基于表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体及其制备方法与流程

1.本发明涉及纳米生物技术与生物医药领域，具体涉及一种基于表面毛刺结构纳米粒子的非病毒型基因递送载体及其制备方法。


背景技术：

2.近年来，以sirna为基础的rna干扰术得到了广泛的关注，被认为是能够特异性阻断疾病相关分子表达的有效方法，具有重要的研究和应用价值，已有若干sirna药物获批上市，在临床治疗中发挥重大作用。同时，mrna在疫苗领域的使用，更是将基于rna的药物在临床中的应用推向新的高峰，基于mrna的新冠疫苗对全球新冠疫情的防控气到至关重要的作用。因此，以rna干扰和mrna治疗为代表的rna相关生物工程技术在基础医学研究和转化医学研究中都已经得到了广泛的应用，具有重要的临床应用意义。
3.与基于dna的基因疗法相反，rna作为药物不需要转运到细胞核中，而是直接在细胞质发挥作用，无发生dna重组的风险，具有更高的生物安全性。然而rna容易降解且较难进入细胞，因此，通常需要递送工具将rna递送到细胞质中。常用的方法包括病毒感染法、高水压注射法和纳米粒子递送法等。病毒感染法存在生物安全隐患和伦理问题，高压水注射法对机体造成的直接损伤较大，因此纳米粒子递送法是当前核酸治疗领域的主流技术。其中，以脂质为基础的制剂(如lnp)是最常用的核酸载体，这种载体主要是基于“油包水”或“水包油”原理的脂质纳米颗粒(lnp)，在制备工艺和常温运输等环节对技术要求高，限制了它的推广使用。此外，实验室使用科研试剂的代表包括但不限于lipofectamine3000，然而其价格较昂贵，适用细胞系范围有限，并且具有一定的细胞毒性。因此，将rna疗法应用于临床最大的障碍是缺乏有效的和特异的核酸载体将其导入到细胞中，并在细胞内释放出效用分子，实现其预期功能。如何制备新型的rna递送载体是一个值得研究的问题。因此，本领域尚需研发新型的低成本非病毒型基因载体，能够有效递送rna到多种不同类型细胞和组织中，满足多种用途。
4.最近，具有仿生结构的材料引起了人们广泛的关注，例如表面具有毛刺状结构的类花粉状或类海胆状的纳米材料等。这些新型纳米材料往往具有较高的比表面积，较高的细胞摄入效率，在药物导入、基因递送等方面能负载更多的目标药物或基因，同时对负载的药物或基因分子具有一定的保护能力。二氧化硅颗粒材料由于具有较高比表面积、易于调控的形貌、良好的生物相容性等优点被广泛应用于药物递送、基因递送和生物成像等生物医学工程研究中。研究报道了具有仿生毛刺状结构的二氧化硅纳米球，这些新型的二氧化硅纳米材料除了拥有较强的化学稳定性，较强的细胞摄入，能够保护负载在其中的活性组分(如sirna分子等)免受体内环境的破坏，还具有活性组分缓释的功能。然而，如何精确调控纳米粒子表面毛刺结构的特征具有较大困难。
5.公开号cn108138118a，sqz生物技术公司公开了将化合物递送到细胞中的装置，利用细胞穿过带有孔的表面时，细胞变形引起的细胞扰动，从而使化合物进入细胞。该种装置无法适用于基因分子，尤其是对rna分子缺乏有效保护，另外，无法对原位细胞递送起作用。
6.公开号cn105367781b，刘上峰等研发了一种新型阳离子聚合物纳米材料作为基因载体。该专利以聚乙二醇为核芯，通过共价连接多种氨基酸单体或赖氨酸聚合物形成复合物，用于rna基因或dna基因递送。但该专利中的基因载体制备工艺较复杂，制造成本较高。
7.公开号cn108339117a，张瑜娟等发明了在红外激光照射下产生光热效应的棒状、球状等金属或非金属材料作为sirna基因的递送工具，并联接叶酸作为靶向分子，提高在肿瘤细胞中的靶向性。但该基因载体成本较高，其对原代细胞和多种培养细胞系中的递送效果未见报道，尚不清楚其能否作为广泛应用的基因递送工具。
8.公开号cn108743521a，李雪梅等利用dna自组装单链、成环dna模板和靶向适配体等制备rna纳米水凝胶，用于靶向肺癌细胞组织，治疗肺癌。水凝胶中包含发挥基因调控作用的microrna，可以降低肺癌细胞的迁移能力，从而对肺癌细胞能够进行有效的抑制。但该水凝胶的制备与目标基因相关，无法作为具有广泛使用性能的基因递送载体。
9.公开号cn103212708b的专利公开了一种具有中空海胆状结构的金与铜氧化物复合的纳米材料。发明人在制备过程中利用氯化铜、氢氧化钠、抗坏血酸和氯金酸等为原料经水相合成法制备而成，该制备方法具有产率高和成本低等特点。该发明制备的海胆状材料用于气敏传感器中。
10.公开号cn106430327b的专利公开了一种多孔海胆状fe3o4@c复合材料，该合成方法工艺简单、成本低、反应周期短。所合成的材料分散性能良好、具有比表面积大、吸附性能好等优点。
11.然而，上述的现有材料均存在以下缺陷：(1)现有合成方法及制备体系较难实现对纳米粒子表面毛刺结构长短的控制；(2)现有的制备方法往往用到表面活性剂且较难去除，容易残留，影响后续使用；(3)现有的递送载体通常具有一定的细胞毒性；(4)现有的基因载体材料适用细胞系范围窄，不具有广泛的细胞系基因递送能力；(5)商业lipofectamine3000等基因递送工具价格昂贵；(6)商业lipofectamine3000等基因递送工具无法实现某些特定的实验需求，例如连续持续细胞转染等。


技术实现要素：

12.有鉴于此，本发明提供了一种基于二氧化硅的表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体及其制备方法，以解决现有纳米粒子基因载体存在的表面毛刺结构长短无法控制、需要用到表面活性剂以及带来细胞毒性等缺陷。
13.本发明研发一种无表面活性剂的一步合成方法，用于制备表面具有毛刺结构的纳米粒子作为非病毒型基因递送的载体材料。该材料合成成本低、工艺简单，具有高稳定性、高产量的特点。该方法制备的纳米粒子对以rna(sirna,mrna，grna等)具有高负载能力和强保护防降解能力，同时能够高效的递送基因分子进入细胞，并在细胞质中高效释放，发挥作用。
14.本发明通过无表面活性剂法制备的仿生病毒结构的纳米粒子作为非病毒型基因递送载体，具有针对各种rna和dna的广谱递送能力，在原代细胞、常用细胞系和肿瘤组织中均有显著的基因递送效果，同时在基因递送过程中表现出低细胞毒性。
15.第一方面，本发明提供了一种基于表面毛刺结构非病毒型载体材料纳米粒子的基因递送载体的制备方法，包括以下步骤：
16.提供反应溶液体系、反应催化剂、聚合物前驱体、二氧化硅前驱体以及调节剂，向反应溶液体系中添加反应催化剂、调节剂以及二氧化硅前驱体，搅拌均匀并反应特定时间长度，再向其中添加聚合物前驱体搅拌均匀并反应特定时间长度，离心收集沉淀并干燥、焙烧，制得基于表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体；
17.所述反应溶液体系由乙醇、乙二醇、丙三醇、丁醇等一元醇与多元醇物质和去离子水组成，所述聚合物前驱体包含酚类和醛类，所述二氧化硅前驱体为硅烷偶联剂，所述调节剂为带正电的化合物。
18.该方法中，反应溶液体系中添加反应催化剂、调节剂以及二氧化硅前驱体搅拌均匀后，反应0
‑
600分钟，优先的，反应0
‑
300分钟，进一步优选，反应时间为0
‑
100分钟。接着，向其中添加聚合物前驱体搅拌均匀，反应5分钟以上，优先的，反应100分钟，进一步优选，反应时间为300分钟。
19.本发明基于表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体的制备方法的原理如下：在反应溶液体系下，根据反应的需要，先向反应溶液体系中加入二氧化硅前驱体材料，该前驱体材料在催化剂及醇水溶液中发生水解聚合反应，形成二氧化硅一级纳米粒子，之后加入酚类及醛类物质，酚类与醛类物质在催化剂作用下发生聚合反应生成酚醛树脂，二氧化硅一级纳米粒子和醛树脂共同竞争沉积，形成复合载体材料。反应后，通过离心等方式得到固体产物，再经过焙烧去除聚合物等物质，得到表面具有毛刺结构的二氧化硅纳米粒子。反应中通过控制原材料的加入量和两种聚合体系的加入时间间隔，调控反应过程中二氧化硅纳米粒子的聚合方式，控制其结构。最终实现通过该无表面活性剂法以及调控反应原料的加入方式制备具有表面毛刺结构且毛刺长度可调控的二氧化硅纳米粒子。将该纳米材料作为非病毒型基因载体材料，从而实现rna或dna分子的高效递送、细胞内释放与发挥特异性药理作用。
20.本发明基于表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体的制备方法采用无表面活性剂的一步合成方法，用于制备表面具有毛刺结构的二氧化硅纳米粒子，通过调节反应条件，实现纳米粒子表面毛刺长度的精准调控。本发明通过无表面活性剂法及调节特定的反应条件实现二氧化硅纳米粒子的尺寸的调控、孔道的调控和表面毛刺的调控，并最终实现rna或dna分子的高效递送。
21.所述反应溶液体系由乙醇、乙二醇、丙三醇、丁醇等一元醇与多元醇物质和去离子水组成，所述聚合物前驱体包含酚类和醛类，所述二氧化硅前驱体为硅烷偶联剂，所述调节剂为带正电的化合物。
22.优选的，所述反应催化剂为氨水、盐酸、磷酸、硫酸、苯磺酸、氢氧化钠、氢氧化钾、偏铝酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的一种或几种。
23.优选的，所述酚类为苯酚、二甲酚、氨基苯酚、壬基酚、双酚a、双酚f、腰果酚、间苯二酚等酚类物质的一种或几种。
24.优选的，所述的醛类为甲醛、乙醛、水杨醛、聚甲醛、糠醛等醛类物质中的一种或几种。
25.优选的，所述酚类与醛类的质量之比为100:1～1:100。进一步优选的，所述酚类与醛类的质量之比为10:1～1:10。
26.优选的，所述二氧化硅前驱体为硅酸钠、甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯、正硅
酸四甲酯、丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三甲氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷、异氰基丙基三甲氧基硅烷、双三甲氧基硅基乙烷、异氰丙基三乙氧基硅烷、苯基三甲氧基硅烷、二苯基二甲氧基硅烷和三氨丙基三乙氧基硅烷中的至少一种。
27.优选的，所述调节剂为甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、戊胺、巯基乙胺、乙二胺、二乙胺、三乙胺、甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺、丁酰胺、异丁酰胺、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、己内酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二苯胺、联苯胺、邻苯二胺、间苯二胺、对苯二胺、邻甲基苯胺、苯胺、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、四乙基氢氧化钠、四甲基氢氧化钠、四丙基氢氧化铵等物质中的一种或几种。
28.优选的，所述纳米粒子尺寸为10
‑
1000nm，刺的长度为1
‑
1000nm。进一步优选的，所述纳米粒子尺寸为50
‑
200nm，刺的长度为10
‑
100nm。
29.优选的，所述的表面修饰官能团为氨基、胺基、磺酸基、氰基、酯基醛基、巯基、羧基、苯氨基、酰胺基等官能团中的一种或几种。
30.第二方面，本发明还提供了一种基于表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体，采用第一方面所述的基于表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体的制备方法制得。
31.本发明基于表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体采用生物相容性较高的合成材料制备，细胞毒性低，不含有表面活性剂残留，也能高效控制纳米粒子表面毛刺长度。
32.本发明制备的非病毒型基因载体需要通过与带氨基的硅烷偶联剂(如三氨丙基三乙氧基硅烷)等化合物进行偶联，或是聚醚酰亚胺等聚合物进行修饰，使其表面带有氨基和正电性。第三方面，本发明还提供了基于表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体的使用方法。
33.本发明制备的非病毒型基因载体可通过与带羧基、酰胺基、异硫氰基和琥珀酰胺酯等化合物的偶联剂，与未修饰的rna或dna分子、修饰后的rna或dna分子结合。
34.优选的，所述的基因的表现形式为dna或rna，包括线性dna、共价闭合环状dna、开环dna、核酸适配体(aptamer)、小干扰rna(sirna)、信使rna(mrna)、短发夹rna(shrna)、微小rna(mirna)、长链非编码rna(lncrna)和小向导rna(sgrna)等天然的、人工合成的和化学修饰的各种rna，还包括线性、环状和带有特定高级结构的rna。
35.所述的rna形式包括以单体和多聚体形式出现的rna，包括天然的、人工合成的和化学修饰的各种rna，也包括单链、双链和部分双链rna，还包括线性、环状和带有特定高级结构的rna。其使用范围包括向细胞、组织、器官和生命体整体的递送。该非病毒型基因载体适用的细胞范围包括多种培养细胞，例如a549、hela、hct116等，同时也适用于原代细胞，例如原代巨噬细胞(bmdm)和原代小鼠胚胎成纤维细胞(mef)等。
36.所述的细胞、组织、器官和生命体包括来源于人体、动物和植物，及上述来源的细胞、组织和器官。
37.本发明制备的非病毒型基因载体在使用过程中，按特定浓度使用包括但不限于超声等物理方式，分散到磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液等中，加入计量的目标rna或dna分子等制备成混合溶液即可加入到待转染细胞中使用。
38.本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
39.为更清楚地阐述本发明的内容，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。
40.图1.本发明方法制备的非病毒型基因载体的制备机理图。
41.图2.本发明方法制备的非病毒型基因载体在多种不同细胞系中递送rna的效率。
42.图3.本发明方法制备的非病毒型基因载体具有低细胞毒性。
43.图4.本发明方法制备的非病毒型基因载体对rna具有保护作用，显著提高sirna的半衰期。
44.图5.本发明制备的非病毒型基因载体持续转染sirna基因实现目标基因连续敲除。
45.图6.本发明制备的非病毒型基因载体在荷瘤小鼠模型中实现目标基因的组织递送。
46.图7.本发明制备的非病毒型基因载体于小鼠体内实现大、对靶标基因靶向敲低。
具体实施方式
47.以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
48.第一方面，本发明提供了一种基于表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体的制备方法，包括以下步骤：
49.提供反应溶液体系、反应催化剂、聚合物前驱体、二氧化硅前驱体以及调节剂，向反应溶液体系中添加反应催化剂、调节剂以及二氧化硅前驱体搅拌均匀，再向其中添加聚合物前驱体搅拌均匀并反应5分钟以上，离心收集沉淀并干燥、焙烧，制得基于表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体；
50.所述反应溶液体系由乙醇、乙二醇、丙三醇、丁醇等一元醇与多元醇物质和去离子水组成，所述聚合物前驱体包含酚类和醛类，所述二氧化硅前驱体为硅烷偶联剂，所述调节剂为带正电的化合物。
51.所述反应催化剂为氨水、盐酸、磷酸、硫酸、苯磺酸、氢氧化钠、氢氧化钾、偏铝酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的一种或几种。
52.所述酚类为苯酚、二甲酚、氨基苯酚、壬基酚、双酚a、双酚f、腰果酚、间苯二酚等酚类物质的一种或几种。
53.所述的醛类为甲醛、乙醛、水杨醛、聚甲醛、糠醛等醛类物质中的一种或几种。
54.所述酚类与醛类的质量之比为100:1～1:100。进一步优选的，所述酚类与醛类的质量之比为10:1～1:10。
55.所述二氧化硅前驱体为硅酸钠、甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯、正硅酸四甲酯、丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三甲氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷、异氰基丙基三甲氧基硅烷、双三甲氧基硅基乙烷、异氰丙基三乙氧基硅烷、苯基三甲氧基硅烷、二苯基二甲氧基硅烷和三氨丙基三乙氧基硅烷中的至少一种。
56.所述调节剂为甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、戊胺、巯基乙胺、乙二胺、二乙胺、三
乙胺、甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺、丁酰胺、异丁酰胺、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、己内酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二苯胺、联苯胺、邻苯二胺、间苯二胺、对苯二胺、邻甲基苯胺、苯胺、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、四乙基氢氧化钠、四甲基氢氧化钠、四丙基氢氧化铵等物质中的一种或几种。
57.所述纳米粒子尺寸为10
‑
1000nm，刺的长度为1
‑
1000nm。进一步优选的，所述纳米粒子尺寸为50
‑
200nm，刺的长度为10
‑
100nm。
58.所述的表面修饰官能团为氨基、胺基、磺酸基、氰基、酯基醛基、巯基、羧基、苯氨基、酰胺基等官能团中的一种或几种。
59.第二方面，本发明还提供了一种基于表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体，采用第一方面所述的基于表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体的制备方法制得。
60.如图1所示，为基于表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体的制备方法的反应原理：本发明方法制备的具有表面毛刺结构的二氧化硅纳米粒子，通过二氧化硅前驱体和聚合物前驱体等的聚合而形成，通过延缓加入聚合物前驱体的方式，控制反应中间体中二氧化硅毛刺结构的长度，最终实现对毛刺制备长度的精准调控。
61.实施例1
62.一种基于可控表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体的制备方法，包括以下步骤：
63.提供质量分数为25％的乙醇水溶液100g、乙胺500mg、苯酚1g、甲醛2g、正硅酸四乙酯5g、氢氧化钠3g。在60℃条件下搅拌均匀，搅拌转速为500rpm。向乙醇水溶液中添加氢氧化钠、正硅酸四乙酯和乙胺。再向其中添加苯酚和甲醛，继续搅拌反应300min，搅拌转速为500rpm。反应结束后采用8000rpm转速离心10min，再将沉淀干燥并采用500℃焙烧300min，制得基于可控表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体，标注为ssn
‑
1，如图1所示。
64.实施例2
65.实施例2与实施例1的区别在于：向乙醇水溶液中添加氨水、正硅酸四乙酯和乙胺，反应5min后，再向其中添加苯酚和甲醛，所得基于可控表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体标注为ssn
‑
2。
66.实施例3
67.实施例3与实施例1的区别在于：向乙醇水溶液中添加氢氧化钠、正硅酸四乙酯和乙胺，反应10min后，再向其中添加酚类和甲醛，所得基于可控表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体标注为ssn
‑
3。
68.实施例4
69.实施例4与实施例1的区别在于：向乙醇水溶液中添加氨水、正硅酸四乙酯和十六烷基三甲基溴化铵胺，反应20min后，再向其中添加间苯二酚和甲醛，所得基于可控表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体标注为ssn
‑
4。
70.实施例5
71.实施例5与实施例1的区别在于：反应溶液的温度变为40℃，制备得到的基因递送载体表面毛刺长度较ssn
‑
1短。
72.实施例6
73.实施例6与实施例2的区别在于：反应溶液的温度变为40℃，制备所得表面毛刺结
构纳米粒子基因递送载体的毛刺长度较ssn
‑
2短。
74.技术效果分析1
75.对实施例1
‑
4制备的基于可控表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体的效率进行检测。采用fam
‑
sirna进行测试，其中lipo3000为商业lipofectamine3000基因递送工具，ssn
‑
1、ssn
‑
2、ssn
‑
3和ssn
‑
4分别为实施例1
‑
4制备的基于可控表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体。测试结果如图2所示，ssn
‑
1、ssn
‑
2、ssn
‑
3和ssn
‑
4对应的基于可控表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体能够实现对sirna(以fam
‑
sirna为例)的递送，释放与表达，并表现出与商用sirna递送试剂相似或更好的效果(图2a，所用细胞系为hek 293t)。同时该表面毛刺纳米粒子对多种细胞系都具有很好的sirna基因递送和转染效果(图2b)，这些细胞系包括常见的培养细胞系，例如hela、a549、hct116等，也包括原代细胞系，例如原代巨噬细胞(bmdm)和小鼠胚胎成纤维细胞(mef)等。
76.技术效果分析2
77.对实施例2制备的基于可控表面毛刺结构纳米材料的基因递送载体ssn
‑
2进行细胞毒测验，分别对293t进行细胞毒实验，将终浓度设为0、50、100、200、400、800、1000μg/ml。测试结果如图3所示，在分别给药48h和72h后，ssn
‑
2对应的基于可控表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体细胞毒较小，高浓度下细胞活力无显著降低。
78.技术效果分析3
79.对实施例2制备的基于可控表面毛刺结构纳米材料的基因递送载体检验不同时间在血浆中的释放情况和保护能力，将200μg ssn
‑
2与0.08nmol的sirna混合血浆孵育后，跑rna核酸电泳。测试结果如图4所示，在血浆中孵育2、4、6、12小时，ssn
‑
2对sirna有明显的保护作用，在血浆中损失释放的sirna较少。
80.技术效果分析4
81.对实施例2制备的基于可控表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体持续转染sirna基因实现目标基因连续敲除。由图5可知，本发明制备的非病毒型载体材料能够实现对所用细胞中的hnrnpa2b1目标基因和sting目标基因的连续敲除，同时连续敲除的时间能持续到192h。而商用的lipofectamine3000(lipo3000)只能连续递送sirna小于48h，同时具有很强的细胞毒性。
82.技术效果分析5
83.对实施例2制备的基于可控表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体进行fam
‑
sirna体内黑色素瘤递送测试。瘤内注射后，冷冻切片，采用荧光显微镜进行观察，结果如图6所示，sirna能够保留在瘤体中，并实现瘤内递送。
84.技术效果分析6
85.对实施例2制备的基于可控表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体体内组织靶向敲除研究。通过尾静脉注射sting sirna和ssn
‑
2的混合物，通过实时荧光pcr对基因敲除效果进行评级，结果如图7所示，ssn
‑
2可以特异性靶向血细胞和肝组织细胞。
86.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。