一种植物提取物及其制备方法和作为植物生长调节剂中的应用与流程

1.本技术涉及植物生长调节剂领域，尤其是涉及一种植物提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.植物组织培养中iba经常被用于根系诱导，有时也会与iaa或naa联合使用以诱导生根。此外，乙酰水杨酸也曾被应用到植物组织培养生根诱导中，例如夏海武利用乙酰水杨酸和阿司匹林提高了甘蓝试管苗的生根率。h2o2对多种植物都有打破休眠的效果。在这些植物生长调节剂中，除了赤霉素是直接提取自生物体以外，绝大多数都是化学合成的，而且大多数还具有一定毒性(王小兰，2005.植物生长调节剂在作物生产中的安全性使用.甘肃广播电视大学学报，15(3)：1-4.)。由于植物体内不存在分解这类人工合成的化合物的酶类，因而其残效期更长，且其分解产物残留于植物体内也可能对人类身体健康产生不利影响(赵敏，邵凤赟，周淑新，崔彦宏，2007.植物生长调节剂对农作物和环境的安全性.环境与健康杂志，(05)，94-96.)。此外，植物生长调节剂的造价也是非常昂贵的(sontakke,s.,nagavekar,n.,dubey,k.k.,singhal,r.2018.supercritical carbon dioxide extraction of triacontanol from green tea leaves and its evaluation as an unconventional plant growth regulator for spinach tissue culture.biocatalysis and agricultural biotechnology,16,476-482.)。因此，本领域中非常迫切需要开发出一种无毒、无副作用、造价低廉的天然植物生长调节剂。
3.牡丹(paeonia suffruticosa andrews)属于芍药科、芍药属、牡丹组，落叶木本灌木。其花朵硕大，色彩艳丽，花型丰富，自古就有“花中之王”的美誉，常被作为美化树种栽植，也可作切花观赏；同时，牡丹的叶、花、根皆可入药，如丹皮、牡丹油等；此外，牡丹的籽油具有极高的营养价值，对人体健康极为有益。
4.目前，
‘
凤丹’牡丹种苗生产主要靠种子繁殖。由于
‘
凤丹’牡丹的遗传背景高度杂合，而且，种子繁殖很难保持理想的遗传性状，因而由此获得的种苗参差不齐，无法得到均一化的种苗，导致无法保持或提高后续获得的产品品质。此外，种子繁殖周期长，实生苗一般需要养护3至5年才能开花，然后再经历初选、复选和定名等过程，推出一个新品种至少要10年以上时间(zhu x，li x，ding w，jin s，wang y.2018.callus induction and plant regeneration from leaves of peony.horticulture，environment，and biotechnology，59(4)：575-582)。
5.为了克服上述问题，可以利用胚直接生根来建立牡丹再生体系，由此缩短育种周期，而且还可以拯救发育不良的种子，提高育种效率(徐莉，成仿云，钟原.2017.牡丹胚培养快速成苗技术研究.植物研究)。王莹等将紫斑牡丹种胚在1.0mg/l iaa 1.0mg/l ga3培养基中培养35天使紫斑牡丹成苗率仅为11％(王莹，何桂梅，韩丽晓.紫斑牡丹胚培养及幼苗生长的研究.湖南农业科学，2012(9):103-106)。徐莉等单独利用ga3打破上、下胚轴休眠，
同时辅以ac吸附抑制生长的有害物质，培养25天后得到发达的根系，使
‘
凤丹’的成苗率可以达到63.88％(徐莉，成仿云，钟原.2017.牡丹胚培养快速成苗技术研究.植物研究)。目前利用胚直接生根建立牡丹再生体系仍然存在生根困难、成苗率低等问题，完整的组织培养体系尚未建立。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的上述的一个或多个技术问题，本发明第一方面提供了一种植物提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)获取落地生根植株的叶片并捣碎，获得糊状物；(2)使用浸提溶剂浸提所述糊状物并过滤，得到作为滤液的所述植物提取物。
7.本发明在第二方面提供了一种植物生长调节剂，所述植物生长调节剂包含根据本发明第一方面所述方法提取得到的植物提取物。
8.本发明在第三方面提供了一种生根培养基，所述生根培养基包含根据本发明第一方面所述方法提取得到的植物提取物；
9.本发明在第四方面提供了根据本发明第一方面所述方法提取得到的植物提取物在如下方面的应用：
10.(1)制备生根培养基；
11.(2)促进下胚轴的萌发；
12.(3)促进下胚轴的生根；
13.(4)促进下胚轴发生的根系的伸长生长。
14.本发明在第五方面提供了一种牡丹组织培养方法，所述方法包括如下步骤：
15.(1)获取牡丹种子，并从中获取种胚；
16.(2)将种胚接种到生根培养基中培养，得到长出根系的幼苗；
17.其中，所述生根培养基为根据本发明第一方面所述方法提取得到的生根培养基。
18.相对于现有技术，本发明具有如下技术效果：
19.(1)本发明的所采用的材料是天然植物，且容易种植，材料易于获得，成本低。
20.(2)本发明的制备方法简单，不需要特殊设备，造价低。
21.(3)本发明的制备方法甚至不需要任何有机溶剂就可以提取，无污染。
22.(4)本发明的植物提取物提取自天然植物，无毒无副作用。
23.(5)本发明的植物提取物应用在植物组织培养中所使用的生根培养基的组分，可以明显缩短下胚轴萌发时间，显著缩短组织培养中这一阶段所需的时间，而且还促进生根，提高生根率，并促进根的伸长生长。例如以牡丹植物为例，10天就开始出现胚根萌动，15天就可获得较长的根系，生根率可高达77.5％。
附图说明
24.图1为a为研磨棒和1.5ml离心管；b为捣碎中的100mg的落地生根；c为捣碎成糊状后的落地生根；d为转入50ml的大离心管并加10ml超纯水后的落地生根溶液。
25.图2为胚先生根直接培养的完整程序。a.从成熟种子中取出的完整胚。b.单独添加3mg/l植物提取物胚培养10天。c.单独添加3mg/l植物提取物胚培养15天。d.单独添加3mg/l
植物提取物胚培养20天。e.添加iba的培养基胚培养10天。f.添加iba的培养基胚培养15天。g.添加iba的培养基胚培养20天。h.壮苗培养30天。
26.图3为添加3mg/l的植物提取物后胚培养在不同培养时间中生根的情况。
27.图4为最佳pgrs组合对
‘
丹凤’成熟胚培养下生根率的影响。注：组合1为不添加植物生长调节剂；组合2为3mg/l植物提取物；组合3为1.5mg/l iaa；组合4为2mg/l iba；组合5为3mg/l植物提取物 2mg/l iba；组合6为3mg/l植物提取物 2mg/l iba 1.5mg/l iaa。
具体实施方式
28.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.落地生根(bryophyllum pinnatum(lam.)oken)为景天科(crassulaceae)落地生根属(bryophllurn salisb)植物是一种多年生肉质草本植物，叶肥厚，叶片边缘锯齿处可萌发出两枚对生的小叶，在潮湿的空气中，上下面能长出纤细的气生须根，这小幼芽均匀排列在大叶片的边缘。目前落体生根提取物多采用特定溶剂提取特定工艺来提取，并且主要用于医药、美容用途。本发明人长期以来对天然植物生长调节剂尤其是来自天然植物提取物的生长调节剂进行广泛而深入的研究，意外发现通过容易获得的水来从落地生根提取得到的提取物有新的用途，其可在短时间内打破植物例如牡丹下胚轴休眠，并且很早就开始出现胚根萌动，而且获得较长的根系和较高的生根率，由此完成的本发明。
30.本发明第一方面提供了一种植物提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
31.(1)获取落地生根植株的叶片并捣碎，获得糊状物；
32.(2)使用浸提溶剂浸提所述糊状物并过滤，得到作为滤液的所述植物提取物。
33.在一些优选的实施方式中，所述方法还包括在过滤之后对滤液进行灭菌的步骤。
34.在一些更优选的实施方式中，所述方法还包括将所提取得到的植物提取物进行分装的步骤。
35.在一些更优选的实施方式中，所述方法还包括将植物提取物在-20℃以下的温度保存的步骤。
36.在一些更优选的实施方式中，所述糊状物与浸提溶剂的重量比为1:50至1:200(例如1:100或1:150)，更优选为1:100。
37.在一些更优选的实施方式中，所述浸提溶剂为水。
38.在一些更优选的实施方式中，所述浸提的浸提温度为4℃至25℃(例如4、6、8、10、15、20或25℃)，所述浸提的浸提时间为6小时至24小时(例如6、12、18或24小时)。
39.在一些更优选的实施方式中，所述过滤采用滤孔为30微米孔径以下例如25微米滤孔的滤膜进行。
40.在一个更具体的实施方式中，所述方法通过如下方式进行：
41.切取落地生根植株的叶片尤其是幼嫩的叶片，用天平称取10mg的鲜叶片放入1.5ml的离心管，利用研磨棒捣碎研磨成糊状，然后转入装有10ml无菌水的50ml离心管中
(参见图1)，4℃放置12小时，利用注射器和直径为100mm、滤孔孔径为0.22微米的圆形混合纤维滤膜将植物提取物液过滤灭菌，再分装到无菌的1.5ml的离心管中，最后放入-20℃冰箱长久保存备用。
42.本发明在第二方面提供了一种植物生长调节剂，所述植物生长调节剂包含根据本发明第一方面所述方法提取得到的植物提取物。
43.更优选的是，所述植物生长调节剂为根据本发明第一方面所述方法提取得到的植物提取物。
44.本发明在第三方面提供了一种生根培养基，所述生根培养基包含根据本发明第一方面所述方法提取得到的植物提取物；
45.在一些更优选的实施方式中，所述植物提取物在所述生根培养基中的浓度为0.5mg/l至5.0mg/l，更优选为2.0mg/l至3.0mg/l；
46.进一步优选的是，所述培养基还包含wpm基础培养基、蔗糖和植物凝胶，更优选的是，所述蔗糖在所述生根培养基中的浓度为25g/l至30g/l，所述植物凝胶在所述生根培养基中的浓度为2.0g/l至3.0g/l。
47.在一些更优选的实施方式中，所述生根培养基还包含iba和/或乙酰水杨酸；
48.优选的是，所述生根培养基还包含iba或者还包含iba和乙酰水杨酸的组合，更优选的是，iba在所述生根培养基中的浓度为1.0mg/l至3.0mg/l，所述乙酰水杨酸在所述生根培养基中的浓度为1.0mg/l至2.0mg/l。
49.本发明在第四方面提供了根据本发明第一方面所述方法提取得到的植物提取物在如下方面的应用：
50.(1)制备生根培养基；
51.(2)促进下胚轴的萌发；
52.(3)促进下胚轴的生根；
53.(4)促进下胚轴发生的根系的伸长生长。
54.在一些更优选的实施方式中，所述生根培养基为用于以牡丹种子的种胚进行组织培养所使用的生根培养基；所述牡丹优选为
‘
丹凤’品种，该品种购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所。
55.本发明在第五方面提供了一种牡丹组织培养方法，所述方法包括如下步骤：
56.(1)获取牡丹种子，并从中获取种胚；
57.(2)将种胚接种到生根培养基中培养，得到长出根系的幼苗；
58.其中，所述生根培养基为权利要求5或6所述的生根培养基。
59.在一些优选的实施方式中，所述方法还包括：
60.(i)在获取种胚之前，将种子清洗、浸泡软化、消毒并清洗的步骤；和/或
61.(ii)将长出根系的幼苗转移到再生培养基中培养以诱导幼苗再生的步骤，其中，所述再生培养基的组成如下：wpm 30g/l蔗糖 1.0mg/l 6-ba 0.5mg/l ga3 3g/l植物凝胶，ph 6.0；
62.优选的是，在生根培养基中培养至根系的长度达到2cm以上，培养条件为25℃，黑暗条件。
63.实施例
64.实施例1：植物提取物的制备
65.切取景天科落地生根植株的幼嫩叶片，用天平称取100mg的鲜叶片放入1.5ml的离心管，利用研磨棒捣碎研磨成糊状，后转入装有10ml无菌水的50ml离心管中(参见图1)，4℃放置12小时，在超净工作台中利用注射器和直径为100mm滤孔直径为0.22μm圆形混合纤维滤膜将植物提取物过滤灭菌后分装到无菌的1.5ml的离心管中，后放入-20℃冰箱长久保存备用。
66.实施例2：植物提取物功能验证
67.1.材料与方法
68.1.1材料
69.本实施例采用牡丹品种
‘
凤丹’(paeonia ostii
‘
fengdan’)的成熟种子胚。
‘
凤丹’生长在中国北京中国农业科学院蔬菜与花卉研究所的资源圃中。在秋天采集成熟的
‘
凤丹’种子，室温保存，以便后续使用
70.1.2.方法
71.种子在自来水下冲洗10分钟，然后用清洁剂(立白)洗涤，最后在自来水中冲洗干净，以清除种子外部污渍。随后，通过浸泡清水将种子软化过夜(约12小时)，并选择沉入盆底部的充实饱满的种子。在超净工作台中将成熟种子用75％酒精消毒1分钟，用无菌蒸馏水冲洗3-5次，然后用2％的次氯酸钠消毒15分钟，用无菌蒸馏水中彻底清洗。
72.植物提取物、iaa和h2o2的最佳浓度筛选
73.2018年8月份采收的种子，在2019年4月份进行实验。
74.在超净工作台中，用无菌的手术刀从采用上述方法清洗和消毒后的种子中取出完整胚，接种到含有不同浓度的植物提取物、iaa和h2o2的p1培养基(wpm 30g/l蔗糖 2.5g/l植物凝胶(phytagel),ph 6.0)中，25℃暗培养2周，用于下胚轴萌发和根系诱导，从而筛选出各植物生长调节剂(pgrs)的优选生根浓度(3个重复)。实验中使用了不同浓度的化合物：植物提取物为0，0.5mg/l，1.0mg/l，1.5mg/l，2.0mg/l，3.0mg/l，5.0mg/l，h2o2为0，0.005
‰
，0.015
‰
，0.025
‰
，0.035
‰
，iaa为0，0.5mg/l，1.0mg/l，2.0mg/l，3.0mg/l，iba为2mg/l。最后，将所有幼苗(根长大于2.0cm)转移到bg培养基(wpm 30g/l蔗糖 1.0mg/l 6-ba 0.5mg/l ga3 3g/l植物凝胶,ph 6.0)上，诱导幼苗再生。
75.不同植物生长调节剂的优选组合筛选
76.2019年8月份采收的种子，在2019年10月份进行实验。
77.因为有人提议使用2.0mg/l的iba用于生根(shen m,tang z,teixeira da silva j a,yu x,2015.induction and proliferation of axillary shoots from in vitro culture of paeonia lactiflora pall.mature zygotic embryos.new zealand journal of crop and horticultural science,43:42-52.doi:10.1080/01140671.2014.944548)，所以本研究将筛选出的植物提取物的最佳浓度(3.0mg/l)与2.0mg/l的iba和1.5mg/l乙酰水杨酸(asa)的组合加入到p1培养基(wpm 30g/l蔗糖 2.5g/l植物凝胶(phytagel),ph 6.0)中，在25℃黑暗条件下中培养3周(3个重复)，从而确定胚培养中胚轴萌发和根诱导的最佳植物生长调节剂组合。最后，将所有外植体(根长大于2.0cm)转移到bg培养基(wpm 30g/l蔗糖 1.0mg/l 6-ba 0.5mg/l ga3 3g/l植物凝胶,ph 6.0)上，以诱导植株再生苗再生。
78.本发明人还对iba和植物提取物单独处理的胚的生根情况进行拍照，发现成熟胚接种后，只需30-45天就能生长出健康的幼苗(参见图2)。
79.ga3对胚轴萌发和根系诱导作用的试验
80.2019年8月份采收的种子，在2019年10月份进行实验。
81.本发明人采用ga3作为植物生长调节剂加入到p1培养基(wpm 30g/l蔗糖 2.5g/l植物凝胶(phytagel)，ph 6.0)中，ga3在培养基的浓度为0.5mg/l，然后在25℃黑暗条件下中培养30天(3个重复)，以测试其对于下胚轴萌发和根系诱导的作用。最后，将所有幼苗(根长大于2.0cm)转移到bg培养基(wpm 30g/l蔗糖 1.0mg/l 6-ba 0.5mg/l ga3 3g/l植物凝胶，ph 6.0)上，诱导幼苗再生。结果发现，培养到30天时，其生根率百分比才达到68.33
±
1.67。
82.1.3结果
83.首先对植物提取物、h2o2和iaa等植物生长调节剂(pgrs)对成熟胚培养生根的浓度进行了优化。结果表明，3种植物生长调节剂都具有促进下胚轴萌发和生根的作用，其生根率显著高于对照组(表1)。植物提取物的最佳浓度为3mg/l植物提取物，可获得46.67
±
1.67％的生根率；iaa的最佳浓度为1.5-2mg/l，可获得26.67
±
1.67％的生根率；h2o2的最佳体积分数为0.015
‰
，可获得33.33
±
3.33％的生根率。3mg/l的植物提取物显著提高了下胚轴萌发和根系诱导频率(参见表2)。
84.表1.植物提取物、h2o2和iaa对
‘
凤丹’成熟胚培养下胚轴萌发和生根的影响(培养至第15天时测得，n＝3)
[0085][0086]
注：数据表示均值
±
标准误差，为不同调节剂组分单因素分析，不同小写字母表示差异显著(p<0.05)
[0087]
表2.植物提取物、h2o2和iaa最适浓度对
‘
凤丹’成熟胚培养下胚轴萌发和生根的影
响(培养至第15天时测得，n＝3)
[0088][0089]
注：数据表示均值
±
标准误差，不同小写字母表示差异显著(p<0.05)
[0090]
随后，在上述筛选出的最优植物提取物的基础上测试了植物提取物与iba和乙酰水杨酸(asa)的组合的作用。当三种植物生长调剂联合使用时，iba产生的差异不显著(参见表3)；植物提取物单独处理，在培养10天时就有高达一半的下胚轴生根，到第15天时生根率就达到最高值。但是，iba处理在第15天之前，生根率都还是0(参见表3和图3和图4)。
[0091]
表3.不同最佳pgrs组合对
‘
凤丹’成熟胚培养下胚轴萌发和生根的影响(第10、15、20天测得)
[0092][0093]
注：数据表示均值
±
标准误差，不同小写字母表示差异显著(p<0.05)
[0094]
另外，从图2可以看出，在处理第10天时，胚轴就已经发生明显的萌发；从图3可以看出，采用植物提取物处理，在第15天其生根率就达到最大；从图4可以看出，3mg/l植物提取物处理能够显著提高生根率。
[0095]
1.4结论
[0096]
从以上结果可以看出，3mg/l植物生长提取液具有打破牡丹下胚轴休眠，促进生根的作用，可以缩短育种周期，提高育种效率，还可进行胚拯救。具有造价低廉，操作方便，无毒易降解，环保等多种优点。
[0097]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。