的或化学的方法去除革兰氏阳性菌细胞壁中的肽聚糖层，从而将革兰氏阳性菌转化为含有内膜而缺乏细胞壁的原生质体；b)破坏原生质体产生囊泡；c)净化小泡；d)将分离的囊泡暴露于碱性ph中，以打开囊泡，从而产生内膜片；e)净化内膜片；和f)对净化后的内膜板施加足够的能量或力，将内膜板转化为repdvs。101.第100所述方法，其中破坏原生质体以产生囊泡，包括挤压原生质体。102.第100或101所述方法，其中碱性ph包括ph为11
‑
14。103.第21
‑
38中任何一个方面的组成部分，其中肿瘤囊泡由复囊化(重泡化)的肿瘤囊泡组成。104.第21
‑
38和103中所述组成部分，其中所述组成部分不包括佐剂。105.第21
‑
38和103
‑
104中所述组成部分，其中aomvs装载有治疗剂。106.第105所述组分，其中治疗剂包括sting激动剂。107.第106所述组分，其中sting激动剂包括环二核苷酸(cdn)或杂蒽酮衍生物dmxaa。108.第39
‑
49和105所述方法，其中该方法不包括对主体进行辅助。109.第45
‑
49和74
‑
84的任何一个组成部分，其中肿瘤囊泡由复囊化的肿瘤囊泡组成。110.第74
‑
84和109中任何一个方面的组成部分，其中所述组成部分不包括佐剂。111.第85
‑
94中任何一个方面的方法，其中肿瘤囊泡由复囊化的肿瘤囊泡组成。112.一种用于在受试者中治疗癌症的方法，该方法包括对受试者施药:由革兰氏阴性菌产生的人工外膜囊泡(aomvs)，其中aomvs缺乏革兰氏阴性菌中存在的一种或多种成分:内膜蛋白、核酸、胞浆蛋白和核糖体，和/或其中aomvs富含外膜蛋白；和肿瘤囊泡，其中肿瘤囊泡包含至少一个肿瘤抗原，其中注射aomvs和肿瘤囊泡的有效量。113.第112所述方法，其中治疗导致对肿瘤囊泡的抗体的诱导，其效价是使用佐剂而不式aomvs诱导的抗肿瘤囊泡抗体效价的两倍以上。114.第113所述方法，其中佐剂包括铝。115.第113所述方法，其中佐剂包括羟基磷酸铝(aahs)，氢氧化铝，磷酸铝，或硫酸铝钾(明矾)。116.第113所述方法，其中佐剂包括不完全弗氏佐剂(ifa)。117.第113所述方法，其中佐剂包括胞嘧啶磷酸鸟嘌呤(cpg)。118.112
‑
117方面中的任何一个的方法，其中所述方法包括对主体施加免疫检查点抑制剂。119.第118所述方法，其中免疫检查点抑制剂包括抗pd
‑
1抗体或抗pd
‑
l1抗体。120.第119所述方法，其中免疫检查点抑制剂包括抗pd
‑
1抗体，其中aomvs、tvs、抗
pd
‑
1抗体导致受试者肿瘤体积减少，其减少程度至少是aomvs和抗pd
‑
1抗体或tvs和抗pd
‑
1抗体的两倍。121.第112
‑
120所述方法，其中aomvs是通过外膜组成的囊泡的复泡制备的。122.第118所述方法，其中泡排包括将囊泡暴露在碱性ph下。123.第122所述方法，其中碱性ph包括ph 9
‑
ph 12。124.第112
‑
123所述方法，其中革兰氏阴性菌是大肠杆菌。125.第112
‑
123所述方法，其中革兰氏阴性菌为铜绿假单胞菌。126.第112
‑
125所述方法，其中肿瘤囊泡(tv)小tv的直径范围从10纳米
‑
100纳米。127.第112
‑
125所述方法，其中肿瘤囊泡(tv)大tv的直径范围从100纳米
‑
500纳米。128.第112
‑
127所述方法，其中肿瘤囊泡包括大的和小的tv。129.第112
‑
128所述方法，其中肿瘤囊泡中包含有聚乙二醇。130.第112
‑
129所述方法，其中的给药包括瘤内注射。131.第112
‑
130所述方法，其中癌症是黑素瘤。132.第112
‑
130所述方法的一个使用例，其中的癌症是结肠癌。133.第112
‑
130所述方法的一个使用例，其中肿瘤囊泡是来源于肿瘤细胞。134.第112
‑
130所述方法，其中omvs装载了治疗剂。135.第134所述方法，其中治疗剂是sting激动剂。136.第135所述方法，其中sting激动剂包括一个sting配体。137.第135所述方法，其中sting激动剂为环状二核苷酸(cdns)或杂蒽酮衍生物dmxaa。138.第137所述方法，其中sting激动剂包括dmxaa。139. 74
‑
84和109
‑
110所述组分，其中re pdv包括一种治疗剂。140.第139所述组分，其中所述治疗剂是sting激动剂。141.第140所述组分，其中sting激动剂包括一个sting配体。142.第140所述组分，其中sting激动剂为环二核苷酸(cdns)或杂蒽酮衍生物dmxaa。143.第142所述组分，其中sting激动剂包括dmxaa。144.人工外膜囊泡(aomvs)和肿瘤囊泡(tvs)用于治疗受试者癌症的方法，该方法包括将aomvs和肿瘤囊泡施加于受试者，其中aomvs是由革兰氏阴性细菌产生的，其中aomvs缺乏革兰氏阴性菌中存在的下列一种或多种成分:内膜蛋白、核酸、细胞质蛋白和核糖体，和/或其中aomvs富含外膜蛋白，其中肿瘤囊泡包含至少一种肿瘤抗原，其中aomvs和肿瘤泡以治疗有效的量给予受试者。145.依据144所述使用的aomvs和tvs，其中使用肿瘤囊泡诱导抗体的效价是佐剂诱导效价的两倍。146.依据145所述使用的aomvs和tvs，其中佐剂包括铝。147.依据145所述使用的aomvs和tvs，其中佐剂包括羟基磷酸铝(aahs)，氢氧化铝，磷酸铝，或硫酸铝钾(明矾)。148.依据145所述使用的aomvs和tvs，其中佐剂包括不完全弗氏佐剂(ifa)。
149.依据145所述使用的aomvs和tvs，其中佐剂包括胞嘧啶磷酸鸟嘌呤(cpg)。150.依据145所述使用的aomvs和tvs，其中所述方法包括对所述主体施加免疫检查点抑制剂。151.依据150所述使用的aomvs和tvs，其中所述免疫检查点抑制剂包括抗pd
‑
1抗体或抗pd
‑
l1抗体。152.依据150所述使用的aomvs和tvs，其中免疫检查点抑制剂包括抗pd
‑
1抗体，其中aomvs、tvs、抗pd
‑
1抗体导致受试者肿瘤体积减少，其减少程度至少是上述药物单独使用时的两倍。153.依据144
‑
152中所使用的aomvs和tv，其中aomvs是由外膜重泡化所获得。154.依据153所使用的aomvs和tv,其中重泡化包括将囊泡暴露在碱性条件下。155.依据154所使用的aomvs和tv,其中碱性ph包括ph 9
‑
ph 12。156.依据154所使用的aomvs和tv的一个使用例,其中革兰氏阴性菌是大肠杆菌。157.依据154所使用的aomvs和tv的一个使用例,其中革兰氏阴性菌是铜绿假单胞菌。158.依据144
‑
155的aomvs和tv的一个使用例，其中肿瘤囊泡(tv)小tv的直径范围从10nm
‑
100nm。159.依据144
‑
155的aomvs和tv的一个使用例，其中肿瘤囊泡(tv)大tv的直径范围从100nm
‑
500nm。160.依据144
‑
155的aomvs和tv的一个使用例，其中肿瘤囊泡包括大tv和小tv。161.依据144
‑
155的aomvs和tv的一个使用例，其中肿瘤囊泡组分中包含聚乙二醇。162.依据144
‑
155的aomvs和tv的一个使用例，其中的注射包括瘤内注射。163.依据144
‑
162的aomvs和tv的一个使用例，其中的癌症是黑色素瘤。164.依据144
‑
162的aomvs和tv的一个使用例，其中的癌症是结肠癌。165.依据144
‑
162的aomvs和tv的一个使用例，其中肿瘤泡来自于受试者的癌细胞。166.依据144
‑
166的aomvs和tv的一个使用例，其中aomvs装载有治疗剂。167.依据166所述的aomvs和tv的使用，其中治疗剂是sting激动剂。168.依据167所述的aomvs和tv的使用，其中sting激动剂包括一个sting配体。169.依据167所述的aomvs和tv的使用，其中sting激动剂环二核苷酸(cdns)或杂蒽酮衍生物dmxaa。170.依据169所述的aomvs和tv的使用，其中sting激动剂包括dmxaa。171.依据144
‑
171中使用，其中aomvs和tv是在一个组合中制定的。172.依据171所述的aomvs和tv的使用，其中组合物进一步包括药物制备上可接受的赋形剂。举例
[0257]
提出以下例子，以便为本领域的普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整披露和描述，并且不打算限制发明者认为他们的发明的范围，也不打算表示下面的实验是全部或唯一进行的实验。前期工作中已作出努力，以确保使用的数字(如数量、温度等)的准
development kit(r&d systems)分析小鼠上清中的细胞因子。分别与1％盐酸和rees
‑
ecker稀释液(thermo fisher scientific)孵育后，使用光镜计数血液中的白细胞和血小板。在生存研究中，在最后一次免疫一周后腹腔注射致死剂量的细菌(1
×
10
10
c.f.u)。然后对小鼠进行5天的致死量、体温和体重监测。结果
[0275]
omvs攻毒前，aomvs免疫小鼠的体重和体温无变化(图19)。
[0276]
在omvs攻毒6小时后，阴性假手术组小鼠体温和体重下降，而aomvs免疫小鼠体温和体重下降明显低于假小鼠(图20)。omvs激发后aomvs免疫小鼠腹膜液中免疫细胞数量增加(图21a)。然而，如果用aomvs免疫小鼠，则检测到数量大大减少(图21,b组)。观察到假手术组小鼠血液中的白细胞和血小板数量减少，心肌肌钙蛋白t水平升高，这是败血性损伤后心脏损伤的标志。然而，接种aomvs的小鼠恢复到正常水平(图22a
‑
c)。此外，与假手术组相比，aomvs免疫小鼠的血液和bal液tnf
‑
α和il
‑
6水平显著降低(图23和24)。综上所述，上述数据表明，与omvs相比，大肠杆菌aomvs可作为一种败血性疾病的有效疫苗。例6:不同剂量的大肠杆菌aomvs的免疫反应特性方法小鼠实验
[0277]
将不同剂量的aomvs(5
×
108,1
×
109,5
×
109)或omvs(5
×
109)腹腔注射给小鼠(野生型c57bl/6遗传背景，6周龄)，每周一次，持续三周。每次注射后3天从小鼠身上取血样，检测其大肠杆菌裂解物或omvs蛋白的特异性抗体。小鼠血清用1％bsa/pbs 1:500稀释，置于96孔板中，板上包有200ng大肠杆菌裂解物或omvs蛋白。孵育2小时后，用过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体检测免疫变化。结果
[0278]
即使是低剂量的aomvs(5
×
108)也可以诱导大肠杆菌omvs或裂解小鼠血液中的蛋白特异性抗体，并在第三次注射后7天达到峰值(图25a
‑
b)。例7:铜绿假单胞菌aomvs的分离和鉴定方法制备aomvs
[0279]
从atcc公司获得一株铜绿假单胞菌pao1。细菌培养物呈球状，采用20mm tris配制的20％蔗糖溶液重悬，ph 8.0(每g细胞4ml)，加入溶菌酶(600μg每g细胞)和0.1m edta(0.2ml每g细胞)。将得到的球质体成球，然后在10mm的冰冷tris中超声，ph 8.0。8000
×
g细胞成球5min，然后从40000
×
g上清液中取全膜成球60min。将膜重悬在蒸馏水中，冷冻解冻，并在0.5％的n
‑
月桂酰肉瘤苷钠中25℃，20分钟。外膜成球(40000x g for 90min)，在25℃下与高ph溶液(200mm na2co3,ph 14.0)孵育1小时。将微丸应用于4ml 50％碘克沙醇(axis
‑
shield poc as)中，然后加入4ml 30％碘克沙醇和2ml 10％碘克沙醇到超离心管中。收集10 0000x g离心2小时后在10％
‑
30％碘二醇之间形成的层。最后，将样品超声30min，得到aomvs。aomvs定量
[0280]
aomvs的蛋白浓度用bradford染色法(bio
‑
rad laboratories)测定。aomv粒子浓度由zetaview分析仪(particle metrix gmbh)测定。测量分为三次评估，每个独立的数据
从两个固定层获得，每层测量五次。在所有测量中，相机灵敏度配置为70。数据采用zetaview分析软件8.2.30.1进行分析。omvs的制备
[0281]
铜绿假单胞菌培养物在6000
×
g、4℃、20min条件下成球2次，上清液通过0.45μm真空过滤器过滤，用vivflow 200模块(sartorius)超滤，100kda截流膜浓缩。保留物再次通过0.22μm真空过滤器过滤，以除去任何剩余的细胞。滤液15 0000
×
g,4℃超速离心3h,pbs重悬。透射电子显微镜法
[0282]
在加载aomvs之前，对碳铜/碳铜网格(电子显微镜科学)进行辉光放电处理。aomvs在蒸馏水中洗涤两次，然后用2.5％戊二醛溶解的pbs固定。在过滤水中进一步洗涤两次后，用2％醋酸铀酰对样品进行1.5分钟的染色。阴性染色样品在120kv、veleta ccd相机(olympus
‑
sis)的数字化leo 912ab omega电子显微镜(carl zeiss smt)上测试。rna和dna分析
[0283]
使用mircury
tm rna分离试剂盒(exiqon)，根据制造商的说明从aomvs或omvs中分离rna。dna分离使用qiamp dna blood mini kit(qiagen)，按厂家说明进行。使用agilent rna 6000纳米芯片和agilent高灵敏度dna芯片，在agilent 2100(agilent technologies)上对1微升分离的rna或dna进行质量、产量和核苷酸长度的毛细管电泳分析。结果
[0284]
aomvs的产量高于自然产生的omvs(图26a)。aomvs的形状和大小与omvs相似，但在透射电镜下更清晰(图26b)。与omvs相比，aomvs中的rna几乎都被去除(图27)。aomvs和omvs中均未检测到dna峰(图28)。例8:铜绿假单胞菌aomvs蛋白的蛋白质组学分析方法lc
‑
ms/ms分析
[0285]
按照制造商的说明，30μg aomvs或aomvs使用过滤辅助样品制备(fasp)方法和c18旋转柱脱盐，用胰蛋白酶消化。所有馏分在speedvac上干燥，在3％乙腈和0.2％甲酸中复溶，并在与easy
‑
nlc 1200(thermo fisher scientific,waltham,ma)连接的orbitrap fusion tribride质谱仪上分析。肽被捕获在acclaim pepmap 100c18捕集柱(100μm x2cm，粒径5μm；thermo fischer scientific)上，并在内部填充的c18分析柱(75μm x30cm，粒径3μm)上分离使用160分钟内从5％到33％b、5分钟内从33％到100％b的梯度，溶剂a 为0.2％甲酸，溶剂b为80％乙腈和0.2％甲酸。前体离子质谱以120 000分辨率记录，选择最强的前体离子，在碰撞能量设置为30时使用hcd进行碎裂，ms/ms谱以30 000分辨率记录，最大进样时间为125ms，1.0da的隔离窗口。选择电荷状态2到7进行碎裂，动态排除设置为45秒，容差为10ppm。结果
[0286]
从omvs和aomvs中分别鉴定出496和227个蛋白(图29)。在两种囊泡制剂中分别鉴定出173个蛋白，在omvs和aomvs中分别鉴定出323和54个蛋白。从蛋白质相对丰度来看，173个蛋白质中有28个蛋白质丰度变化不明显。然而，与自然发生的omvs相比，aomvs中有93和
52个蛋白相对增加和减少。在go亚细胞定位分析中，aomvs富集蛋白组显示出与omvs富集蛋白组截然不同的特征(图30)。aomvs蛋白组以外膜蛋白为主，omvs蛋白组以胞质蛋白和内膜蛋白为主。在go生物学过程分析中，aomvs蛋白组丰富了细胞运动和离子转运等生物学过程(图31)。相比之下，omvs蛋白组具有丰富的翻译和代谢等生物学过程。例9:铜绿假单胞菌aomvs的体外低毒性方法mh
‑
s细胞因子
[0287]
小鼠肺巨噬细胞mh
‑
s(1
×
105)接种于24孔板。用不同剂量的aomvs和omvs诱导细胞产生促炎细胞因子(tnf
‑
α和il
‑
6)15h，用elisa试剂盒(r&d系统)测定细胞因子上清浓度。结果
[0288]
aomvs从巨噬细胞中增加tnf
‑
α和il
‑
6的程度低于omvs(图32)，表明aomvs可能是更安全的候选疫苗。例10:铜绿假单胞菌aomvs体外和体内免疫特性方法抗铜绿假单胞菌裂解物的抗体滴度
[0289]
将5
×
109的omvs或aomvs腹腔注射给小鼠(野生型c57bl/6基因背景，6周龄)，每周注射一次，持续三周。每次注射后3天从小鼠中抽取血液样本，检测其对铜绿假单胞菌裂解物的特异性抗体。小鼠血清用1％bsa/pbs 1:500稀释，置于96孔板上，涂有200ng大肠杆菌裂解物。孵育2小时后，用过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体检测免疫变化。脾细胞细胞因子
[0290]
三次omvs或aomvs(5
×
109)注射7天后，从小鼠脾脏分离cd4 t细胞。用1μg/ml铜绿假单胞菌蛋白孵育细胞(5
×
105)72h,elisa定量分析tnf
‑
α、ifn
‑
γ、il
‑
4和il
‑
17。结果
[0291]
小鼠血液中铜绿假单胞菌裂解物特异性抗体从第一次注射aomvs后7天开始，在第二次和第三次注射后增加，在第三次注射后7天达到峰值(图33)。与假手术组相比，aomvs免疫组脾脏cd4 t细胞分泌的tnf
‑
α、ifn
‑
γ和il
‑
17(th
‑
1和th
‑
17相关)水平更高(图34a
‑
d)。有趣的是，与omvs免疫组相比，aomvs免疫组ifn
‑
γ显著升高。与假手术组相比，aomv和omvs免疫组的il
‑
4水平无明显变化。例11:铜绿假单胞菌aomvs疫苗对铜绿假单胞菌肺炎的疗效方法小鼠实验
[0292]
将5
×
109的omvs或aomvs腹腔注射给小鼠(野生型c57bl/6基因背景，6周龄)，每周注射一次，持续三周。最后一次免疫后一周，经鼻内注射铜绿假单胞菌亚致死剂量(4
×
108c.f.u)1次。麻醉后48h处死小鼠，腹腔注射氯噻嗪(拜耳)和盐酸氯胺酮(辉瑞)。取小鼠支气管肺泡灌洗液(bal)，用duoset elisa development kit(r&d systems)分析上清中的细胞因子。组织学方面，全身灌注后取肺，立即oct复合物(leica)包埋，切片(4μm)，苏木精和伊红染色。结果
[0293]
假手术组感染铜绿假单胞菌48小时后，观察到bal细胞增加，而aomvs免疫小鼠的浸润受到抑制(图35a
‑
b)。特别是aomvs免疫小鼠后，中性粒细胞数量减少。此外，与假手术组相比，aomvs免疫小鼠bal促炎细胞因子(tnf
‑
α和il
‑
6)和中性粒细胞和巨噬细胞的趋化因子水平显著降低(图36a
‑
d)。此外，肺组织学显示aomvs免疫小鼠的支气管和肺泡区域的免疫细胞浸润减少(图37)。综上所述，上述数据表明，铜绿假单胞菌aomvs可作为一种有效的肺炎疫苗。例12:大肠杆菌repdnvs的分离和鉴定方法制备repdnvs
[0294]
repdnvs用如前所述(nano lett.2015jan 14；15(1):266
‑
74)的方法进行纯化。获得一株尿路致病性大肠杆菌用于产生repdnvs。细菌培养物成球，用10mm edta重悬，随后孵化30min。溶菌酶(2mg/ml)添加到小球,4000x g 20min离心，收获原生质体，随后孵化1h。原生质体通过五次聚碳酸酯膜过滤器，过滤器的孔隙大小10μm,5μm,1μm。挤压样品放置在密度梯度垫上，上层垫上50％碘克沙醇(axis
‑
shield poc as)，下层垫上10％碘克沙醇(ultra
‑
离心管底部)。100000x g超离心2小时后，在10％
‑
50％碘二醇之间形成的层，称为pdnvs。将获得的pdnvs在25℃的高ph溶液(200mm na2co3,ph 14.0)中孵育1小时。然后，将孵育后的样品应用于4ml 50％碘克沙醇(axis
‑
shield poc as)，然后分别加入4ml 30％碘克沙醇和2ml 10％碘克沙醇到超离心管中。收集10 0000x g离心2小时后在10％
‑
30％碘二醇之间形成的层。最后，将样品超声30分钟，得到repdnvs(图38)。repdnvs定量
[0295]
采用bradford染色法(bio
‑
rad laboratories)测定repdnvs的蛋白浓度。repdnv粒子浓度由zetaview分析仪(particle metrix gmbh)测定。测量分为三次评估，每个独立的数据从两个固定层获得，每层测量五次。在所有测量中，相机灵敏度配置为70。数据采用zetaview分析软件8.2.30.1进行分析。透射电子显微镜法
[0296]
在加载repdnvs之前，对formvar/carbon cu copper grids(electron microscopy sciences)进行辉光放电处理。然后将repdnvs在蒸馏水中洗涤两次，然后用2.5％戊二醛溶解的pbs进行固定。在过滤水中进一步洗涤两次后，用2％醋酸铀酰对样品进行1.5分钟的染色。阴性染色样品在120kv、veleta ccd相机(olympus
‑
sis)的数字化leo 912ab omega电子显微镜(carl zeiss smt)上测定。sds
‑
page
[0297]
大肠杆菌裂解物、pdnvs和repdnvs用10％sds
‑
page分离，全蛋白条带用考马斯亮蓝g
‑
250染料(thermo fisher scientific)染色。western blot分析，用10％sds
‑
page将分离的凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后用抗ompa抗体(实验室制造)、抗脂质a抗体(abcam)或抗ftsz抗体(antibody
‑
online,inc.)孵育封闭的膜。用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育后，用化学发光底物观察免疫反应条带。rna和dna分析
[0298]
采用mircurytm rna分离试剂盒(exiqon)，按照制造商的方案从repdnvs或pdnvs中分离rna。dna分离使用qiamp dna blood mini kit(qiagen)，按厂家方案进行。使用
agilent rna 6000纳米芯片和agilent高灵敏度dna芯片，在agilent 2100(agilent technologies)上对1微升分离的rna或dna进行质量、产量和核苷酸长度的毛细管电泳分析。结果
[0299]
制备的repdnvs的纯度高于pdnvs(图39a)。在透射电镜下，repdnvs的形状和大小与pdnvs相似，但更清晰(图39b)。去除repdnvs中的大分子蛋白(图40，面板a)。相对于pdnvs,repdnvs中的胞质蛋白如ftsz大部分被去除(图40b)。此外，与pdnvs相比，repdnvs的外膜主要成分ompa和脂质a的含量降低，这表明repdnvs的外膜污染程度低于pdnvs(图40b)。与保留部分rna的pdnvs相比，repdnvs没有检测到rna峰(图41a)。大部分repdnvs dna含量被去除(图41b)。例13:大肠杆菌repdnvs蛋白质组学分析方法lc/ms分析:
[0300]
根据制造商的说明，使用过滤辅助样品制备(fasp)方法和c18离心柱脱盐，用胰蛋白酶消化repdnvs或pdnvs(30μg)。所有馏分在speedvac上干燥并在3％乙腈和0.2％甲酸中复溶，并在与easy
‑
nlc 1200(thermo fisher scientific,waltham,ma)连接的orbitrap fusion tribrid质谱仪上进行分析。肽被捕获在acclaim pepmap 100c18捕集柱(100μm x2cm，粒径5μm；thermo fischer scientific)上，并在内部填充的c18分析柱(75μm x30cm，粒径3μm)上分离使用160分钟内从5％到33％b、5分钟内从33％到100％b的梯度，溶剂a为0.2％甲酸，溶剂b为80％乙腈和0.2％甲酸。前体离子质谱以120 000分辨率记录，选择最强的前体离子，在碰撞能量设置为30时使用hcd进行碎裂，ms/ms谱以30 000分辨率记录，最大进样时间为125ms，1.0da的隔离窗口。选择电荷状态2到7进行碎裂，动态排除设置为45秒，容差为10ppm。结果
[0301]
我们分别鉴定了来自pdnvs和repdnvs的202和108个蛋白(图42)。在两种囊泡制剂中分别鉴定出94个蛋白，而在pdnvs和repdnvs中分别鉴定出108和14个蛋白。从蛋白质相对丰度来看，94种蛋白质中有38种蛋白质丰度变化不明显。而在repdnvs中，40和16个蛋白分别相对增加和减少。在go亚细胞定位分析中，repdnvs富集的蛋白质组与pdnvs富集的蛋白质组具有明显的特征(图43)。repdnvs蛋白组以细胞内膜蛋白为主，pdnvs蛋白组以胞质蛋白为主。例14:大肠杆菌repdnvs体外低毒性方法raw264.7细胞因子
[0302]
raw 264.7(1
×
105)小鼠巨噬细胞接种于24孔板。将1
×
108个repdnvs、pdnvs或omvs应用于细胞，诱导促炎细胞因子(tnf
‑
α和il
‑
6)15小时。用elisa试剂盒(r&d系统)测定细胞因子上清浓度。结果
[0303]
与omvs相比，repdnvs不能从巨噬细胞诱导tnf
‑
α和il
‑
6(图44)。此外，repdnv组的il
‑
6水平低于pdnvs组。
例15:大肠杆菌repdnvs的体外和体内免疫特性方法树突细胞细胞因子:
[0304]
骨髓细胞取自小鼠的股骨和胫骨(c57bl/6)。添加20ng/ml gm
‑
csf的10％胎牛血清/rpmi培养1周后细胞分化为树突状细胞。分化的树突状细胞(1
×
105)接种于24孔板。将两种剂量的repdnvs或pdnvs(1
×
109,2
×
109)施加于细胞，诱导tnf
‑
α、il
‑
6、il
‑
12p70和il
‑
4 24h。用elisa试剂盒(r&d系统)测定细胞因子上清浓度。针对大肠杆菌裂解物的抗体效价:
[0305]
将5
×
109的repdnvs或pdnvs腹腔注射给小鼠(野生型c57bl/6遗传背景，6周龄)，每周1次，持续3周。每次注射后3天，小鼠的血液样本被采集，并检测其大肠杆菌裂解物的特异性抗体。小鼠血清用1％bsa/pbs 1:500稀释，置于96孔板上，涂有200ng大肠杆菌裂解物。孵育2小时后，用过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体检测免疫变化。结果
[0306]
tnf
‑
α、il
‑
6和il
‑
12p70是诱导辅助t细胞1型应答的细胞因子，随着repdnvs剂量的增加而增加，与pdnvs类似(图45a
‑
d)。然而，诱导辅助t细胞2型应答的细胞因子il
‑
4的水平没有变化。小鼠血液中大肠杆菌裂解物特异性抗体从第一次注射repdnvs后7天开始，在第二次和第三次注射时增加，在第三次注射后7天达到峰值(图46)。例16:小鼠黑色素瘤组织来源ev的分离和鉴定方法肿瘤ev的制备
[0307]
将人或小鼠肿瘤切片成小片段(1
‑
2mm)，与胶原酶d(roche)(2mg/ml)和脱氧核糖核酸酶i(roche)(40u/ml)在37℃下孵育30分钟，以溶解纤维化结构。过滤后(70μm孔隙大小),丢弃细胞和组织碎片，3 00x g 10min和2000x g 20min离心。上层清液于16500x g 20min和118000x g 2.5h收集大的囊泡和小的囊泡(ti45转子:固定角转子)。所有离心均在4℃下进行。大和小的囊泡在pbs中重悬，结合并使用碘二醇梯度等密度离心进一步纯化(axis
‑
shield poc as)。pbs(1ml)中的ev(较大和较小的电动汽车)与60％碘伏醇(3ml)混合，置于超离心管底部，然后分别加入30％碘伏醇(4ml)和10％碘伏醇(3ml)。样品在178,000x g(sw41ti,beckman coulter)条件下超离心2小时。从30％和10％碘二醇层之间的界面收集ev。收集的ev随后用pbs(最多94ml)稀释，并以118,000x g(type 45ti)超离心3.5小时。颗粒ev在pbs中重悬以备将来使用(图47)。颗粒状ev主要由小泡组成。这些电动汽车在这里也被称为“texo”。透射电子显微镜法
[0308]
处死小鼠后获得一只小鼠黑色素瘤组织，并将样品切成小块。将样品置于150μm深的膜载体(leica microsystems)中，该载体填充有20％bsa的pbs，并使用empacti(leica microsystems)进行高压冷冻。然后使用在脱水丙酮中使用2％醋酸铀酰1小时的快速冷冻替代方案。温度以3℃/小时的速度下降至
‑
50℃。样品用脱水丙酮洗涤，然后开始用hm20浓度增加渗透，然后用hm20渗透3次(每次2小时，过夜一次)。样品在紫外光下聚合48小时。切割薄片(70nm)并与25％乙醇中的2％乙酸双氧铀(4分钟)和雷诺氏柠檬酸铅(2分钟)进行对比。为了分析evs，在装载evs之前，对formvar/碳铜铜网格(电子显微镜科学)进行辉光放电
处理。然后将ev在蒸馏水中洗涤两次，然后使用2.5％戊二醛溶解的pbs固定。在蒸馏水中进一步洗涤两次后，使用2％乙酸双氧铀对样品染色1.5分钟。在数字化leo 912ab omega电子显微镜(carl zeiss smt)上使用veleta ccd相机(olympus
‑
sis)在120kv下检查负染色样品。结果
[0309]
电子显微镜证实小鼠黑色素瘤组织间质中存在ev(图48)。大泡(直径100
‑
200nm)和小泡(直径40
‑
100nm)均存在(图49)。例17:小鼠黑色素瘤组织来源ev对黑色素瘤生长的抑制活性方法小鼠实验
[0310]
小鼠(野生型c57bl/6基因背景，6周龄)皮下注射5
×
105黑素瘤细胞(b16f10)，并维持1周形成可测量的肿瘤肿块(2
‑
3毫米)。然后，每隔一周定期腹腔注射3次黑色素瘤ev(10μg)，联合大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)。每周两次测量肿瘤大小。肿瘤体积按公式v＝l
×
s2/2[v，体积；l:癌块最长轴的长度；s，最短轴的长度]。结果
[0311]
肿瘤ev与aomvs或repdnvs的联合导致肿瘤体积显著减少(35％)(图50)。例18:aomvs或repdnvs增加小鼠黑色素瘤组织来源ev的免疫原性方法抗肿瘤裂解物或evs蛋白的抗体滴度
[0312]
每隔一周定期将10μg黑色素瘤ev与大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)联合腹腔注射三次。每次注射后3天从小鼠身上取血样，检测其针对b16f10裂解物或ev蛋白的特异性抗体。小鼠血清用1％bsa/pbs 1:500稀释，置于96孔板中，板上涂有200ng b16f10裂解物或ev蛋白。孵育2小时后，用过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体检测免疫变化。脾细胞细胞因子
[0313]
三次注射黑色素瘤ev(10μg)联合大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)后7天，从小鼠脾脏分离cd4 t细胞。用1μg/ml黑色素瘤ev蛋白孵育细胞(5
×
105)72h,elisa定量分析tnf
‑
α、ifn
‑
γ、il
‑
4和il
‑
17。结果
[0314]
在ev免疫小鼠与aomvs或repdnvs一起被诱发，小鼠血液中b16f10裂解物或ev特异性抗体的增加(图51a
‑
b)。与假手术组相比，单纯ev免疫组与aomvs联合，脾脏cd4 t细胞分泌更高水平的ifn
‑
γ(图52a
‑
d)。例19:小鼠结肠癌组织来源的evs对结肠癌生长活性的抑制方法小鼠实验
[0315]
小鼠(野生型c57bl/6基因背景，6周龄)皮下注射5
×
106个结肠癌细胞(ct26)，并维持1周形成可测量的肿瘤肿块(2
‑
3毫米)。然后，每隔一周，将结肠癌ev(10μg)与大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)联合腹腔注射3次。每周两次测量肿瘤大小。肿瘤体积按公式v＝l
×
s2/2[v，体积；l:癌块最长轴的长度；s，最短轴的长度]。结果
[0316]
从小鼠结肠癌组织中分离出ev，如图53所示。电镜下证实小鼠结肠癌组织间质中
存在ev(图53)。肿瘤与ev与aomvs或repdnvs的联合导致肿瘤体积显著减少(分别为51％或60％)(图54a
‑
b)和肿瘤肿块重量(图54c)。例20:aomvs或repdnvs增加小鼠结肠癌组织来源evs的免疫原性方法抗肿瘤裂解物或ev蛋白的抗体滴度
[0317]
每隔一周定期将结肠癌组织来源的ev(10μg)与大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)联合腹腔注射三次。每次注射后3天从小鼠身上取血样，检测其针对ct26裂解物或ev蛋白的特异性抗体。小鼠血清用1％bsa/pbs 1:500稀释，置于96孔板中，板上涂有200ng ct26裂解物或ev蛋白。孵育2小时后，用过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体检测免疫变化。脾细胞细胞因子
[0318]
结肠癌ev(10μg)联合大肠杆菌aomvs或repdnvs(5
×
109)三次注射7天后，从小鼠脾脏分离cd4 t细胞。用1μg/ml结肠癌ev蛋白孵育细胞(5
×
105)72h,elisa定量分析tnf
‑
α、ifn
‑
γ、il
‑
4和il
‑
17。结果
[0319]
小鼠血液中ct26裂解物或ev特异性抗体的增加,在ev免疫小鼠与aomvs或repdnvs一起被诱发(图55a
‑
b)。与假手术组相比，ev免疫组与aomvs或repdnvs联合，脾脏cd4 t细胞能够分泌更高水平的ifn
‑
γ(图56a
‑
d)。例21:用人类黑色素瘤患者来源的ev和大肠杆菌aomvs进行免疫方法肿瘤ev的制备
[0320]
使用如图47所示的相同方法分离人类黑色素瘤患者来源的ev。抗肿瘤evs蛋白的抗体滴度
[0321]
小鼠(野生型c57bl/6基因背景，6周龄)每周单独腹腔注射10μg肿瘤ev或联合大肠杆菌aomvs(5
×
109)连续三周。每次注射后3天从小鼠身上取血样，检测其肿瘤ev蛋白特异性抗体。小鼠血清在1％bsa/pbs中1:500稀释，置于96孔板上包覆200ng肿瘤ev蛋白。孵育2小时后，用过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体检测免疫变化。脾细胞细胞因子
[0322]
单独注射肿瘤ev(10μg)或与大肠杆菌aomvs(5
×
109)联合注射3次后7天。从小鼠脾脏分离cd4 t细胞。用1μg/ml的肿瘤ev孵育细胞(5
×
105)72h,elisa定量分析tnf
‑
α、ifn
‑
γ和il
‑
4。结果
[0323]
单独使用肿瘤evs或与大肠杆菌aomvs联合免疫时，体重、体温和全身炎症均无变化(图57和58a
‑
d)。小鼠血液中肿瘤ev特异性抗体从aomvs第一次注射肿瘤ev后7天开始，在第二次和第三次注射时增加，在第三次注射后7天达到峰值(图59)。此外，与假ev或仅肿瘤ev免疫组相比，ev aomvs免疫组脾脏cd4 t细胞分泌的tnf
‑
α、ifn
‑
γ和il
‑
17水平更高(图60a
‑
d)。但各组间il
‑
4水平无变化。例22:挤压法从小鼠肿瘤组织中分离出囊泡状肿瘤源性纳米囊泡(retnvs)方法肿瘤ev的制备
[0324]
从小鼠身上获得黑色素瘤或结肠癌组织，然后使用结合胶原酶和dnase的商业试剂盒分离成单细胞悬浮液(miltenyl biotec inc.)。对于肿瘤细胞的分离，将总单细胞悬液装入macs柱(miltenyl biotec inc.)，然后用微珠包覆抗非肿瘤细胞的单克隆抗体鸡尾酒(miltenyl biotec inc.)孵育。收集的肿瘤细胞分别通过孔径为10μm、5μm和1μm的聚碳酸酯膜过滤器(whatman)，使用小型挤压机(avanti polar lipids)进行5次过滤。挤压样品放置在密度梯度垫上，上层垫上50％碘克沙醇(axis
‑
shield poc as)，下层垫上10％碘克沙醇(ultra
‑
离心管底部)。收集10％
‑
50％碘克沙醇在10 0000xg离心2小时后形成的层，称为肿瘤源性纳米囊泡(nvs或tnvs)。获得的nvs在25℃的高ph溶液(200mm na2co3,ph 14.0)中孵育1小时。然后，将孵育后的样品应用于4ml 50％碘克沙醇(axis
‑
shield poc as)，然后分别加入4ml 30％碘克沙醇和2ml 10％碘克沙醇到超离心管中。收集100000x g离心2小时后在10％
‑
30％碘二醇之间形成的层。最后，将样品超声30min，得到retnvs(图61)。结果
[0325]
黑色素瘤和结肠癌细胞来源的retnvs比组织来源的ev的产量更高，分别为5.8倍和8.7倍(图62和63)。例23:ev、aomv及二者联合治疗对肿瘤负荷和生存的影响
[0326]
小鼠每周皮下注射3次黑色素瘤ev(5μg)、大肠杆菌aomvs(5
×
109)，或在第4周皮下注射5
×
105黑色素瘤细胞。然后皮下注射黑色素瘤ev(5μg)、大肠杆菌aomvs(5
×
109)或两者联合，每隔一周定期注射2次。测量肿瘤大小并计算肿瘤体积，如例18所述。
[0327]
黑色素瘤ev联合aomvs可导致肿瘤生长放缓，而ev或aomvs单独则未显示任何肿瘤衰退。见图64。当肿瘤体积超过1000mm3时，携带肿瘤的小鼠被安乐死。黑色素瘤ev和aomv联合免疫小鼠比其他组(pbs、ev单独和aomv单独免疫)有更高的存活率。参见图64b。例24:大肠杆菌aomvs激活骨髓源性树突状细胞(bmdcs)方法
[0328]
aomvs的制备:大肠杆菌培养物成球，用20mm tris重悬在20％蔗糖中，ph 8.0(每g细胞4ml)，加入溶菌酶(600μg每g细胞)，0.1m edta(0.2ml每g细胞)。将得到的球质体成球，然后在10mm的冰冷tris中超声，ph 8.0。8000
×
g细胞成球5min，然后从40000
×
g上清液中取全膜成球60min。将膜重悬在蒸馏水中，冷冻解冻，并在0.5％的sarkozy(n
‑
月桂酰肉瘤苷钠；20分钟，25c)。外膜成球(40000x g for 90min)，在25c的高ph溶液(200mm na2co3,ph 11)中孵育1小时。将微丸应用于4ml 50％碘克沙醇(axis
‑
shield poc as)中，然后加入4ml 30％碘克沙醇和2ml 10％碘克沙醇到超离心管中。收集10万x g离心2小时后在10％
‑
30％碘二醇之间形成的层。最后，将样品超声30min制备aomvs。
[0329]
texo的制备:将人或小鼠肿瘤切片成小片段(1
‑
2mm)，与胶原酶d(roche)(2mg/ml)和dnase i(roche)(40u/ml)在37℃下孵育30分钟，以溶解纤维化结构。过滤后(70μm孔隙大小),细胞和组织碎片在300x g离心10分钟和2000x g 20分钟。上层清液16500x g离心20分钟和118000g离心2.5h收集大的囊泡和小的囊泡(ti45转子:固定角转子)。所有离心均在4℃下进行。小的囊泡在pbs中重悬，这些在这里称为texo。
[0330]
大肠杆菌aomvs的bmdc摄取:骨髓细胞取自小鼠的股骨和胫骨(c57bl/6)。添加20ng/ml gm
‑
csf10％胎牛血清/rpmi培养1周后细胞分化为树突状细胞。分别用dio标记分离的aomvs(1
×
109)，然后用bmdcs处理12h，用共聚焦显微镜检查摄取情况。
[0331]
流式细胞术分析bmdc成熟标记:分析表面活化标记,bmdcs治疗大肠杆菌aomvs(5x109)24小时被封锁的非特异性染色2.4g2(anti
‑
fc
‑
receptor)30分钟在pbs/0.1％bsa 4℃,清洗和彩色30分钟,在4℃pbs/后0.1％bsa抗体；大鼠抗小鼠mhcii
‑
af700(m5/114.15.2)，bd生物科学大鼠抗小鼠cd44
‑
bv786(im7)，大鼠抗小鼠cd83
‑
pe(michel19)和大鼠抗小鼠cd40
‑
pecf594(3/23)，biolegend大鼠抗小鼠cd86
‑
bv605(gl
‑
1)和仓鼠抗小鼠cd80
‑
af647(16
‑
10a1)为了排除死亡细胞，7
‑
氨基放线菌素d(sigma aldrich)染色阳性细胞被排除在分析中。使用fortessa
‑
x20流式细胞仪(bd biosciences)和flowjo软件(tree star)收集和分析事件。结果
[0332]
dio标记的aomvs被bmdcs摄取(图65)。流式细胞术分析显示，与aomvs孵育后，树突状细胞成熟/激活标记物水平升高(图66)。例25:小鼠黑色素瘤来源的外泌体(texo)和大肠杆菌aomvs的抗肿瘤作用，并阐明其潜在机制方法
[0333]
小鼠实验:小鼠(野生型c57bl/6基因背景，6周龄)皮下注射黑色素瘤细胞(b16f10；5
×
105)，维持3天，形成可测量的肿块(2
‑
3毫米)。然后将texo(5
×
109)与大肠杆菌aomvs(5
×
109)联合皮下注射小鼠，每隔3天注射5次。对于抗pd
‑
1免疫治疗，抗小鼠pd
‑
1抗体(100μg；在texo和大肠杆菌aomvs免疫前1天腹腔注射。每隔1
‑
2天测量肿瘤大小。肿瘤体积按公式v＝l
×
s2/2[v，体积；l:肿瘤最长轴的长度；s，最短轴的长度]。转移实验:静脉注射b16f10(1
×
105)，皮下注射texo(5
×
109)和/或大肠杆菌aomvs(5
×
109)，每隔3天免疫5次。第17天，处死小鼠并计数肺内转移的克隆数量。
[0334]
组织组织学分析:将肿瘤、肺、肝、心、肾切除，在4％甲醛中室温固定过夜。石蜡包埋，切片(4μm)，苏木精和伊红染色。
[0335]
小鼠免疫细胞的流式细胞术分析:用texo(5
×
109)和/或大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠，每隔3天免疫5次。第17天，切除肿瘤和腹股沟淋巴结，进行单细胞悬液。使用muse细胞计数器(millipore)计算细胞的绝对数量，并使用以下抗体在4℃pbs/0.1％bsa中染色检测表面表达:从ebioscience获得的大鼠抗小鼠f4/80
‑
ef660(bm8)和大鼠抗小鼠mhcii
‑
af700(m5/114.15.2)；仓鼠抗小鼠cd11c
‑
pecy7(hl3)，大鼠抗小鼠cd11b
‑
bv510(m1/70)，大鼠抗小鼠ly6g
‑
bv650(1a8)，大鼠抗小鼠cd19
‑
pecf594(1d3)，仓鼠抗小鼠cd3e
‑
buv737(500a2)，大鼠抗小鼠nkg2a/c/e
‑
bv421(20d5)，大鼠抗小鼠cd45
‑
apc
‑
cy7(30
‑
f11)和大鼠抗小鼠cd8a
‑
fitc(53
‑
6.7)；大鼠抗小鼠cd4
‑
bv785(rm4
‑
5)和大鼠抗小鼠ly6c
‑
bv605(hk1.4)。为了排除死亡细胞，使用7
‑
氨基放线菌素d(sigma aldrich)进行分析。使用fortessa
‑
x20流式细胞仪(bd biosciences)和flowjo软件(tree star)收集和分析事件。
[0336]
脾细胞因子:用texo(5
×
109)和/或大肠杆菌aomvs(5
×
109)免疫小鼠，每隔3天免疫5次。第17天，根据厂商说明书使用cd8 t细胞分离试剂盒(miltenyi biotec)从小鼠脾脏中纯化cd8 t细胞。用1μg/ml texo孵育细胞(5
×
105)72h,elisa定量分析ifn
‑
γ。
[0337]
细胞毒性t淋巴细胞(ctl)杀伤试验:用5
×
109的texo和/或5
×
109的大肠杆菌aomvs免疫小鼠的脾脏产生反应性ctl，每隔3天免疫5次。第17天，根据生产商说明，使用pan t细胞分离试剂盒ii(miltenyi biotec)从免疫小鼠中分离脾脏淋巴细胞。为了获得效应
ctl，将纯化的脾脏t细胞(2
×
106)与texo(5μg/ml)在il
‑
2(20u/ml)存在下培养。6天后，收集t细胞作为效应细胞。将b16f10(1
×
104)作为靶细胞，与不同比例(12.5、25、50)的效应细胞在37℃下混合24h。计算效应细胞的杀伤率为[1
‑
(效应细胞和靶细胞od
‑
效应细胞od)/靶细胞od]
×
100％。结果
[0338]
texo与大肠杆菌aomvs联合导致肿瘤体积显著减少(65％)(图67a
‑
b)，可见肿瘤坏死(数据未显示)。在我们的免疫方法下，心脏、肝脏、肺和肾脏未观察到全身毒性(数据未显示)。此外，我们还研究了texo和aomvs对转移性黑色素瘤生长的治疗作用。结果，texo aomvs免疫小鼠的肺转移菌落数量显著减少(图68)。此外，与αpd
‑
1单药治疗或texo aomv免疫治疗相比，texo aomv和αpd
‑
1igg联合治疗显著降低了肿瘤生长(图69)。接下来，我们进行了免疫研究，以检查肿瘤组织中肿瘤浸润淋巴细胞(til)的存在。流式细胞术分析显示，texo和aomvs免疫小鼠的cd45 细胞水平显著升高(图70a
‑
b)，特别是texo和aomvs治疗的肿瘤组织中，主要观察到树突状细胞、cd4 t细胞、cd8 t细胞和nk细胞(图70c)。此外，在texo/aomvs免疫小鼠中，引流淋巴结中各种适应性免疫细胞显著增加(图71)。为了进一步评价cd8 t细胞在texo和aomvs介导的免疫治疗效果中的作用，从免疫小鼠中分离脾脏cd8 t细胞进行免疫检测。与假手术组相比，联合aomvs的texo免疫组脾脏cd8 t细胞分泌更高水平的ifn
‑
γ(图72a)。此外，texo和aomvs免疫的脾细胞可以刺激texo特异性ctl，这些ctl对b16f10细胞的裂解活性高于假手术组、texo或aomvs免疫的小鼠(图72b)。例26:用大肠杆菌aomvs进行瘤内免疫方法
[0339]
小鼠实验:黑色素瘤细胞(b16f10；5
×
105)皮下植入小鼠(野生型c57bl/6遗传背景，6周龄)的两侧。第3天，在小鼠右侧肿瘤内接种两剂(109或10
10
)大肠杆菌aomvs，每隔3天接种一次，共接种7次。抗小鼠pd
‑
1抗体(100μg；在大肠杆菌aomvs免疫前1天腹腔注射。每隔2～3天测量双侧肿瘤的大小。肿瘤体积按公式v＝l
×
s2/2[v，体积；l:肿瘤最长轴的长度；s，最短轴的长度]。结果
[0340]
肿瘤内免疫低剂量aomvs(109)可使肿瘤明显缩小，而高剂量aomvs(10
10
)则无法检测到肿瘤体积(图73)。此外，aomv免疫对植入另一侧的肿瘤的消退也有影响，揭示了aomv瘤内注射的全身抗肿瘤作用。例27:大肠杆菌aomvs与其他类型佐剂的佐剂活性比较方法
[0341]
抗肿瘤水疱蛋白抗体滴度:小鼠(野生型c57bl/6遗传背景，6周龄)腹腔注射人黑色素瘤texo(5
×
109)，每周一次，连续三周，添加或不添加各种佐剂。白矾(100μg)，不完全弗氏佐剂(ifa；50μl)、10μg cpg dna和大肠杆菌aomvs(5
×
109)作为佐剂。每次注射后3天，小鼠的血液样本被采集，并检测其黑色素瘤囊泡蛋白的特异性抗体。小鼠血清在1％bsa/pbs中1:500稀释，置于96孔板上涂200ng人黑色素瘤texo。孵育2小时后，用过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体检测免疫变化。结果
[0342]
为了比较aomvs与其他传统佐剂(如明矾、ifa或cpg dna)的免疫佐剂活性，研究人
员在用人类黑色素瘤texo和每种佐剂免疫的小鼠血清中评估了肿瘤囊泡特异性抗体。与传统佐剂如明矾、ifa或cpg dna相比，联合texo和aomvs获得了对肿瘤囊泡最强的抗体应答(图74)。因此，与传统佐剂如明矾、ifa或cpg dna相比，aomvs是明显更好的佐剂。例28:优化大肠杆菌aomvs在肿瘤免疫治疗中的安全性和有效性方法
[0343]
不同ph条件下制备aomvs:用例24中描述的相同方法从大肠杆菌培养物中分离出外膜。在25℃下，用各种高ph溶液(200mm na2co3,ph 9,10,11和12)孵育膜1小时。将微丸应用于4ml 50％碘克沙醇(axis
‑
shield poc as)中，然后加入4ml 30％碘克沙醇和2ml 10％碘克沙醇到超离心管中。收集10万x g离心2小时后在10％
‑
30％碘二醇之间形成的层。最后，将样品超声30min制备aomvs。
[0344]
透射电子显微镜(tem):在加载aomvs之前，对碳/碳铜网格(electron microscopy sciences)进行辉光放电处理。aomvs在蒸馏水中洗涤两次，然后用2.5％戊二醛溶解的pbs固定。在过滤水中进一步洗涤两次后，用2％醋酸铀酰对样品进行1.5分钟的染色。阴性染色样品在120kv、veleta ccd相机(olympus
‑
sis)的数字化leo 912ab omega电子显微镜(carl zeiss smt)上检查。
[0345]
dna分析:采用mircurytm rna分离试剂盒(exiqon)，按照制造商的方案从aomvs或omvs中分离rna。dna分离使用qiamp dna blood mini kit(qiagen)，按厂家方案进行。在agilent 2100bioanalyzer(agilent technologies)上，分别使用agilent rna 6000纳米芯片和agilent高灵敏度dna芯片，对1微升分离的rna或dna进行质量、产量和核苷酸长度的毛细管电泳分析。
[0346]
raw 264.7细胞因子:raw 264.7(1
×
105)小鼠巨噬细胞系，接种于24孔板。将不同ph条件下分离的omvs和aomvs应用于细胞诱导促炎细胞因子(tnf
‑
α和il
‑
6)15h，用elisa试剂盒(r&d系统)检测细胞因子上清浓度。
[0347]
抗肿瘤水疱蛋白抗体滴度:小鼠(野生型c57bl/6基因背景，6周龄)在不同ph条件下每周腹腔注射人黑色素瘤texo(5
×
109)和大肠杆菌aomvs(5
×
109)，连续3周。每次注射后3天，小鼠的血液样本被采集，并检测其黑色素瘤囊泡蛋白的特异性抗体。小鼠血清在1％bsa/pbs中1:500稀释，置于96孔板上涂200ng人黑色素瘤texo。孵育2小时后，用过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体检测免疫变化。为了研究texo与aomvs的最佳混合比例，将aomvs(5
×
109)与不同比例(0.01、0.1、1、10、100)的texo混合免疫。每周1只小鼠腹腔注射不同比例的texo和aomvs，连续3周，每次注射后3天取小鼠血样。采用上述方法检测人黑色素瘤texo特异性抗体滴度。结果
[0348]
为了开发更安全、更有效的aomvs，我们首先研究了不同ph条件对aomvs分离和表征的影响。分别在ph 9、ph 10、ph 11或ph 12条件下生成大肠杆菌aomvs，然后通过tem显示在所有条件下没有污染物的纳米球形结构(图75a)。特别是ph 11和ph 12的产率和纯度最高(图75b)，所有ph条件下都没有dna污染物(图75c)。对raw 264.7细胞的安全性研究表明，ph 11和ph 12是毒性较小的最佳条件(图76)，特别是ph 11对肿瘤囊泡具有更有效的免疫原性(图77)。在确定texo和aomvs的最佳混合比例时，1:1免疫诱导的抗肿瘤囊泡抗体水平最高(图78)。
例29:其他菌株aomvs的抗肿瘤作用方法
[0349]
小鼠实验:从铜绿假单胞菌、大肠杆菌bw25113和大肠杆菌δmsbb突变体中分离得到aomvs，分离方法见例24。小鼠(野生型c57bl/6基因背景，6周龄)皮下注射黑色素瘤细胞(b16f10；5
×
105)，维持3天，形成可测量的肿块(2
‑
3毫米)。texo(5
×
109)联合各种aomvs(5
×
109)皮下注射小鼠，每隔3天注射5次。对于抗pd
‑
1免疫治疗，抗小鼠pd
‑
1抗体(100μg；在texo和aomvs免疫前1天腹腔注射bioxcell)。每隔1
‑
2天测量肿瘤大小。肿瘤体积按公式v＝l
×
s2/2[v，体积；l:肿瘤最长轴的长度；s，最短轴的长度]。
[0350]
抗肿瘤水疱蛋白抗体滴度:小鼠(野生型c57bl/6基因背景，6周龄)腹腔注射人黑色素瘤texo(5
×
109)联合或不联合在不同ph条件下分离的两种aomvs(大肠杆菌bw25113和大肠杆菌δmsbb突变体；5
×
109)，每周1次，连续3周。每次注射后3天，小鼠的血液样本被采集，并检测其黑色素瘤囊泡蛋白的特异性抗体。小鼠血清在1％bsa/pbs中1:500稀释，置于96孔板上涂200ng人黑色素瘤texo。孵育2小时后，用过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体检测免疫变化。结果
[0351]
我们想知道由不同菌株产生的aomvs是否对黑色素瘤有免疫治疗作用。aomvs从铜绿假单胞菌中分离出来，与大肠杆菌aomvs相似，它们诱导肿瘤显著转归(图79)。此外，与pd
‑
1igg治疗的联合作用也显著降低了肿瘤的生长。接下来我们研究了脂多糖在aomvs抗肿瘤作用中的相关作用。我们使用了来自基因突变的大肠杆菌的aomvs，其编码脂质a酰基转移酶(msbb)的基因参与了脂质组分的合成。大肠杆菌bw25113野生型和δmsbb突变菌来源的aomv均导致肿瘤体积显著减少(图80)，提示lps不是aomvs介导的免疫治疗机制的关键因素。此外，在δmsbb突变型细菌aomvs免疫小鼠中，与野生型细菌aomvs相比，小鼠血液中肿瘤泡特异性抗体的增加(图81)。在副作用方面，大肠杆菌bw25113野生型和δmsbb突变菌衍生的aomvs诱导raw 264.7的促炎细胞因子的量低于天然omvs(图82)。例30:从小鼠黑色素瘤中分离聚乙二醇(peg)沉淀的肿瘤囊泡(tpeg) 方法
[0352]
tpeg的制备:小鼠黑色素瘤组织轻轻地切成小片段(1
‑
2mm)，与胶原酶d(roche)(2mg/ml)和dnase i(roche)(40u/ml)在37℃下孵育30分钟，以溶解纤维化结构。过滤后(70μm孔隙大小),丢弃细胞和组织碎片，3 00x g 10min和2000x g 20min离心。得到的上层清液和50％peg混合使最终peg浓度为10％。4℃孵育2h后，3000x g离心10min。再次在囊泡微球中加入50％peg,4℃孵育2h,3000x g离心10min，弃上清，所得微球视为tpeg。
[0353]
tnv的制备:从小鼠获得黑色素瘤组织，然后使用胶原酶和dnase组合的商业试剂盒(miltenyl biotec)解离成单细胞悬液。为了分离肿瘤细胞，将总单细胞悬液装入macs柱(miltenyl biotec)，然后用微珠包覆抗非肿瘤细胞的单克隆抗体鸡尾酒(miltenyl biotec inc)孵育。收集的肿瘤细胞分别通过孔径为10μm、5μm和1μm的聚碳酸酯膜过滤器(whatman)，使用小型挤压机(avanti polar lipids)进行5次过滤。挤压样品放置在密度梯度垫上，垫上50％碘克沙醇(axis
‑
shield poc as)，垫上10％碘克沙醇(ultra
‑
离心管底部)。收集10％
‑
50％碘二醇在100,000x g离心2小时后形成的层，称为肿瘤源性纳米囊泡(tnv)。
[0354]
小鼠实验:小鼠(野生型c57bl/6基因背景，6周龄)皮下注射黑色素瘤细胞(b16f10；5
×
105)，维持3天，形成可测量的肿块(2
‑
3毫米)。然后皮下注射aomvs(5
×
109)，联合各种肿瘤泡(texo、tnv、tpeg；5
×
109)，每隔3天注射5次。对于抗pd
‑
1免疫治疗，抗小鼠pd
‑
1抗体(bioxcell，100μg)免疫前1天腹腔注射。每隔1
‑
2天测量肿瘤大小。肿瘤体积按公式v＝l
×
s2/2[v，体积；l:肿瘤最长轴的长度；s，最短轴的长度]。结果
[0355]
电镜证实tpeg中存在囊泡(图83)，tpeg的产量和纯度均高于其他类型的肿瘤囊泡(图84)。此外，tpeg与aomvs联合诱导显著的抗肿瘤反应，其效果略好于texo或tnvs(图85)。例31:sting激动剂负载aomvs的免疫治疗效果方法
[0356]
将sting激动剂加入大肠杆菌aomvs中:用例24中描述的相同方法从大肠杆菌培养中分离出外膜。高ph溶液(200mm na2co3)处理的外膜与作为sting激动剂的dmxaa(tocris bioscience)混合，25℃轻度超声1小时。然后将混合物应用于4ml的50％碘克沙醇(axis
‑
shield poc as)，然后加入4ml的30％碘克沙醇和2ml的10％碘克沙醇到超离心管中。为了去除游离的sting激动剂，以100,000x g离心2小时，然后收集30％
‑
50％碘二醇形成的层。将囊泡称为aomvs sting(30
‑
50％)，在
‑
80℃下保存直至使用(图86a和86b)。此外，在10
‑
30％碘克沙醇梯度层分离sting激动剂负载的aomvs(aomvs sting(10
‑
30％)；图86b)。
[0357]
sting激动剂在aomvs中的定量:将等体积的乙腈加入aomvs sting中，超声，13000rpm离心10分钟。收集上清液，注射到高效液相色谱系统(ultimate 3000高效液相色谱；thermofisher scientific)，c18色谱柱(100x 2.1mm,2.6μm；phenomenex)。对于sting激动剂检测，在254nm处测定吸光度。
[0358]
bmdc细胞因子:分化的bmdc(4
×
106)接种于6孔板。用游离sting激动剂(20μg)、aomvs、aomvssting(10
‑
30％；5
×
109)，或不同浓度的aomvs sting(30
‑
50％；5
×
108,1
×
109,2
×
109,5
×
109)孵育24h诱导inf
‑
β。用elisa试剂盒(r&d系统)检测细胞因子上清浓度。
[0359]
小鼠实验:小鼠(野生型c57bl/6基因背景，6周龄)皮下注射黑色素瘤细胞(b16f10；5
×
105)，维持3天，形成可测量的肿块(2
‑
3毫米)。然后皮下注射texo(5x109)联合aomvs(5x109)或aomvssting(30
‑
50％；5
×
109)，每隔3天注射5次。每隔2天测量肿瘤大小。肿瘤体积按公式v＝l
×
s2/2[v，体积；l:肿瘤最长轴的长度；s，最短轴的长度]。结果
[0360]
我们首先分别在10
‑
30％和30
‑
50％碘二醇梯度层上分离aomvssting(10
‑
30％)和aomvssting(30
‑
50％)，如图86a和86b所示。aomvssting(10
‑
30％)处理小鼠bmdc时诱导少量ifn
‑
β，而aomvs sting(30
‑
50％)显示出比aomvs单独处理时更高的ifn
‑
β分泌活性(13倍；图87)。基于5
×
109aomvssting(30
‑
50％)含有20μg sting激动剂，我们比较了aomvssting(30
‑
50％)与游离sting激动剂的免疫活性。因此，aomvssting(30
‑
50％)比游离sting激动剂更有效地诱导ifn
‑
β的产生(6倍；图87)。此外，aomvssting(30
‑
50％)以剂量依赖的方式诱导ifn
‑
β的释放(图87b)。在体内抗肿瘤生长实验中，与aomvs免疫相比，aomvssting(30
‑
50％)显著降低了黑色素瘤的生长(图88)。
[0361]
虽然本发明已参考其具体实施例进行了描述，但该领域的技术人员应该理解，在不偏离本发明的真正精神和范围的情况下，可以做出各种变化和替换等价物。此外，还可以
作出许多修改，以适应特定的情况、材料、物质的组成、过程、过程步骤或步骤，以适应本发明的目标、精神和范围。所有这些修改在本合同所附索赔范围内。