免疫调节性间充质干细胞的制作方法

1.本发明涉及分离的间充质干细胞和包含所述间充质干细胞的细胞组合物。此外，本发明的细胞组合物可以用于治疗免疫相关疾病和炎性过程以调节免疫系统。


背景技术：

2.间充质干细胞(msc)是多能干细胞，其特征是自我更新、产生克隆细胞群和多系分化。它们几乎存在于所有组织中，并在组织修复和再生中发挥重要作用。此外，间充质干细胞通过与先天性和适应性免疫系统中的免疫细胞相互作用而具有广泛的免疫调节特性，导致各种效应子功能的免疫抑制。它们的免疫调节功能通过细胞与细胞的直接接触、细胞因子的分泌和/或两种机制的组合来发挥作用。
3.msc与免疫反应相互作用的机制是多因素的，并通过细胞与细胞的直接接触、细胞因子的分泌和/或两种机制的组合发挥作用。间充质干细胞具有与多种免疫细胞(包括b细胞、t细胞、树突细胞(dc)、自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)相互作用的能力。另一方面，依赖于细胞
‑
细胞接触行为的相互作用依赖于可溶性免疫因子的分泌来诱导msc调节的免疫抑制。这些特定的调节剂，包括多种免疫调节因子、细胞因子和生长因子，调节炎症反应并平衡免疫特征。
4.尽管msc(尤其是同种异体msc)在多种疾病的细胞治疗方面具有巨大潜力，但由于宿主免疫反应排斥细胞，因此无法保证组织愈合和/或疾病结果的功效。已经做出各种努力来提高msc的免疫抑制潜力并通过例如选择特定的msc来延长植入时间。
5.us 20110311496提供了用于促进伤口愈合或骨折愈合的msc的组合物和促进伤口愈合或骨折愈合的方法，其包括施用有效量的msc的步骤。
6.us 20140017787提供了选择性促进或抑制炎症的分离的、受刺激的msc，以及其生产和使用方法。us'787使用影响msc的免疫调节反应的特定toll样受体的刺激来进行均匀的细胞制备，以改进基于干细胞的疗法。
7.ep3429360提供了一种基于一种或多种标志物的表达来选择具有增强功效的msc和其msc具有增强功效的供体的方法。
8.ep106605公开了一种通过用有效减少或抑制宿主对移植物排斥的量的msc治疗接受者来降低该接受者中对移植物的免疫反应的方法。ep'052专注于抑制t细胞对同种异体抗原的反应。
9.然而，本领域仍然需要具有良好治疗安全性和功效的改进的免疫调节性msc。
10.本发明旨在提供一种分离的msc，其特征在于在代表性炎症环境中具有特定的免疫相关特性。


技术实现要素：

11.本发明提供了根据权利要求1所述的分离的msc。
12.在第二方面，本发明提供根据权利要求7所述的细胞组合物，其包含分离的msc。
13.在最后一方面，本发明提供了根据权利要求12所述的用于治疗免疫相关疾病和炎性过程的细胞组合物。
附图说明
14.图1显示了酶联免疫吸附测定(elisa)实验的图示，其中评估了msc和pbmc分泌pge2的增加。
15.图2显示了elisa实验的图示，其中记录了msc表达tgf
‑
β的增加。
16.图3显示了elisa实验的图示，其中评价了msc和pbmc分泌il
‑
6的增加。
17.图4显示了elisa实验的图示，其中可视化了pbmc表达tnf
‑
α的降低。
18.图5显示了从马分离的msc上不存在mhc ii类分子。
具体实施方式
19.本发明涉及具有特定免疫调节特性的分离的msc。更具体地，本发明涉及包含所述分离的msc的细胞组合物及其用于治疗免疫相关疾病和炎症过程的用途。
20.本发明的分离的msc具有免疫调节特性，因此由于宿主的免疫原性反应被规避而对于细胞移植是理想的。
21.除非另有定义，用于公开本发明的所有术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括了术语定义以更好地理解本发明的教导。
22.如本文所用，以下术语具有以下含义：
23.除非上下文另有明确规定，否则本文所用的“一个”、“一种”和“这个/该”指的是单数和复数指代对象。举例来说，“一个隔间”是指一个或多于一个的隔间。
24.如本文所用，“约”是指诸如参数、量、持续时间等的可测量值，意在涵盖指定值的 /
‑
20％以下、优选 /
‑
10％以下、更优选 /
‑
5％以下、甚至更优选 /
‑
1％以下、并且还更优选 /
‑
0.1％以下的变化，只要所述变化适合于执行所公开的发明。然而，应当理解，修饰语“约”所指的值本身也被具体公开。
25.如本文所用，“包含”与“包括”或“含有”同义，并且是包括性或开放式术语，其指定后续项目(例如，组分)的存在，并且不排除或预排除本领域已知的或其中公开的另外的、未叙述的组分、特征、要素、构件、步骤的存在。
26.通过端点对数值范围的叙述包括在该范围内所囊括的所有数字和分数，以及所叙述的端点。
27.定义
28.术语“分离”是指从细胞培养物或生物样品(如血液)中物理鉴定和分离细胞，这可以通过应用适当的细胞生物学技术进行，这些技术或是基于细胞培养物的检查和对符合标准的细胞的表征(以及在可能和需要时进行物理分离)，或是根据抗原的存在/不存在和/或细胞尺寸(例如通过facs)对细胞进行自动分选。在一些实施方式中，术语“分离”可包括进一步的细胞的物理分离和/或定量的步骤，尤其是通过进行流式细胞术。
29.术语“间充质干细胞”或“msc”是指多能的、自我更新的细胞，其表达一组特定的表面抗原，并在体外培养或当存在于体内时可分化为各种细胞类型，包括但不限于脂肪细胞、
软骨细胞和骨细胞。
30.如本文所用，“炎性环境”或“炎性条件”是指具有以下特征的状态或条件：(i)至少一种促炎性免疫细胞、促炎性细胞因子或促炎性趋化因子的增加；和(ii)至少一种抗炎性免疫细胞、抗炎性细胞因子或抗炎性趋化因子的减少。优选地，如本文所用的“炎性环境”或“炎性条件”包含至少15％增殖的t淋巴细胞，其中所述淋巴细胞包含至少t辅助(th)1和th2细胞并产生至少7pg/ml tnf
‑
α和/或13pg/ml tgf
‑
β。
31.术语“抗炎”、“抗炎性”、“免疫抑制性”和“免疫抑制剂”是指特征在于至少一种局部炎症指征(例如但不限于，热、疼痛、肿胀、发红和功能丧失)的减少和/或具有以下特征的系统性状态的变化的任何状态或条件：(i)至少一种促炎性免疫细胞、促炎性细胞因子或促炎性趋化因子的减少；和(ii)至少一种抗炎性免疫细胞、抗炎性细胞因子或抗炎性趋化因子的增加。
32.本发明的术语“外周血单个核细胞”或“pbmc”包括任何外周血细胞，即淋巴细胞(t淋巴细胞、b淋巴细胞和自然杀伤(nk)细胞)和单核细胞。在本发明中，优选至少20.5％的所述t淋巴细胞对cd3呈阳性和/或至少19.8％的所述b淋巴细胞对cd138呈阳性。
33.如本文所用，术语“阳性”是指在细胞表面、细胞内和/或分泌物上存在生物活性和/或生物标志物。优选地，本发明的细胞或细胞组合物的生物活性和/或标志物测量为阳性，各为至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，或60％至99％，或70％至90％。
34.如本文所用，术语“阴性”是指在细胞表面、细胞内和/或分泌物上不存在生物活性和/或生物标志物。优选地，本发明的细胞或细胞组合物的生物活性和/或标志物测量为阴性，各自小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于2％。
35.本发明的“群倍增时间”或“pdt”的计算公式为：pdt＝ln(n
f
/n
i
)/ln(2)，其中n
f
为细胞脱离后的最终细胞数，其中n
i
为时间点零处的初始细胞数。
36.术语“抗凝剂”是指可以抑制血液凝结的组合物。本发明中使用的抗凝剂的实例包括edta或肝素。
37.本发明中的术语“血沉棕黄层”应理解为未凝结血液的部分，优选其通过密度梯度离心获得，由此该部分富含白细胞和血小板。
38.术语“血中间相”应理解为血液的一部分，优选其通过密度梯度获得，位于主要由红细胞和多形核细胞组成的底部和主要由血浆组成的上部之间。血中间相是血液单个核细胞(bmc)的来源，包括单核细胞、淋巴细胞和msc。
39.如本文所用，术语“悬浮直径”被理解为细胞处于悬浮时的平均直径。测量直径的方法是本领域已知的。可能的方法是流式细胞术、共聚焦显微镜、成像细胞仪或本领域已知的其他方法。
40.术语“患者”、“受试者”、“动物”或“哺乳动物”可互换使用并指待治疗的哺乳动物受试者。
41.术语“诱导”应理解为激活多潜能或多能细胞中细胞类型特异性基因或分子从而将此类细胞驱化为更明确、特化或分化的细胞谱系或细胞类型的过程。
42.术语“治疗有效量”是有效减轻症状或改善疾病状况的化合物或组合物的最小量或浓度。
43.术语“治疗”是指减少或预防病理状况或病症的治疗性、预防性或预防措施。
44.如本文所用，术语“体外(in vitro)”表示身体之外或外部。本文使用的术语“体外”应理解为包括“离体(ex vivo)”。术语“离体”通常是指从体内取出并在身体之外(例如在培养容器或生物反应器中)维持或繁殖的组织或细胞。
45.说明
46.本发明涉及特定类型的msc、包含此类msc的组合物及其临床用途。
47.在第一方面，本发明提供了一种分离的msc，其中所述细胞经测定对间充质标志物cd29、cd44和cd90呈阳性，而对mhc ii类分子呈阴性。当存在于炎性环境或条件下时，所述细胞分泌免疫调节性pge2细胞因子。
48.炎性环境或条件的特征在于血液免疫细胞的募集。炎性介质包括前列腺素、炎性细胞因子如il
‑
1β、tnf
‑
α、il
‑
6和il
‑
15，趋化因子如il
‑
8，和其他炎性蛋白如tnf
‑
α、ifn
‑
γ。这些介质主要由单核细胞、巨噬细胞、t细胞、b细胞产生，以在炎症部位募集白细胞，随后对刺激性和抑制性相互作用的复杂网络进行刺激，以同时破坏和治愈炎症过程中的组织。
49.前列腺素e2(pge2)是前列腺素家族的一个亚型。pge2由膜磷脂释放的花生四烯酸(aa)通过系列酶促反应合成。环氧合酶
‑
2(cox
‑
2)称为前列腺素
‑
内过氧化物酶合酶，其将aa转化为前列腺素h2(pgh2)，而pge2合酶将pgh2异构化为pge2。作为一种限速酶，cox
‑
2响应于生理条件(包括受生长因子、炎性细胞因子和肿瘤促进剂的刺激)而控制pge2合成。
50.在一个具体实施方式中，存在于炎性环境中的所述msc以103至106皮克/毫升的浓度分泌可溶性免疫因子前列腺素e2(pge2)以诱导msc调节的免疫抑制。
51.在上述特定浓度范围内，msc的pge2分泌刺激体外抗炎过程，并且结合其分化成适当细胞类型的能力使其成为细胞移植的理想选择。
52.本发明的分离的msc的特征在于存在间充质标志物cd29、cd44和cd90。借助后者，可以分析获得的msc的纯度，并可以确定msc的百分比。
53.cd29是由整合素β1基因编码的细胞表面受体，其中该受体与其他蛋白质形成复合物，从而在与配体结合后调节生理活性。cd44抗原是一种细胞表面糖蛋白，其参与细胞间相互作用、细胞粘附和移动。此外，cd44是透明质酸的受体，并且还可以与其他配体，例如骨桥蛋白、胶原蛋白和基质金属蛋白酶(mmp)相互作用。cd90抗原是一种保守的细胞表面蛋白，其被认为是干细胞如msc的标志物。本发明的分离的msc对cd29/cd44/cd90呈三重阳性，使得本领域技术人员能够快速且明确地选择msc并提供对更下游应用所关注的msc生物学特性。
54.在一个具体实施方式中，本发明的msc对作为典型的msc标志物的波形蛋白、纤连蛋白、ki67或其组合测定为阳性。
55.此外，本发明的分离的msc的特征在于不存在主要组织相容性复合体(mhc)ii类分子，优选所有目前已知的mhc ii类分子，将细胞归类为可用于哺乳动物细胞疗法(例如马细胞疗法)的细胞。即使分离的msc部分分化，msc仍保持对mhc ii类分子呈阴性。
56.msc通常在其表面表达mhc i类抗原，但只表达有限量的mhc ii类抗原。在一个特定的实施方式中，本发明的分离的msc对mhc i类标志物也测定为阴性。在最优选的实施方式中，所述msc对mhc i类和ii类标志物测定为阴性，其中所述细胞表现出极低的免疫原性
表型。
57.msc的这些免疫学特性限制了受体免疫系统在细胞移植后识别和排斥细胞(优选同种异体细胞)的能力。过msc产生因子(这调节免疫反应)以及msc在局部刺激下分化成适当细胞类型的能力使它们成为用于细胞疗法的理想干细胞。
58.在另一个和其他实施方式中，msc对cd45抗原(一种造血细胞的标志物)测定为阴性。
59.在最优选的实施方式中，分离的msc测定为：
60.‑
对间充质标志物cd29、cd44和cd90呈阳性；
61.‑
对包含在由波形蛋白、纤连蛋白、ki67或其组合组成的组中的一种或多种标志物呈阳性；
62.‑
对mhc i类和/或ii类分子呈阴性；和
63.‑
对造血标志物cd45呈阴性，
64.其中，当存在于炎性环境或条件下时，所述细胞以103至106皮克/ml的浓度分泌免疫调节性pge2细胞因子。
65.通常，可以认为文献中发表的用于鉴定和表征特定细胞类型(例如间充质、肝、造血、上皮、内皮标志物)或具有特定定位(例如细胞内、细胞表面或分泌)的细胞标志物的任何技术适合于表征msc。此类技术可分为两类：允许在分析过程中保持细胞完整性的技术，以及基于使用此类细胞产生的提取物(包括蛋白质、核酸、膜等)的技术。在识别这些标记物并将它们测量为阳性或阴性的技术中，优选免疫细胞化学或细胞培养基分析，因为这些技术允许即使使用少量细胞也能检测到标记物，而不会破坏它们(在蛋白质印迹或流式细胞术的情况下会发生破坏)。
66.可通过流式细胞术、免疫细胞化学、质谱、凝胶电泳、免疫测定(例如免疫印迹、蛋白质印迹、免疫沉淀、elisa)、核酸扩增(例如实时rt
‑
pcr)、酶活性、组学技术(蛋白质组学、脂质组学、糖组学、转录组学、代谢组学)和/或其他生物活性等技术鉴定分离的msc的相关生物学特征。
67.在一个优选的实施方式中，当存在于炎性环境或条件下时，msc的至少一种选自il
‑
6、il
‑
10、tgf
‑
β、no或其组合的分子的分泌增加，并且il
‑
1的分泌减少。可以与具有与上述相同特征但不经受所述炎性环境或条件的间充质干细胞进行比较。
68.优选地，msc具有pge2并伴有两种以上的上述因子组合的分泌的增加。
69.pge2、il
‑
6、il
‑
10、tgf
‑
b和no有助于抑制主要免疫细胞群如t细胞和b细胞的增殖和功能。此外，msc在其表面上表达低水平的mhc i类分子和/或对mhc ii类分子呈阴性，从而逃避免疫原性反应。此外，目前的分离的msc可以通过增加上述因子的分泌来抑制白细胞的增殖，再次有助于避免宿主的免疫原性反应。
70.根据本发明的msc可以来源于各种组织或体液，包括但不限于骨髓、脂肪、肌肉、脐带血、外周血、肝脏、胎盘、皮肤、羊水。优选地，msc源自血液，更优选外周血。本发明的msc可以通过本领域已知的任何标准规程获得。
71.在一个实施方式中，所述msc可以通过其中从血液或血相中分离msc并且其中在低葡萄糖培养基中培养和扩增所述细胞的方法获得。
72.在一个实施方式中，这种方法可以包括以下步骤：
73.a.在以抗凝剂涂布的样品瓶中收集来自供体的一份或多份血液样品；
74.b.离心血液样品以获得三相分布，其由血浆相、血沉棕黄层和红细胞相组成；
75.c.收集血沉棕黄层并将其加载到密度梯度上；
76.d.收集从步骤c)的密度梯度获得的血液中间相；
77.e.通过离心从血液中间相中分离msc；
78.f.在培养物中接种2.5
×
105/cm2和5
×
105/cm
2 msc并将它们保持在补充有地塞米松、抗生素和血清的低葡萄糖生长培养基中。
79.接种的数量对于最终以可接受的浓度获得纯净且有活力的msc群至关重要，因为过于密集的接种会导致扩增过程中大量细胞死亡和不均匀的msc群，而过于稀疏的接种将导致极少或没有msc集落形成，因此无法或几乎不可能进行扩增，或者花费时间过长。在这两种情况下，细胞的活力都会受到负面影响。
80.在本发明的一个优选实施方式中，分离的msc具有高细胞活力，其中至少90％、更优选至少95％、最优选100％的所述细胞是有活力的。
81.血液中间相(blood
‑
interphase)是血液单个核细胞(bmc)的来源，包括单核细胞、淋巴细胞和msc。优选地，淋巴细胞在37℃下被洗掉，而单核细胞在缺乏维持它们存活所需的细胞因子的情况下在2周内死亡。通过这种方式，msc被纯化。从血液中间相中分离msc优选通过离心血液中间相来完成，之后用合适的缓冲液例如磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀至少一次。
82.在另一实施方式中，本发明的分离的msc对单核细胞和巨噬细胞呈阴性，两者均在0％至7.5％的范围内。
83.特别是，间充质细胞在生长培养基中至少保持2周。优选地，使用含有1％地塞米松的生长培养基，因为分离的msc的特定特征被保留在所述培养基中。
84.在最少2周(14天)、优选3周(21天)后，msc集落将在培养瓶中可见。在随后的步骤g)中，至少6
×
103干细胞/cm2被转移到含有低葡萄糖、血清和抗生素的扩增培养基中，目的是扩增msc。优选地，msc的扩增将在最少五次细胞传代中发生。这样可以获得足够的细胞。优选地，细胞在70％至80％汇合时分拆。msc在培养中最多可保持50次传代。在此之后，会出现活力丧失、衰老或突变形成的风险。
85.在另一个实施方式中，分离的msc扩增期间每次传代之间的群倍增时间(pdt)应为胰蛋白酶消化后0.7至3天。
86.分离的msc扩增期间每次传代之间的所述pdt优选为胰蛋白酶消化后0.7至2.5天。
87.在优选实施方式中，分离的msc具有纺锤形形态。
88.本发明的分离的msc的形态学特征将该细胞分类为细长的、成纤维细胞样的纺锤形细胞。这种类型的细胞不同于具有主要显示三角形或星状细胞形状的小的自我更新细胞的其他msc群，以及具有大的、立方形或扁平图案并且具有突出的细胞核的msc群。选择具有这种特定形态特征以及生物标志物的msc使本领域技术人员能够分离本发明的msc。本领域技术人员可以使用相差显微镜容易地进行细胞形态学分析。此外，可以使用流式细胞术中的正向和侧向散射图或本领域技术人员已知的其他技术来评估msc的大小和粒度。
89.如果需要，可以将分离的msc诱导或分化为成体细胞。诱导或分化优选通过向细胞培养基中添加特定生长因子和/或其他分化因子和/或诱导因子来进行。这些因子的性质将
在很大程度上取决于分化和所需的成体细胞类型。在一个优选的实施方式中，根据本发明的msc可以分化成肌腱细胞、软骨细胞、骨细胞、肌细胞、脂肪细胞或成纤维细胞。体外分化导致mhc i类和ii类的表达增加。因此，我们的分化方案显示出这些标志物没有增加是有意义的。虽然mhc ii类表达在msc中完全不存在，但mhc i类在msc中以低水平表达。
90.在更优选的实施方式中，msc的悬浮直径为10μm至100μm。
91.本发明的分离的msc是基于尺寸/悬浮直径选择的。优选地，msc的细胞尺寸为10至100μm，更优选15至80μm，更优选20至75μm，更优选25至50μm。优选地，基于细胞尺寸的细胞选择通过过滤步骤进行。例如，通过过滤系统按尺寸对细胞浓度为104至107msc/ml的分离的msc(其中所述细胞优选在低葡萄糖dmem培养基中稀释)进行选择，其中细胞通过使用40μm过滤器的双重过滤步骤。优选双重或多重过滤步骤。后者提供了大量的单细胞并避免了细胞聚集体的存在。所述细胞聚集体可能会在通过冷冻保存细胞期间导致细胞死亡，并且都可能对细胞的进一步下游应用产生影响。例如，当静脉内施用时，细胞聚集体可能会增加发生毛细血管栓塞的风险。
92.在另一个实施方式中，分离的msc诱导pbmc中的pge2、il
‑
6、il
‑
10、no或其组合的分泌和/或抑制tnf
‑
α、ifn
‑
γ、il
‑
1或其组合的分泌。
93.在炎性环境中，msc分泌多种调节宿主免疫反应的因子。此外，msc具有刺激作用以诱导一种或多种选自由pge2、il
‑
6、il
‑
10、no或其组合组成的组的因子的分泌。除了在炎性环境中msc对pbmc的刺激作用外，msc还对pbmc的分泌具有抑制作用，导致选自由tnf
‑
α、ifn
‑
γ、il
‑
1或其组合组成的组的一种或多种因子减少。msc在炎性环境中具有调节作用，使其可用于治疗各种疾病，尤其是免疫系统病症。
94.在一个优选的实施方式中，当msc和pbmc以1:0.001至1:1000的比例存在时，msc在炎性环境中的免疫调节活性是最佳的。msc与pbmc的比例特别优选为1:500，更优选1:100，更优选1:10。
95.在一个特别优选的实施方式中，msc分离自血液、优选外周血。血液可能是msc的最佳来源。血液不仅是一种无创、无痛的来源，而且采集简单、安全，因此易于获取。血液可源自所有哺乳动物，尤其是马、人、猫、狗、啮齿动物等。优选地，所述来源是马。
96.在第二个方面，本发明提供了包含至少60％的本发明的分离的msc的细胞组合物，其中至少95％的所述细胞是单细胞。
97.优选地，根据本发明的所述组合物包含至少90％的msc。更优选地，细胞组合物包含至少95％、更优选地至少99％的msc。在一个实施方式中，所述细胞组合物是纯组合物，包含100％根据本发明的msc。
98.在一个优选的实施方式中，所述组合物包含至少75％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、最优选至少90％的单细胞。优选地，所述细胞具有10μm至100μm的悬浮直径，细胞的单细胞性质和细胞的直径对于任何下游应用如细胞治疗以及对于细胞的活力都是至关重要的。
99.在更优选的组合物实施方式中，分离的msc测定为对cd29呈95％至100％阳性，对cd90呈95％和100％阳性，且对cd44呈80％至100％、更优选90％至100％、最优选95％至100％阳性，并且测定为对mhc ii类分子呈0％至5％、更优选0％至2％阴性。此外，msc测定为对mhc i类分子呈0％至60％、更优选0％至50％、更优选0％至45％阴性。在另一个组合物
实施方式中，msc测定为对cd45呈0％至7.5％阴性。
100.在更优选的实施方式中，包含在组合物中的msc具有至少90％、更优选95％、更优选99％、更优选100％的细胞活力。
101.本发明的另一个实施方式涉及通过使根据任一前述实施方式的msc组合物分化而获得的细胞组合物，其中所述细胞组合物的细胞是肌腱细胞、软骨细胞、骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、角质形成细胞、神经元或成纤维细胞。
102.在一个优选的实施方式中，细胞组合物包含治疗有效量的分离的msc，优选所述组合物包含105至107/ml所述分离的msc。
103.对受试者产生治疗益处的最小治疗有效剂量是至少105/ml分离的msc。所述msc可以在细胞组合物中稀释。优选地，细胞组合物包含105至5
×
105/ml分离的msc。
104.在另一个实施方式中，细胞组合物可以补充使用选自由富含血小板的血浆(prp)、透明质酸、基于透明质酸的组合物、糖胺聚糖或基于糖胺聚糖的组合物的成分。在某些情况下，可能需要将组合物与此类载体物质混合以增加组合物的有效性或产生协同效应。例如，所述载体物质有助于msc在细胞组合物中的归巢能力和免疫调节作用。
105.在细胞组合物的另一个实施方式中，当存在pbmc时，分离的msc表达pge2、il
‑
6、il
‑
10、tgf
‑
β、no或其组合。
106.在细胞组合物的优选实施方式中，当存在pmc时，分离的msc诱导pbmc中pge2、il
‑
6、il
‑
10、no或其组合的表达，和/或抑制pbmc中的tnf
‑
α、ifn
‑
γ、il
‑
1或其组合的分泌。
107.在存在pbmc时，分离的msc保持其分泌免疫调节因子的生物学能力。在msc的刺激作用后，pbmc介导的免疫反应(如pge2或其他因子的分泌)是msc进一步发挥免疫抑制作用的关键。
108.此外，msc和pbmc的比例是一个关键因素。因此，细胞组合物的更优选实施方式涉及msc和pbmc以1:0.001至1:1000的比例存在。所述msc与pbmc的比例优选为1:500，更优选为1:100，更优选为1:10。
109.体外测试表明，这些比率导致炎症环境中msc的有效免疫调节。预期体内结果相同，从而产生有效且安全的细胞疗法。
110.在另一个和其它的实施方式中，当存在pbmc时，细胞组合物将以103至106皮克/ml的浓度表达pge2。
111.在所述细胞组合物中存在pbmc的情况下，105至107/ml、更优选105至106/ml的分离msc浓度的标志为免疫抑制因子pge2的分泌，其中所述细胞分泌pge2的量为103至106皮克/ml。优选地，细胞组合物中的msc分泌104至105皮克/ml pge2，以充分抑制免疫活性细胞。
112.在优选的实施方式中，根据本发明的细胞组合物被配制用于通过静脉内、关节内、肌内、病灶内、动脉内、局部、结膜下注射或区域灌注的方式在受试者中施用。
113.在一个具体实施方式中，上述组合物可用于对受试者进行同种异体施用。同种异体使用可以更好地控制msc的质量，因为可以筛选不同的供体，并可以选择最佳供体。从制备功能性msc来看，后者必不可少。这与自体使用msc形成对比，因为在这种情况下无法确保细胞质量。
114.例如，当分离血液msc时，使用了来自供体的血液，该供体后来也是其分离的msc的接受者。在另一个实施方式中，使用来自供体的血液，其中供体优选与从供体血液中分离的
msc的受体具有相同的家族、性别或种族。特别是，这些供体将接受常见的目前可传播疾病或病理的测试，以避免这些病理或疾病通过干细胞横向传播的风险。优选地，供体动物被隔离。例如，当使用供体马时，可以对它们进行以下病理、病毒或寄生虫测试：马传染性贫血(eia)、马鼻肺炎(ehv
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1、ehv
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4)、马病毒性动脉炎(eva)、西尼罗河病毒(wnv)、非洲马病(ahs)、马类锥虫病(锥虫属)、马梨形虫病、鼻疽(锤骨、鼻疽)、马流感、莱姆疏螺旋体病(lb)(伯氏疏螺旋体、莱姆病)。
115.优选将根据本发明的组合物冷冻以允许组合物的长期储存。优选地，组合物将在低温和恒定温度下冷冻，例如低于
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20℃的温度。这些条件允许组合物的安全储存，并使组合物中的细胞保持其生物学和形态学特征，以及它们在储存期间和解冻后的高细胞活力。
116.在更优选的实施方式中，细胞组合物可以在
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80℃的最高温度下，任选地在液氮中储存至少6个月。
117.msc冷冻的一个关键因素是低温介质的组成，特别是dmso的浓度。dmso可防止在冷冻过程中的培养基中形成冰晶，但在高浓度时可能对细胞有毒性。在优选的实施方式中，dmso的浓度包括至多20％，更优选至多15％，更优选冷冻剂中dmso的浓度包括至多10％。低温培养基还包括低葡萄糖培养基，例如低葡萄糖dmem(dulbecco改良伊戈尔培养基)。
118.此后，在施用之前优选地在室温附近的温度，优选地在20℃至37℃的温度，更优选地在25℃至37℃的温度下解冻细胞组合物，并且时长为最多20分钟，优选最多10分钟，更优选最多5分钟。
119.此外，组合物在解冻后2分钟内施用，以确保组合物的活力。
120.优选地，本发明应用于兽医领域。组合物可以施用于受试者，其中所述受试者是哺乳动物，优选狗、猫、马或猴。
121.在第三方面，本发明提供应用于治疗受试者(优选哺乳动物受试者)的免疫相关疾病和/或炎性过程的本发明的细胞组合物。
122.特别地，所述免疫相关疾病选自由自身免疫疾病、特应性皮炎、过敏症、类风湿性关节炎和关节炎组成的组；并且所述炎性过程选自由退行性关节病、骨关节炎、发热、肺哮喘和肌腱炎组成的组。
123.在本发明的特别优选的实施方式中，细胞组合物用于如上所列的治疗，其中每次治疗施用105至107个所述分离的msc，其中所述施用优选通过静脉内、关节内、肌内、病灶内、动脉内、局部结膜下注射或区域灌注进行。
124.通过以下进一步说明本发明的非限制性实施例进一步描述本发明，所述非限制性实施例并非旨在且其也不应被解读为限制本发明的范围。
125.实施例
126.假定本发明不限于先前描述的任何实现形式，并且可以在不重新评估所附权利要求的情况下向所呈现的制造实例添加一些修改。
127.实施例1：通过免疫测定技术elisa对分离的msc的pge2分泌的定量
128.通过从患有慢性肌腱炎症的马收集50ml外周血到含有乙二胺四乙酸(edta)作为抗凝剂的管中来获得马外周血单个核细胞(epbmc)。将edta管离心20分钟，然后将血沉棕黄层收集到无菌的15ml管中。血沉棕黄层用磷酸盐缓冲液、1x pbs稀释两次。随后将溶液用percoll(1.35g/ml)处理并离心15分钟。接下来，收集中间相并通过离心8分钟用1x pbs洗
涤，并重复两次。将沉淀重悬并对细胞计数。计数后，首先标记pbmc，将其接种在96孔板中，并在存在或不存在msc的情况下在含有β
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巯基乙醇的生长培养基中生长。每个烧瓶(t75烧瓶)以与msc的特定比例接种25
×
106个epbmc，其中所述msc和pbmc的比例为1:10。温育96小时后获得来自msc和pbmc的上清液并用于免疫测定。与包含经刺激的pbmc和msc的测试样品并行地评估阳性和阴性对照的pge2分泌的表达。
129.使用酶联免疫吸附测定elisa试剂盒竞争elisa(enzo life sciences，farmingdale，ny，美国)对pge2分泌定量。elisa板用抗马pge2单克隆抗体包被过夜，洗涤，并与样品、测试和对照样品一起温育。再次洗涤板，与抗马pge2生物素标记的单克隆抗体一起温育，洗涤，与亲和素、辣根过氧化物酶温育，再次洗涤，与过氧化物酶底物温育，并在酶标仪上在405nm处读数。
130.如图1所示，由于评估了超过500,000pg/ml细胞的增加，因此在炎性环境中诱导了msc中的pge2分泌。
131.实施例2：通过elisa对msc和pbmc分泌的tgf
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β和il
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6的定量
132.使用竞争性elisa试剂盒(cusabio，美国)对tgf
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β和il
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6分泌定量。竞争性抑制酶免疫测定技术遵循与前面实施例1中描述的pge2竞争性elisa试剂盒相同的原理。
133.监测到msc的tgf
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β和il
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6分泌的增加，以及pbmc中il
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6分泌的增加。图2显示了msc的tgf
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β分泌的增加，其中tgf
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β浓度几乎翻倍。msc和pbmc的il
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6分泌几乎比阴性对照高18倍，如图3所示。
134.实施例3：通过elisa对pbmc的tnf
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α表达的定量
135.使用竞争性elisa试剂盒(invitrogen，美国)测量tnf
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α表达。elisa板用抗马tnf
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α单克隆抗体包被过夜，洗涤，并与样品、测试和对照样品一起温育。再次洗涤板，与抗马pge2生物素标记的单克隆抗体一起温育，洗涤，与链霉亲和素
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辣根过氧化物酶温育，再次洗涤，与过氧化物酶底物温育，并在酶标仪上在405nm处读数。
136.当存在msc时，对pbmc的tnf
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α分泌的减少进行定量。msc的调节作用抑制了pbmc的tnf
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α分泌，经定量减少231pg/ml至77pg/ml，如图4所示。
137.实施例4：通过流式细胞术对msc的免疫表型表征
138.通过流式细胞术评估几种干细胞标志物的表达，以表征msc的免疫表型。在炎性环境中在天然msc和msc上评估了典型排斥蛋白主要组织相容性复合体(mhc)ii类的表达。每个系列使用4x105个细胞，并用一抗小鼠抗马mhc ii类igg1(abd serotec，1:50)标记。将细胞与一抗在冰上在黑暗中温育15分钟，然后在洗涤缓冲液中洗涤两次，洗涤缓冲液由含有1％牛血清白蛋白(bsa)的dmem组成。在冰上在黑暗中温育15分钟后，使用二抗兔抗小鼠fitc(abcam,1:100)抗体鉴定阳性细胞。最后，所有细胞在洗涤缓冲液中洗涤3次，并使用配备488nm固态和633nm hene激光器的荧光激活细胞分选仪(facs)canto流式细胞仪(becton dickinson immunocytometry systems)评估至少103个细胞，这些数据随后用facs diva软件进行分析。所有分析均基于(i)自发荧光和(ii)与同种型特异性igg温育的对照细胞，以建立背景信号。所有同种型都与免疫球蛋白亚型匹配，并以与相应抗体相同的蛋白质浓度使用。
139.天然(数据未显示)msc和炎性环境中的msc(见图5)对mhc ii类分子呈阴性。