一种早期预警重症急性胰腺炎的血清有机酸分子预测模型与应用的制作方法

1.本发明涉及一种早期预警重症急性胰腺炎的血清有机酸分子预测模型与应用，属于生物检测技术领域。


背景技术：

2.急性胰腺炎是一种常见的消化系统急诊，发病急、进展快。其主要病理表现为胰腺腺泡细胞损伤、坏死和全身炎性反应。急性胰腺炎的发病率高达13
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45/10万人，且呈现逐年上升趋势，高额的诊疗费用给患者和社会带来沉重的负担。2012年最新亚特兰大分类根据急性胰腺炎病情严重程度，将急性胰腺炎分为轻症急性胰腺炎(map)、中度重症急性胰腺炎(msap)、重症急性胰腺炎(sap)。其中轻度急性胰腺炎是一种自限性疾病，预后较好，但仍有约20
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30％的患者病情持续进展为重症急性胰腺炎，病死率高达10
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30％。目前主要以早期有效的液体复苏与合理的重症支持的治疗策略。因此，对疾病严重程度的早期预警，选择合理的治疗策略，具有重要的临床意义。
3.根据2012年亚特兰大标准，患者入院后是否出现器官功能衰竭(marshall评分)或局部或全身并发症区分map和sap，根据器官功能衰竭是否超过48h区分msap和sap，这就造成sap的诊断存在48h的等待时间窗。早期阶段主要关注是否出现器官功能损伤/衰竭；可以同时结合dbc、ranson、apache ii、balthazar ct分级、mctsi、crp、床旁严重程度评价指数(bisap)、无害化评分(haps)等严重程度评价指标。但这些评估方法预测疾病严重程度的主要依赖于临床医师的多年临床实践经验积累，主观性强，并且需要收集的参数多，不利于数据更新与临床广泛实践。值得注意的是，胰腺炎早期的治疗显著地影响着预后，然而，现有得评价体系均需要在48小时才能确诊，难以实现对重症急性胰腺炎的早期预警。crp，ptc等指标特异性较差，也仅具有有限的参考价值。因此，寻找新的、和疾病严重程度及进展密切相关的标记物，对重症急性胰腺炎的早期诊断和治疗将具有重大意义。
4.代谢组学是系统生物学的重要分支。它是一门对生物体内在生命过程中存在的代谢物进行表征、鉴定与定量的技术，其科学基础在于代谢表型是生物表型的一种直接体现，某一时空节点下生物体液中代谢物的定性与定量信息能反映生命体当下的生理状态。代谢组学则可以对特定代谢途径以及其中的内源性小分子代谢物进行定量检测。采用特定的样品前处理方法，以及色谱和质谱条件，利用标准品为参照，对物质定性、定量。从而大大提高了检测的灵敏度、特异度和可重复性，确保代谢物浓度信息不丢失，具有高通量、临床可操作性和数据可挖掘性。目前，研究证实，不同循环代谢物的组合作为诊断或预后标志物，在许多疾病中具有良好的应用前景。


技术实现要素：

5.鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种血清有机酸分子检测实现早期预警重症急性胰腺炎的预测模型，旨在解决目前临床尚无有效的急性胰腺炎早期预警预测
模型的问题。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种早期预警重症急性胰腺炎的血清有机酸分子预测模型，所述预测模型为血清有机酸分子的组合物，所述组合物为神经酸和甘油酸，通过检测血清中神经酸与甘油酸的含量变化，在患者患病48h内，区分中重症急性胰腺炎和重症急性胰腺炎。
8.进一步地，上述技术方案中，所述检测血清中神经酸与甘油酸的含量变化为：
9.相较于健康人，重症急性胰腺炎患者血清中神经酸表达上调>2.8倍，甘油酸表达上调>2.1倍；
10.相较于健康人，中重症急性胰腺炎患者血清中神经酸表达上调1.6～2.8倍，甘油酸表达上调0.8～2.1倍。
11.进一步地，上述技术方案中，检测血清中神经酸与甘油酸的含量变化的方法为液相色谱
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质谱联用法。
12.一种早期预警重症急性胰腺炎的血清有机酸分子预测模型的应用，用于48h内区分中重症急性胰腺炎和重症急性胰腺炎。
13.进一步地，上述技术方案中，应用方法包括：
14.采集患者血清，采用液质联用代谢组学分析技术，检测血清中神经酸与甘油酸的含量变化，如果正常情况下相比，神经酸表达上调>2.8倍，甘油酸表达上调>2.1倍，则可早期预警重症急性胰腺炎。
15.发明有益效果
16.本发明上述血清有机酸分子的重症急性胰腺炎预测模型，该急性胰腺炎严重程度预测模型对重症急性胰腺炎的诊断灵敏度92.30％，特异性84.70％，假阳性率15.30％，假阴性率7.70％，实现对重症急性胰腺炎的早期预警。
17.根据2012年亚特兰大标准，对于中重度急性胰腺炎和重度急性胰腺炎的区分存在48h的等待时间窗：即ap患者伴有器官衰竭，48h内恢复即为中重度，48h内未恢复即为重度。而本发明通过检测nervonic acid与glyceric acid的血清含量能够对具有重症转化风险的患者早期预警，选择合适的治疗策略，具有重要的临床意义。
附图说明
18.图1为nervonic acid的色谱图(a)和质谱图(b)。
19.图2为glyceric acid的色谱图(a)和质谱图(b)。
20.图3为nervonic acid在不同组中丰度变化。
21.图4为glyceric acid在不同组中丰度变化。
22.图5为nervonic acid和glyceric acid区分msap和sap的roc曲线分析。
具体实施方式
23.下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
24.实施例1
25.本发明提供一种早期预警重症急性胰腺炎的血清有机酸分子预测模型与应用，为
使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
26.本发明提供一种血清有机酸分子的重症急性胰腺炎检测试剂盒，其中，所述预测重症急性胰腺炎的生物标记物为nervonic acid(神经酸)与glyceric acid(甘油酸)。
27.重症急性胰腺炎预测模型中包括的2种有机酸分子代谢小分子—nervonic acid和glyceric acid。nervonic acid表达上调，而glyceric acid表达上调，两种分子作为标志物具有协同效应。
28.换句话说，本发明确定了一种血清有机酸分子的重症急性胰腺炎的预测模型，预测急性胰腺炎的生物标记物为2种血清有机酸分子的组合。对血清有机酸分子nervonic acid和glyceric acid进行检测，其对重症急性胰腺炎的诊断灵敏度83.3％，特异性89.5％，auc 0.915，能准确地反映急性胰腺炎病理发展状况及疾病严重程度，实现对重症急性胰腺炎的48h早期预警。
29.本发明通过液质联用代谢组学分析技术，检测血清中是否存在如上所述的组成重症急性胰腺炎预测模型的2种有机酸分子成员。本发明将上述表达差异血清有机酸分子中的组合作为重症急性胰腺炎的预测模型，用于预测疾病严重程度，可极大提高重症急性胰腺炎的诊断特异性和准确性。本发明中血清的采集快速简单，与急性胰腺炎的影像学检测方法如ct、mri检测相比，对患者无毒副作用，且具有定量检测的效果。
30.本发明检测急性胰腺炎血清中有机酸分子的表达量变化情况，与目前临床使用的量表检测及影像学诊断相比，人为主观性降低，更为准确，而且具有定量检测的效果。
31.下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
32.试剂：色谱级甲醇、乙腈、甲酸、氨水购自fisher science(fair lawn，usa)。色谱级碳酸氢铵购自sigma
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aldrich(st.louis,usa)。超纯水采用mili
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q纯净水系统制备(merck kgaa,darmstadt,germany)。
33.实验步骤：
34.1.取50μl血清样本置于96孔板内，加入200μl甲醇/乙腈(1：1，v/v)。
35.2.涡旋震荡5分钟，4℃条件静置10分钟后板式离心机5010g 4℃下离心20分钟。
36.3.上清200μl转移至新96孔板后，置于冷冻干燥仪冻干(约2
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3小时，以冻干为准)
37.4.密封低温保存，用于质谱分析。
38.5.80μl乙腈
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水(1:3，v/v)复溶，涡旋震荡3分钟，4℃条件下5010g离心20分钟。
39.1.取上清液70μl上样检测。
40.采用acquity hss c18色谱柱(waters co.,usa,1.8μm,2.1
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100mm)，以水为流动相a和乙腈/甲醇(1：1，v/v)为流动相b，二者均含有0.4％碳酸氢铵缓冲盐与0.1％氨水。流动相梯度为：10分钟内流动相b梯度从2％线性上升至100％，再用5分钟进行洗柱和平衡。流速、进样量和柱温分别为为0.4ml/min、5μl和50℃。
41.使用加热的电喷雾电离源(esi
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)，各项参数如下：鞘气45arb；辅助气体10arb；加热器温度355℃；毛细管温度320℃；s
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lens rf level 55％。代谢组提取物在全扫描模式(fs)下进行，分辨率为70000fwhm，最大进样时间为200ms，自动增益控制目标(agc)为1
×
106。数据采集使用70～1000m/z的扫描范围。
42.2.结果：
43.将39例轻度,20例中重度急性胰腺炎和19例重症急性胰腺炎患者血清进行ultal3000型超高效液相色谱仪和qexactive高分辨质谱仪(thermo scientific,usa)分析后，发现重症急性胰腺炎组相比于轻度或中重度急性胰腺炎组nervonic acid与glyceric acid表达差异明显，sap组nervonic acid含量较msap组升高1.728倍；同时sap组glyceric acid含量较msap组升高2.651倍。相较于健康人，重症急性胰腺炎患者血清中神经酸表达上调>2.8倍，甘油酸表达上调>2.1倍；相较于健康人，中重症急性胰腺炎患者血清中神经酸表达上调1.6～2.8倍，甘油酸表达上调0.8～2.1倍。利用ssps 19.0统计分析软件通过二元logistic回归分析建立疾病预测模型，并绘制roc曲线，
44.综上所述，本发明提供一种血清有机酸分子的重症急性胰腺炎预测模型，该预测模型对重症急性胰腺炎的诊断灵敏度83.3％，特异性89.5％，auc 0.915。本发明通过非靶向代谢组学分析技术，检测血清中是否存在上述表达差异代谢物，将上述表达差异代谢物中的组合作为急性胰腺炎严重程度预测模型，用于临床诊断和预测疾病严重程度，可极大提高重症急性胰腺炎早期诊断特异性和准确性。本发明中血清的采集快速简单，与急性胰腺炎的影像学检测方法如ct、mri检测相比，对患者无毒副作用，且具有定量检测的效果。本发明检测急性胰腺炎血清有机酸分子的表达量变化情况，与目前临床使用的量表检测及影像学诊断相比，人为主观性降低，相对精准。
45.应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。