跨膜丝氨酸蛋白酶2抑制剂在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中的用途的制作方法

1.本发明涉及药物用途，特别涉及跨膜丝氨酸蛋白酶2抑制剂在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中的用途。


背景技术：

2.耐药病毒和新病毒的出现凸显了对新型抗病毒方法和药物的需求。然而由于病毒容易突变，使得针对病毒自身靶点的药物开发成为难点。因此，靶向宿主因子成为一种相对较新的抗病毒药物开发策略，可以减少或避免逃逸突变体的出现。
3.跨膜丝氨酸蛋白酶2（transmembrane serine proteinase 2，tmprss2）是ⅱ型丝氨酸蛋白酶（ttsps）家族的成员之一。近些年来，众多研究表明tmprss2参与的病毒包膜蛋白水解，成为多种类型病毒进入细胞的共同关键步骤之一。冠状病毒入侵细胞时，tmprss2切割冠状病毒棘突蛋白（spike，s）使其活化，从而促进病毒与细胞膜的融合。tmprss2是介导影响严重急性呼吸综合征冠状病毒（sars
‑
cov）、中东呼吸综合征冠状病毒（mers
‑
cov）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（sars
‑
cov
‑
2）等冠状病毒侵入细胞的重要环节。现有研究表明tmprss2也可结合sars
‑
cov或sars
‑
cov
‑
2的s蛋白与血管紧张素转化酶2（ace2）构成的蛋白复合体，进而切割并活化病毒的s蛋白，协助病毒进入细胞。因此，针对病毒入侵共同靶点tmprss2开发相关抑制剂，抑制其活性，目前被认为是一种关键的病毒感染治疗策略。
4.中药具有中医药理论和大量的临床实践作为支撑，其来源广泛，资源丰富，是新药研发的重要来源之一。针对病毒入侵细胞这一共同靶点tmprss2，在临床有效中药方剂中筛选高效抑制剂具有重要价值，并为开发或制备成药性强、安全性好的药物提供一定基础。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明目的是提供能够抑制跨膜丝氨酸蛋白酶2的化合物在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中用途。
6.技术方案：本发明提供了跨膜丝氨酸蛋白酶2抑制剂在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中的用途，化合物的结构如下：
化合物1
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
或化合物2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
或化合物3。
7.进一步地，化合物1、化合物2、化合物3对tmprss2的半数抑制浓度分别为2.13 mm、1.65 mm和0.39 mm。
8.进一步地，化合物能特异性地与tmprss2结合。所述的化合物可以抑制跨膜丝氨酸蛋白酶2催化水解活性。所述化合物能够抑制病毒入侵靶细胞。
9.所述的抑制剂在制备治疗和/或预防病毒感染药物中的用途。
10.进一步地，所述药物剂型为口服给药剂型或非口服给药剂型。
11.进一步地，所述的口服给药剂型为片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂或糖浆剂。
12.进一步地，所述的非口服给药剂型是注射剂。
13.所述的能够抑制跨膜丝氨酸蛋白酶2的化合物的优选的制备方法，包括如下步骤：（1）取黄芩饮片适量，粉碎，过筛，用乙醇超声提取。超声结束后抽滤，收集滤液，挥干，再溶解于pbs缓冲溶液中制成混悬液。将混悬液离心除去杂质，收集上清液备用；（2）将黄芩样品液与表面展示tmprss2的毕赤酵母溶液混合，室温孵育后离心，弃去上清，再用pbs缓冲液洗涤沉淀，后加入甲醇溶液超声处理，离心收集上清液为待测样品；（3）将黄芩样品液与等量野生型毕赤酵母溶液混合，室温孵育后离心，弃去上清，再用pbs缓冲液洗涤沉淀，后加入甲醇溶液超声处理，离心收集上清液为空白样品；（4）将步骤（2）、（3）获得的待测样品液、空白样品液分别利用高效液相色谱
‑
质谱联用技术检测，分析样品液中浓度显著高于空白滤液中浓度的化合物即为黄芩中的tmprss2亲和成分。
14.由于tmprss2参与的病毒包膜蛋白水解，是多种类型病毒进入细胞的共同关键步骤之一。因此，靶向tmprss2是一种关键的病毒感染治疗策略。发明人从黄芩中发现3种化合物在分子水平上可以抑制tmprss2的催化水解活性。在细胞水平上可以有效地抑制新型冠状病毒sars
‑
cov
‑
2假病毒入侵，所述化合物能直接地与tmprss2结合， kd<13 μm。表明该类化合物对于制备治疗和/或预防病毒感染药物具有非常积极的作用。
15.本发明包括药物组合物，该组合物含有结构式所示化合物或其药学上可接受的盐，或其对应异构体、非对应异构体或外消旋体作为活性成分，以及药学上可接受的赋型剂。所述药学上可接受的赋形剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂或载体。本发明化合物可以与其他活性成分组合使用，只要它们不产生其他的不利作用。
16.有益效果：本发明的化合物能够结合tmprss2，高效抑制其催化水解活性，阻止病毒进入细胞，可用于制备治疗和/或预防病毒感染的药物。
附图说明
17.图1为黄芩药材提取液的hplc图谱；图2为黄芩药材中与tmprss2亲和吸附成分(实线)及非特异性吸附成分(虚线)的hplc图谱；图3为化合物1剂量依赖性抑制tmprss2催化水解活性及半抑制浓度测定结果；图4为化合物2剂量依赖性抑制tmprss2催化水解活性及半抑制浓度测定结果；图5为化合物3剂量依赖性抑制tmprss2催化水解活性及半抑制浓度测定结果；图6为化合物1与tmprss2结合的亲和力测定结果；图7为化合物2与tmprss2结合的亲和力测定结果；图8为化合物3与tmprss2结合的亲和力测定结果；图9为化合物1对过表达ace2受体的293t（293t
‑
ace2）细胞的毒性测定结果；图10为化合物2对293t
‑
ace2 细胞的毒性测定结果；图11为化合物3对293t
‑
ace2 细胞的毒性测定结果；图12为化合物1剂量依赖性抑制sars
‑
cov
‑
2新型冠状病毒假病毒入侵293t
‑
ace2细胞测定结果；
图13为化合物2剂量依赖性抑制sars
‑
cov
‑
2新型冠状病毒假病毒入侵293t
‑
ace2细胞测定结果；图14为化合物3剂量依赖性抑制sars
‑
cov
‑
2新型冠状病毒假病毒入侵293t
‑
ace2细胞测定结果。
具体实施方式
18.实施例1本实施例筛选黄芩中tmprss2抑制剂的方法实验方法：酵母表面展示技术(yeast surface display system，ysd)是一种将外源蛋白质进行固定化表达的真核展示系统，将靶蛋白基因与特定载体蛋白基因融合后，再导入酵母宿主细胞，靶蛋白在载体蛋白的引导下表达并定位于酵母细胞表面，此技术既保持了蛋白相对独立的空间构象，又保留了宿主细胞原有的生物学活性。发明人成功构建并培养了表面展示tmprss2的毕赤酵母，为后续垂钓实验与酶活力测定实验打下基础。
19.（1）取黄芩饮片适量，粉碎，过四号筛，称取粉末2 g，加入200 ml 70%乙醇超声提取30 min。超声结束后抽滤，收集滤液，挥干，溶解于200 ml pbs缓冲溶液中，制成10 mg/ml的混悬液。将混悬液以11000
ꢀ×
g离心10 min，除去杂质，收集上清液备用。经过高效液相色谱分析，黄芩药材提取液的hplc图谱如图1所示。
20.（2）将100 μl黄芩样溶液与100 μl表面展示tmprss2的毕赤酵母溶液混合，室温孵育后3000
ꢀ×
g离心5 min。沉淀用pbs缓冲液洗涤3次，后加入200 μl甲醇超声处理30 min，11000
ꢀ×
g离心10 min，收集上清液为待测样品。
21.（3）将100 μl黄芩样溶液与100 μl野生型毕赤酵母溶液混合，室温孵育后3000
ꢀ×
g离心5 min。沉淀用pbs缓冲液洗涤3次，后加入200 μl甲醇超声处理30 min，11000
ꢀ×
g离心10 min，收集上清液为待测样品。
22.（4）将步骤（2）、（3）获得的待测样品液、空白样品液分别利用高效液相色谱
‑
质谱联用技术检测，分析样品液中浓度显著高于空白滤液中浓度的化合物即为黄芩中tmprss2亲和成分。
23.其中上述步骤（1）（4）所述高效液相分离条件包括：色谱柱规格为agilent c18 ,2.7 μm，3.7 mm
×
250 mm；流动相为0 .1%甲酸水溶液（a）和乙腈（b）；检测波长为254 nm。
24.表1 hplc洗脱梯度时间（min）流动相a（%）流动相b（%）0
‑
2090
‑
7010
‑
3020
‑
4570
‑
3030
‑
7045
‑
5230
‑
570
‑
9552
‑
615
‑
9095
‑
1061
‑
709010实验结果：黄芩药材中与tmprss亲和吸附成分(实线)及非特异性吸附成分(虚线)的hplc图谱如图2所示。峰1、峰2、峰3为样品液中浓度显著高于空白滤液中浓度的物质，即为与跨膜丝氨酸蛋白酶有特异性相互作用的物质。通过hplc
‑
q
‑
tof
‑
ms/ms检测，对比对照品并结合质谱谱图的碎片解析，共鉴定出3个化学成分。结果见表2。
25.表2 质谱鉴定结构
峰号化学式msms/ms鉴别1c
21
h
18
o
11
445.0747269.0444,175.0266黄芩苷2c
22
h
20
o
11
459.0932283.0616,268.0348,175.0208汉黄芩苷3c
15
h
10
o5269.0444225.0527,195.0430,183.0119,151.0527,117.0359黄芩素
实施例2本发明所述化合物抑制tmprss2催化水解活性。
26.实验方法：取表面展示tmprss2的毕赤酵母溶液200 μl，分别加入2 μl 不同浓度的化合物1
‑
3。将混合物放置于旋转培养器室温孵育1小时。避光条件下加入boc
‑
leu
‑
gly
‑
arg
‑
amc （1mm）底物2 μl，再放置于旋转培养器室温避光旋转孵育1小时。以10000
ꢀ×
g离心5 min，避光条件下吸取上清液100 μl于新的离心管中，加入100 μl乙腈终止反应。以10000
ꢀ×
g离心10 min，取上清液作为待测样品。以表1所述高效液相分离条件，分析酶促反应后产物amc的含量。使用graphpad prism 6 .0软件分析原始数据，并计算相对抑制率。测定值是用三次独立实验的平均值
±
平均值的标准误差表示。
27.实验结果：如图3
‑
图5所示，化合物1
‑
3均剂量依赖性抑制tmprss2催化水解活性，半抑制浓度分别2.13 mm、1.65 mm和0.39 mm。本发明所述化合物能够高效抑制tmprss2催化水解活性。
28.实施例3本发明所述化合物与tmprss2直接结合。
29.实验方法：表面等离子共振（spr）实验。spr传感技术利用表面等离子体共振的原理,当光耦合到传感芯片时，由于发生表面等离子体共振，一部分光能量被吸收,使得从传感芯片反射的光形成spr共振信号。spr共振信号对于传感芯片表面样品物质折射率的变化非常敏感,因此就可以通过分析spr共振图而获得样品的物质信息。在检测蛋白
‑
蛋白相互作用等生物传感领域有极其重要的应用。
30.该实验使用biacore t200仪器在25℃下进行测试，流动相为磷酸盐缓冲液（ph7.4）。用10 mmol/l醋酸钠缓冲液（ph值分别为5.5、5.0、4.5及4.0）稀释tmprss2重组蛋白至终浓度为20 μg/ml，采用手动进样法进行ph值筛选,选取偶联值最大的ph值进行后续实验。采用氨基偶联法将tmprss2重组蛋白偶联到cm5芯片上,以磷酸盐缓冲液为工作缓冲液,用上述筛选所得最佳ph值的10 mmol/l醋酸钠缓冲液稀释tmprss2重组蛋白至终浓度为20 μg/ml。芯片表面用0.2 mol/l edc和50 mmol/l nhs以1:1比例配制的混合液活化,以10 μl/min的流速进样,连续进样7 min后注射tmprss2重组蛋白溶液,然后以1 mol/l乙醇胺盐酸(ph 8.5)封闭液进样7 min ,封闭活化的芯片表面，并将封闭的空白通道用作测定的阴性对照。实验选取最高浓度为25 μm的本发明所述化合物作为配体，将配体以两倍连续稀释液注入固定了tmprss2重组蛋白生物传感器芯片上。1：1结合模型用于评估结合动力学。用动力学模型，通过biacore t200分析软件计算kd值。
31.实验结果：如图6、7、8所示，化合物1与tmprss2重组蛋白的亲和力1.70 μm，化合物2与tmprss2重组蛋白的亲和力13.00 μm，化合物3与tmprss2重组蛋白的亲和力0.61 μm。动力学分析数据显示，与化合物1或2相比,虽然化合物3与tmprss2重组蛋白的亲和力略强，但都在一个数量级上，这一结果提示我们本发明所述化合物骨架是其发挥功能的关键结构，
取代基的变化对化合物活性没有明显影响。式ⅰ/ⅱ所示的化合物可能均具有该活性。本发明所述化合物与tmprss2相互作用。
32.实施例4本发明所述化合物抑制sars
‑
cov
‑
2新型冠状病毒s蛋白假病毒入侵过表达ace2受体的293t细胞（293t
‑
ace2）。
33.实验方法： sars
‑
cov
‑
2新型冠状病毒s蛋白假病毒含有荧光素酶报告基因，当病毒入侵细胞后可通过荧光素酶检测试剂评价荧光素酶的活力。其活力可反应病毒入侵细胞的数量。新型冠状病毒s蛋白与ace2受体的结合是病毒入侵细胞的关键步骤，因此选择过表达ace2受体的293t细胞（293t
‑
ace2）模拟病毒入侵，抑制tmprss2水解s蛋白的功能可显著减少病毒入侵靶细胞的数量。
34.首先采用mtt法，检测各个化合物对细胞的活力的影响，是否具有细胞毒性。将293t
‑
ace2细胞均匀铺至孔板中，细胞培养使用含10%胎牛血清的dmem培养基，在37℃、5%co2条件下培养24小时后，将各种化合物添加到每个孔中，再孵育24小时。然后将293t
‑
ace2细胞置于100μl含500 μg/ ml mtt的10％fbs
‑
dmem中。在37℃下孵育4小时后，向每个孔中加入150 μl二甲基亚砜以溶解结晶。使用酶标仪在570 nm处测量吸光度值。随后进行病毒入侵实验，将293t
‑
ace2细胞均匀铺至孔板中，细胞培养使用含10%胎牛血清的dmem培养基，在37℃、5%co2条件下培养，待细胞生长到30%开始进行实验。将相同浓度的sars
‑
cov
‑
2新型冠状病毒s蛋白假病毒与不同浓度待测化合物混合后，在37℃孵育6h，随后加入到每个孔中。孵育6h后更换为新鲜培养基。正常培养48h之后，每孔添加与培养基等体积的荧光素酶检测试剂，振摇10 min使细胞完全裂解。后用酶标仪检测化学发光信号，定量检测荧光素酶的表达量，分析病毒入侵293t
‑
ace2细胞的数量。使用graphpad prism 6 .0软件分析原始数据。组间分析采用单因素方差分析，p<0.05被认为具有统计学意义。测定值是用三次独立实验的平均值
±
平均值的标准误差表示。
35.实验结果：化合物1
‑
3均可以阻止新型冠状病毒s蛋白假病毒进入293t
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ace2细胞。其中，如图9、10、11所示，化合物1
‑
3均在一定浓度范围内对293t
‑
ace2细胞活力没有影响，表明该类化合物安全性良好。图12、13、14显示化合物1
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3均可以剂量依赖性抑制阻止新型冠状病毒s蛋白假病毒进入293t
‑
ace2细胞。这些结果均说明本发明所述化合物可抑制tmprss2并抑制sars
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cov
‑
2新型冠状病毒s蛋白假病毒入侵过表达ace2受体的293t细胞。