一株用于海水养殖尾水脱氮的好氧反硝化细菌及应用的制作方法

1.本发明属于微生物及环境科学技术领域，尤其涉及一株用于海水养殖尾水脱氮的好氧反硝化细菌及应用。


背景技术：

2.近年来，海水养殖业迅猛发展，创造了巨大的社会和经济价值，然而养殖散户为了追求生产速度和降低成本，采用多投入、多产出、以及人为添加各种消毒剂、促生长剂等药物的方式进行养殖，这种粗放的养殖方式饲料利用率低，因而导致养殖废水中的有机物、氮、磷总量相对较高，如果不作处理而直排入海，会导致近海水域环境严重污染，近岸生态系统失衡。上世纪我国海水养殖废水的环境问题未能引起人们的足够重视，国家也未制定相关的法律法规来约束养殖废水的排放，因此海水养殖废水大多是未经处理直接排放的。我国农业部于2007年制订颁布了《海水养殖水排放要求》(sc/t9103
‑
2007)并于当年9月1日起开始实施。根据排放海区的海域使用功能和海水养殖水的特性，该标准将海水养殖水排放要求分为一级和二级。其中对高锰酸盐指数codmn、无机氮以及活性磷酸盐的一级排放标准为不高于10、0.50、0.05mg/l，二级标准不高于20、1.00和0.10mg/l。
3.与工业废水和生活污水相比，海水养殖废水的水质和水量具有不同的特点，首先其排放量很大但是污染物含量较低，如无机氮含量一般只有3
‑
5mg/l，cod含量在20
‑
40mg/l，比工业废水和生活废水的都低。同时，它的溶解氧含量非常高，甚至接近饱和状态，加上海水养殖废水中污染物结构的特殊性，以及海水的盐度效应和离子强度效应，导致其处理难度和复杂度都大大增加。
4.基于硝化反硝化的生物脱氮技术是一种经济高效的污水处理技术，但是，由于海水中溶解氧和盐度较高，普通的反硝化菌不能胜任。完整的反硝化过程是硝氮经过亚硝氮，一氧化氮，氧化亚氮(n2o)最终被还原为氮气的过程。而n2o是世界三大温室气体之一，因此优异高效的好氧反硝化菌株应不仅具有快速还原硝酸盐的能力，而且应该具有n2o积累量少，或n2o还原能力强的特性。这样其不仅能够强化降解废水中的氮污染，同时也降低了温室气体的排放，发挥真正的高效环保、经济高效的特点。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于提供一株好氧反硝化细菌，该好氧反硝化细菌cf1
‑
6于2021年08月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23103，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类学命名为人布鲁氏菌(brucella anthropi)。
6.该菌株cf1
‑
6通过16s rrna序列(seq id no.1)经过对比分析，与brucella anthropi x7的16s rrna序列的同源性为99.92％，更进一步地结合菌株形态特征和生长条件确定本发明的菌株cf1
‑
6属于brucella anthropi菌种。
7.本发明的目的之二在于提供上述好氧反硝化细菌在含盐条件下反硝化脱氮中的
应用。
8.优选地，所述含盐条件为氯化钠浓度≤35.0g/l。
9.优选地，所述脱氮的反应条件ph为6
‑
10，总氮浓度≤180mg/l。
10.优选地，所述好氧反硝化细菌的接种量为1
‑
8％(v/v)。
11.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
12.本发明采用微生物培养方法，经富集、分离、纯化、性能鉴定等过程从活性污泥中筛选出一株具有良好反硝化能力的菌株cf1
‑
6，并研究了不同碳源、不同盐度下该菌株的反硝化性能。实验结果表明，该株菌在1％～3％盐度下表现出很强的好氧反硝化能力，可有效的去除氨氮、亚硝态氮和硝态氮，而且只积累少量的n2o气体，在海水养殖尾水的脱氮处理中展现出巨大的应用潜力。
13.生物保藏说明：
14.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
15.保藏编号：cgmcc no.23103；
16.保藏日期：2021年08月02日；
17.保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
18.分类学命名：人布鲁氏菌(brucella anthropi)。
附图说明
19.图1为实施例2中的系统发育树。
20.图2a为实施例3中硝氮的浓度变化图。
21.图2b为实施例3中od600的数值变化图。
22.图2c为实施例3中亚硝氮的浓度变化图。
23.图2d为实施例3中n2o的浓度变化图。
24.图3a为实施例4中od600的数值变化图。
25.图3b为实施例4中硝氮的浓度变化图。
26.图4a为实施例5中od600的数值变化图。
27.图4b为实施例5中n2o的浓度变化图。
具体实施方式
28.实施例1
29.(1)反硝化菌的富集：
30.取1ml海水养殖场污泥置于300ml锥形瓶中，加入100ml lb培养基，补加30g/lnacl，置于30℃、120r/min的摇床中恒温振荡培养24h。其中蛋白胨液体培养基(lb)：胰蛋白胨10g，nacl 5g，酵母浸粉5g，蒸馏水1000ml，ph 7.2～7.4，121℃，灭菌30min。
31.(2)反硝化菌的分离：
32.将富集获得的菌液按照梯度稀释法制成10
‑3，10
‑4，10
‑5、10
‑6菌悬液，各取1ml在补充30g/lnacl的btb固体培养基上平板涂布，置于30℃恒温培养箱中培养，至长出产生蓝色晕圈的菌落。其中btb(溴百里酚蓝)培养基：琼脂20g，kno
3 1.0 g，kh2po
4 1.0 g，fecl2·
6h2o 0.5g，cacl2·
7h2o 0.2g，mgso4·
7h2o 1.0g，琥珀酸钠8.5g，btb(1％溶于酒精)l ml，
蒸馏水1000ml，ph 7.2，121℃，灭菌30min。
33.(3)反硝化菌的纯化：
34.在固体培养基上对菌株进行多次划线、分离及纯化，直至在显微镜下看不到杂菌为止，获得单菌落。将分离获得的单菌落转移至斜面培养基中保存备用。
35.(4)反硝化菌的筛选：
36.用接种环挑取斜面保存的单菌落接种于100ml高盐反硝化培养基中，在30℃、120r/min的摇床中恒温振荡培养，每隔6
‑
10h检测培养液中硝态氮、亚硝态氮和氨氮的含量，选取出脱氮效率最高的菌株cf1
‑
6。
37.实施例2
38.将菌株cf1
‑
6的16srrna序列提交至ncbi数据库进行比对，下载相似性较高的代表性序列进行比对，构建系统进化树，结果如图1所示，从而确定菌株的系统发育地位及种属。由图1可知，菌株cf1
‑
6属于brucella anthropi。
39.实施例3
40.菌株cf1
‑
6的反硝化能力测试试验：
41.(1)菌种活化。
42.配制菌种活化培养基，培养基配方：3.42g/l无水乙酸钠，0.38g/l nh4cl，1.6g/l k2hpo4，0.1g/l mgso4·
7h2o，0.02g/l cacl2，0.005g/l feso4·
7h2o，0.1ml/l微量元素母液。
43.微量元素母液配方为每升水中：3.5g edta，2.0g znso4·
7h2o，1.0g cuso4·
5h2o，2.0g mnso4·
7h2o，0.9g co(no3)2·
6h2o，1.0g h3bo3，1.0g na2moo4。
44.(2)高盐反硝化测试培养基。
45.高盐反硝化测试培养基配方：3.42g/l无水乙酸钠，0.6g/l nano3，1.6g/l k2hpo4，0.1g/l mgso4·
7h2o，0.02g/l cacl2，0.005g/lfeso4·
7h2o，30g/lnacl，0.1ml/l微量元素母液，ph值7.2；其中微量元素母液配方为每升水中：3.5g edta，2.0g znso4·
7h2o，1.0gcuso4·
5h2o，2.0g mnso4·
7h2o，0.9g co(no3)2·
6h2o，1.0g h3bo3，1.0g na2moo4。
46.将菌株培养至对数生长后期，收集10ml细菌悬浊液，无菌水洗涤重悬后接种到装有50ml高盐反硝化测试培养基的300ml密闭厌氧瓶中。
47.(3)反硝化性能测试。
48.用不透气橡胶塞将厌氧瓶封口，然后在30℃和150rpm条件下震荡培养，每隔6
‑
12小时用注射器抽取5ml菌悬液，测定od600，离心后取上清液测定氨氮、亚硝氮和硝氮浓度，同时抽取100μl上部空间气体进行n2o浓度测定，测定其好氧反硝化能力以及n2o产生量。
49.试验结果：菌株cf1
‑
6在模拟养殖废水的脱氮情况如图2a
‑
2d所示，由图2a
‑
2d可知，菌株生长状况良好，且能很好的发挥好氧反硝化作用，在初始硝氮浓度为176.45mg/l的条件下，70h时间去除了92.70％的硝氮，亚硝氮随着硝氮的降低而积累，在达到最高的162mg/l时逐渐降低，而n2o在该过程中一直升高，在硝氮和亚硝氮接近全部消耗完全时达到最高，但最高只有150ppm，占初始硝氮的比例可以忽略不计。
50.图2a对应的原始数据如表1所示：
51.表1
52.取样时间(h)0102235465970
硝氮浓度(mg/l)176.45176.26150.1166.3626.2720.3412.88
53.图2b对应的原始数据如表2所示：
54.表2
55.取样时间(h)0102235465970od6000.0870.1350.1620.2440.2790.3150.313
56.图2c对应的原始数据如表3所示：
57.表3
58.取样时间(h)0102235465970亚硝氮浓度(mg/l)0.0020.0060.17272.200162.00058.2005.200
59.图2d对应的原始数据如表4所示：
60.表4
61.取样时间(h)0102235465970n2o浓度(ppm)1.2519.3954.4893.00117.82158.8013.18
62.实施例4
63.菌株cf1
‑
6的耐盐性能测试：
64.分别配制氯化钠盐度梯度为0％，1％，2％，3％，4％(即0、10、20、30、40g/l)的高盐反硝化测试培养基50ml(除氯化钠浓度不同外，其余组分与实施例3中的高盐反硝化测试培养基配方相同)，装于不透气橡胶塞封口的300ml密闭厌氧瓶中。收集细菌cf1
‑
6培养至对数生长后期的菌株培养液10ml，无菌水洗涤重悬后接种到厌氧瓶中，在30℃和150rpm条件下震荡培养，每隔6
‑
12小时用注射器抽取5ml菌悬液，测定od600，离心后取上清液测定氨氮、亚硝氮和硝氮浓度。
65.试验结果：菌株cf1
‑
6在不同盐度下的生长状况和脱氮情况如图3a
‑
3b所示，可以看出，在0％，1％，2％，3％盐度下，菌株生长状况良好，20h后od600分别达到0.21至0.27之间，硝氮去除率均在89.35％以上，其中在1％盐浓度下，细菌生长速率最快，脱氮效果最好，在4％盐度下，菌株生长受到抑制。考虑到海水养殖尾水的盐度一般在3％附近，可以推测菌株cf1
‑
6可在海水养殖尾水处理中发挥出良好的脱氮性能。
66.图3a对应的原始数据如表5所示：
67.表5
[0068] 0％1％2％3％4％00.0170.0060.0050.0190.011100.0290.0380.0120.0150.008160.0830.1990.0610.0500.005220.1570.2500.1690.0940.004370.2060.2500.1820.2000.003460.2430.2560.2380.1790600.2270.2520.2160.1760720.2240.2450.2310.1930.018
[0069]
图3b对应的原始数据如表6所示：
[0070]
表6
[0071][0072]
实施例5
[0073]
菌株cf1
‑
6对n2o的还原性能试验：
[0074]
配制以n2o作氮源的高盐反硝化培养基(与实施例3中的高盐反硝化测试培养基配方相比，去除了0.6g/lnano3，其余组分相同)50ml，装于不透气橡胶塞封口的300ml密闭厌氧瓶中，收集细菌cf1
‑
6培养至对数生长后期的菌株培养液10ml，无菌水洗涤重悬后接种到厌氧瓶中，在30℃和150rpm条件下震荡培养，每隔6
‑
12小时用注射器抽取5ml菌悬液，测定od600，同时抽取100μl上部空间气体进行n2o浓度测定。
[0075]
试验结果：通入n2o气体，使其初始浓度达到1312.69ppm，测试了菌株cf1
‑
6在好氧条件下对n2o的还原作用，结果如图4a和4b所示，由图4a和4b可知，菌株cf1
‑
6可在72h时间内去除99.13％的n2o，展现出良好的n2o还原能力，对海水养殖尾水处理过程中温室气体的减排具有重要应用意义。
[0076]
图4a对应的原始数据如表7所示：
[0077]
表7
[0078]
时间(h)010223546597083od6000.0800.1430.1910.3660.4310.4840.4690.442
[0079]
图4b对应的原始数据如表8所示：
[0080]
表8
[0081]
取样时间(h)010223546597083n2o浓度(ppm)1312.701225.801166.10886.16590.41154.5929.0911.48
[0082]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。